Summary
I denna metod presenterar vi biokemiska förfaranden för snabb och effektiv isolering av mellanfilament (IF) proteiner från flera musvävnader. Isolerade IF kan användas för att studera förändringar i posttranslationella modifieringar genom masspektrometri och andra biokemiska analyser.
Abstract
Mellanliggande filament (IF), tillsammans med aktinfilament och mikrotubuli, bildar cytoskeletten - ett kritiskt strukturellt element i varje cell. Normal funktion IFs ger celler med mekanisk och spänningsfasthet, medan en dysfunktionell IF-cytoskelett äventyrar cellulär hälsa och har associerats med många mänskliga sjukdomar. Post-translationella modifieringar (PTM) reglerar IF-dynamiken kritiskt på grund av fysiologiska förändringar och stressförhållanden. Därför kan förmågan att övervaka förändringar i PTM-signaturen av IFs bidra till en bättre funktionell förståelse, och slutligen konditionering, av IF-systemet som en stressrespons under cellulär skada. Emellertid är det stora antalet IF-proteiner, som kodas av över 70 individuella gener och uttryckta på vävnadsberoende sätt, en stor utmaning för att sortera ut den relativa betydelsen av olika PTM. För det ändamålet, metoder som möjliggör övervakning av PTM på IF-proteinerPå en organismövergripande nivå, snarare än för isolerade familjemedlemmar, kan påskynda forskningens framsteg på detta område. Här presenterar vi biokemiska metoder för isolering av den totala, tvättmedelslösliga och tvättmedelsbeständiga fraktionen av IF-proteiner från 9 olika musvävnader (hjärna, hjärta, lung, lever, tunntarmen, tjocktarmen, bukspottkörteln, njuren och mjälte). Vi demonstrerar vidare ett optimerat protokoll för snabb isolering av IF-proteiner genom att använda lyseringsmatris och automatiserad homogenisering av olika musvävnader. Det automatiska protokollet är användbart för profilering av IFs i experiment med hög provvolym (såsom i sjukdomsmodeller som involverar flera djur och experimentella grupper). De resulterande proven kan användas för olika nedströmsanalyser, innefattande masspektrometribaserad PTM-profilering. Genom att använda dessa metoder tillhandahåller vi nya data för att visa att IF-proteiner i olika musvävnader (hjärna och lever) genomgår parallella förändringar med avseende på deras uttryckSionnivåer och PTM under åldrandet.
Introduction
IFs är en familj av proteiner som kodas av människor hos 73 gener och kategoriseras i sex huvudtyper: typerna I-IV är cytoplasmatiska ( t ex epitel- och hårkeratiner (K), myocyt desmin, neurofilament, glialfibrillärt surt protein (GFAP), och andra); Typ V är nukleära laminer; Och typ VI är IF i ögonlinsen 1 . När det gäller deras molekylära organisation har IF-proteiner tre vanliga domäner: en högt konserverad domän med spolad spole "rod" och globala domäner "huvud" och "svans". IF-proteintetramerer monteras för att bilda korta trådprekursorer, vilka slutligen införlivas i mogna filament som bildar dynamiska cytoskeletala och nukleoskeletala strukturer som är involverade i mekaniskt skydd 2 , spänningsavkänning 3 , 4 , reglering av transkription 5 och tillväxt och andra kritiska cellulära funktioner"> 1 , 6 , 7 .
IF-systemets funktionella betydelse framhävs av förekomsten av många mänskliga sjukdomar orsakade av missensmutationer i IF-gener, inklusive neuropatier, myopatier, hudbräckningsstörningar, metaboliska dysfunktioner och för tidigt åldrande syndrom 8 . Några IF-genmutationer orsakar inte, men predisponerar deras bärare till sjukdomsprogression, såsom enkla epithelialkeratiner i leversjukdom 9 . Det senare beror på de kritiska stressskyddande funktionerna hos IF i epitel. IFs i allmänhet är bland de vanligast förekommande cellulära proteinerna under basala betingelser, men induceras vidare starkt under olika typer av stress 10 . Exempelvis visade nyligen studier som utvärderar proteombranta förändringar i nematoden C. elegans att flera IF är högt uppreglerade och benägna att aggregeraPå under organismens åldrande 11 , 12 . Eftersom underhåll av en riktig IF-struktur är väsentlig för cellulär resistans mot olika former av stress 10 kan IF-aggregering också bidra till den funktionella nedgången under åldring. Emellertid saknas studier på organismer nivå som undersöker flera däggdjurs-IF-proteiner över olika vävnader som utsätts för stress.
IF är högdynamiska strukturer som anpassar sig för att möta cellulära krav. Keratiner genomgår exempelvis en biosyntes-oberoende cykling mellan löslig (icke-trådformig) och olöslig (trådformig) proteinpool 13 . Under normala fysiologiska förhållanden kan cirka 5% den totala K8 / K18 poolen extraheras i tvättfri buffert, jämfört med ca 20% som kan lösas i det nonjoniska diskmedelet Nonidet P-40, vilket är biokemiskt jämförbart med Triton- X100 14 , 15 . Under mitos finns en märkbar ökning av lösligheten hos epitel K8 och K18 14 av enkeltyp, vilket är mindre uppenbart i epidermala keratiner men mer uppenbart i vimentin och andra typ III IF-proteiner 15 , 16 . Löslighetsegenskaper för IF-proteiner regleras tätt genom fosforylering, en nyckel efter translationell modifiering (PTM) för filamentomläggning och löslighet 17 , 18 , 19 , 20 . De flesta IFs genomgår omfattande reglering av ett antal PTM på konserverade platser, vilket resulterar i funktionella förändringar 17 .
Syftet med denna metod är att introducera utredare som är nya på IF-området för biokemisk extraktion och analysmetoder för studier av IF-proteiner över flera musvävnader. SpecifikAllierade fokuserar vi på isolering av IF-proteiner med hjälp av en extraktionsmetod med hög salt och bedömning av förändringar i PTM genom masspektrometri och PTM-riktande antikroppar. Dessa metoder bygger på tidigare publicerade procedurer 21 men innefattar modifieringar för att extrahera olika IF-proteintyper för att avslöja gemensam mekanism för reglering över IF-familjen. Exempelvis reglerar K8-acetylering vid en specifik lysinrest en filamentorganisation, medan hyperacetylering främjar K8-olöslighet och aggregatbildning 22 . Nya globala proteom profileringsstudier har dessutom visat att de flesta vävnadsspecifika IF-proteiner också är mål för acetylering och att de flesta IF-acetyleringsställen är begränsade till den starkt konserverade stångdomänen. Detta belyser behovet av metoder som är lämpliga för global profilering av IF-systemet. Vi introducerar också en snabb metod för att isolera IF-proteiner från flera vävnader med hjälp av automatiserad homogenisering i optiMiserad lyseringsmatris. De resulterande preparaten är lämpliga för nedströms PTM-analys via masspektrometri och andra metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet godkänns och utförs i enlighet med Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of North Carolina.
1. Förberedelser
- Bered Triton-X-buffert (1% Triton X-100, 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), höj volymen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4). För att göra 500 ml: rör om 5 ml vardera av Triton X-100 och 500 mM EDTA i 490 ml PBS, pH 7,4. Förvara Triton-X buffertlösning vid 4 ° C.
- Framställ hög saltbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, sänka volymen i dubbeldestillerad (dd) H20). För att göra 500 ml: rör om 10 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml 0,5 M EDTA och 2,5 ml Triton X-100, justera volymen till 500 ML med användning av dubbelt destillerat vatten). Förvara hög saltbuffertlösning vid 4 ° C.
- Just före användning, komplettera en lämplig mängd Triton-X och High Salt Buffer (
- Bered 5 mM EDTA i 1x PBS, pH 7,4. För att göra 500 ml: rör om 5 ml 0,5 M EDTA i 495 ml 1x PBS, pH 7,4.
- Isolera olika musorgan (hjärna, hjärta, lunga, lever, bukspottkörtel, tjocktarmen, tarmarna, njuren, mjälten) med godkända protokoll som överensstämmer med veterinära riktlinjer och institutionella normer 23 . Vävnadsuppsamlingsproceduren bör inte ta mer än 5 minuter för att bevara RNA och proteinintegritet hos proteasrika vävnader ( t.ex. pankreas ska behandlas först).
- Skär en liten mängd vävnad (~ 5-20 mg) och placera i RNA-lagringslösning, för efterföljande RNA-extraktion, cDNA-syntes och kvantitativ realtids PCR-analys för IF-genuttryck. Placera RNA-lagringslösningsrör med vävnad vid 4 ° C över natten och följ tillverkarens protokoll för ytterligare sTorage och isoleringssteg.
- Skär resten av vävnaden i mindre fragment ( t.ex. 0,5 cm) och placera i cryovial. Snäppfrys och förvara injektionsflaskor vid -80 ° C eller flytande kväve för längre tids lagring.
2. Om genuttrycksanalys
- Extrahera RNA från vävnader bevarade i RNA-lagringslösningsreagenset. Använd lämplig / föredragen RNA-extraktionsmetod enligt tillverkarens protokoll.
- Kvantifiera RNA-koncentrationen och använd 2 μg RNA för att generera cDNA med användning av ett lämpligt omvänt transkriptionssats enligt tillverkarens protokoll.
- Genom att använda den genererade cDNA och musen IF-gen-specifika primrar, upprättas qPCR-reaktioner, innefattande tre tekniska replikat av varje prov samt blank kontroll enligt tillverkarens protokoll.
- Kvantifiera IF-genuttryck som en veckbyte som jämför olika förhållanden ( t ex ung mot gammal vävnad).
3. PReparation av totala vävnadslysat för immunoblot
- Homogenisera 25 mg vävnad i 1 ml 2x icke-reducerande SDS-provbuffert. Utsätt bromfenolblåttfärg från provbufferten om en kolorimetrisk proteinanalys ska utföras för att kvantifiera proteinkoncentration.
- Tillsätt 5% (volym / volym) 2-merkaptoetanol (2-ME) för att göra reducerade prov. Till 200 μl av de icke-reducerande proverna tillsättes 10 μl 2-ME.
- Bestäm proteinkoncentration med användning av detergent- och reduktionsmedelskompatibelt proteinanalys. Om färgämne redan ingår i provbufferten kan proteinmängden uppskattas efter att ha kört en gel via ett antal tekniker, inkluderande Coomassie-baserad fläck 24 .
- Vortex alla prov och värm vid 95 ° C i 5 min.
- Utför western blotting under både reducerande och icke-reducerande förhållanden. Exponeringsmembran kort (<1 min) för att avslöja monomera arter och längre (> 1 min) för att avslöja komplex med hög molekylvikt innehållandeNg IF-proteiner. Om övervakning aggregering, undersök hela gel / membran (inklusive bottnar av gelbrunnarna).
- Kör en parallellgel och fläck med en proteinfläck som en lastkontroll 24 . I sjukdomsmodeller eller skadeförsök bör total proteinfläck användas som en laddningskontroll, i motsats till immunoblottar för "hushållsproteiner" ( t.ex. aktin, GAPDH) eftersom de senare förändras under olika stressförhållanden.
4. Framställning av detergentlösliga och högsalt extrakt av vävnadspecifika IFS
- Tillsätt 1 ml iskall Triton X-100 buffert i en glasrörhomogenisator och lägg den på is.
- Ta bort en liten bit vävnad (~ 25 mg) från flytande kväveförvaring och placera direkt i glashomogenisatorn. Använd en polytetrafluoroetylenpestel för att homogenisera (50 slag) och undvik bubblor. Håll homogenisatorn och lysaten kallt hela tiden.
- Överför lysat till en 1,5 ml mikronOcentrifugrör på is och centrifugera vid 20 000 xg i 10 min i en förkyld centrifug (4 ° C).
- Samla supernatantfraktionen i ett separat rör. Detta är den Triton X-lösliga fraktionen, vilken kan användas för immunutfällning (ip) och analys av det tvättmedelslösliga poolen av IF-proteiner. Observera att steg 4.1-4.4 kan upprepas för att uppnå ett renare IF-extrakt från hjärnvävnaden.
- Tillsätt 1 ml högsaltbuffert till vävnadspelleten, överför till en ren homogenisator och dämpa 100 slag. Överför homogenatet tillbaka till mikrocentrifugröret och placera röret på en roterande skakapparat i kallrummet i 1 timme.
- Centrifugera homogenaten vid 20 000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml iskall PBS / EDTA-buffert till pelleten och homogenisera pelleten (20 slag) i en ren homogenisator som ett slutligt rengöringssteg *. Överför till ett nytt rör och centrifugera vid 20 000 xg under 10 min vid 4 ° C för att erhålla IF-protein-Rika högsalt extrakt (HSE).
* Eventuellt virvel istället för homogenisering vid detta steg. - Kassera supernatanten och lösa upp pellets i 300 μL icke-reducerande SDS-provbuffert som har förvärmts. Bryt upp pelleten initialt genom pipettering och virvelbildning och värm sedan proven i 5 minuter vid 95 ° C.
- Vortex och pipett som behövs för att säkerställa pelleten är upplöst. Det kan ta flera minuter att helt lösa upp pelletsna.
- Förvara alla prov vid -20 ° C till analys.
5. Automatiserad vävnadslysis för IF-proteinutvinning i experiment med hög volym
- För RNA-extraktion, placera lysbuffert (600 μl buffert per 25 mg vävnad) i ett rör innehållande lysningsmatris D (använder små keramiska sfärer) och puls två gånger i 25 s i vävnadslysern. Separat lysat från matrisen genom centrifugering vid 20 000 xg och fortsätt till nästa steg isolerat.
- För proteinutvinning, sätt TritPå X-100 (eller SDS-provbuffert vid framställning av totalt lysat) i ett lysrör med lyseringsmatris SS (använd en enda rostfritt stålpärla). Efter testning av flera matriser valdes detta för att det producerar IF-proteinextrakt som är av liknande kvalitet som den traditionella studsmetoden. Observera att den automatiska metoden inte är optimal för bukspottkörtel och mjälte, och standardhomogeniseringsprotokollet bör användas för dessa vävnader.
- För att fortsätta med beredning av High Salt Extract, ta bort rostfritt stålpärlan från röret med hjälp av en magnet och centrifugera rören vid 20 000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Fortsätt med steg 4.4 (ovan) i det manuella protokollet.
- Förvara alla prov vid -20 ° C till analys.
6. Immunberikning av posttranslationellt modifierade IF-proteiner
- Förbered PBST-buffert (0,02% Tween-20 i PBS). För att göra 50 ml tillsätt 10 | il Tween-20 till 50 ml PBS, pH 7,4.
- Förbered PTM-antikroppLösning (1-10 μg antikropp i 200 | il PBST). I allmänhet är 3 μg antikropp / reaktion ett bra utgångsläge som ytterligare kan optimeras om det behövs.
- För varje reaktion placeras alikvot 50 μl magnetiska pärlor i ett mikrocentrifugrör, placera på magneten och aspirera pärlförvaringslösningen.
- Konjugera pärlorna till immunutfällningsantikroppen genom att suspendera i antikroppslösningen och inkubera på rotatorn (över-ände, för att säkerställa blandning av små volymer) vid rumstemperatur i 20 minuter.
- Placera rören på magnet och aspirera antikroppslösning.
- Skölj antikroppskonjugerade pärlor en gång i 200 pi PBST och avlägsna tvättbuffert.
- Tillsätt 0,6-1 ml vävnadslysat till pärlorna, blanda genom försiktig pipettering och inkubera i 3 timmar på rotatorn i ett kallrum.
- Placera rör på magnet, ta bort lysat och tvätta pärlorna fem gånger med 200 pi PBST. Efter det sista tvättsteget samla pärlorna i 100 _6; L av PBS (ingen Tween-20) och överföring till ett rent nytt rör. Placera röret på magneten.
- Aspirera PBS och tillsätt 100 μL icke-reducerande provbuffert. Avlägsna 50 μL och tillsätt 2-ME (5%) för att göra reducerande prov. Värm proven till 95 ° C under 5 min.
- Separera ip-fraktionen från pärlorna på magneten och samla den in i ett nytt rör.
- Förvara prov vid -20 ° C till analys.
7. Framställning av IF-proteinprover för masspektrometrianalys
- Planera ett samråd med en proteomics expert innan du initierar en studie eftersom det finns betydande tid och kostnad som är inblandad i masspektrometrianalys.
- Vidta speciella försiktighetsåtgärder för att undvika förorening. Hantera alla geler med rena handskar och inkubera i rena behållare, tvätta endast med ddH 2O (undvik tvål).
- Kör 20-50 μl av HSE-provet (från sektionerna 4 och 5) på en SDS-PAGE-gel i enlighet med standardbetingelserna. Stain med en proteinfärg i 1 timme. Skölj flera gånger och de-stain i ddH20 över natten. IF-proteinbanden bör vara synliga efter avfärgning.
- Placera gelén mellan plastskyddsskydd, skanna och markera de band som ska skäras och skickas för analys.
- Uppskatta IF-proteinbandet med en ny ren rakhyvel.
- Placera gelbanden i rena mikrocentrifugrör och överföra till en masspektrometrianläggning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En ny snabb metod för hög saltbaserad extraktion av IF-proteiner från flera musvävnader med användning av lysningsmatris.
Den traditionella metoden 25 , 26 för att isolera huvuddelen av den mellanliggande filamentproteinfraktionen från epitelvävnad modifierades här för att inkludera 9 olika organ och ett snabbare förfarande för vävnadslys. Medan 3 manuella homogeniseringssteg krävs för den traditionella metoden har den modifierade proceduren endast 1 manuellt homogeniseringssteg, vilket förkortar proceduren med flera timmar, speciellt vid behandling av mer än 6 prover. Figur 1A visar ett typiskt resultat av HSE från 9 musvävnader, medan tabellen över förväntade proteiner i vävnaden och molekylvikten för varje protein visas i figur 1B
Lever K8 och K18 är starkt uppreglerade och genomgår ökad fosforylering och lysinacetylering i lever från gamla möss.
Figur 2 visar typiska resultat från flera av de analyser som beskrivs i detta protokoll. Panel A visar expressionsanalys av de två stora IF-generna i levern, keratin 8 ( KRT8 )Och keratin 18 ( KRT18 ) som kodar för IF-proteinerna K8 respektive K18. Epiteliala keratiner är starkt uppreglerade under olika stressförhållanden. I det visade resultatet uppträder detta under åldring, eftersom KRT8 är signifikant uppreglerad i leverna av 24 m gamla möss jämfört med 3 m gamla möss. Resultaten på proteinhalten är mer slående, vilket observeras av den dramatiska ökningen av K8-monomeren liksom komplex med hög molekylmassa i de gamla (24m) levererna. Coomassie-baserad proteinfärg här tjänar som en laddningskontroll för att säkerställa lika belastning av protein över prov. Observera att med totala vävnadslysat är det lätt att överbelasta protein på en gel, som det är i detta fall. Om du laddar ner en mindre volym eller spädar provet ytterligare i buffert med natriumdodecylsulfat (SDS), kommer detta problem att lindras (särskilt om det verkar visköst och svårt att pipera). Panel C avbildar ett typiskt resultat från en lever Hög Salt Extrakt erhållen med hjälp av det automatiska protokollet, demOnstrating den starka anrikningen av keratiner 8 och 18 på gelén. De röda linjerna avgränsar det område som skäras och lämnas in för masspektrometrianalys. I panel D visar resultaten av massspecifikanalysen av proven i panel C att K8 och K18 i den gamla levern har flera fosforylerings- och acetyleringsställen som inte är närvarande i den unga leveren.
GFAP är starkt uppreglerad och lysin acetyleras i hjärnorna från gamla möss.
Figur 3 visar att metoderna som används för att extrahera IFs från epitel kan också användas på icke-epitelvävnad. Vidare avslöjar resultaten ett allmänt mönster för åldringsberoende upregulation av IF-gener och proteiner. QPCR-resultatet i Figur 2A avslöjar en 5-faldig induktion av GFAP- mRNA i hjärnorna hos 24 m gamla möss jämfört med 3 m gamla möss. Figur 2BAvslöjar totala proteiner närvarande i Triton X-100 fraktionen och den IF-berikade HSE. Notera ökningen av bandintensiteten vid 50 kDa markerad med pilen (motsvarande GFAP) i den gamla hjärnan. Western blot-analys i Figur 2C visar vidare uppreglering av GFAP och signifikant närvaro av GFAP-monomer och potentiellt högmolekylärt komplex i Triton X-100-fraktionen (båda markerade med pilar). Western blot-analys av samma prover med en pan-acetyllysinantikropp visar att antikroppen igenkänner ett band vid ~ 50 kDa i HSE hos den gamla mushjärtan och vid ~ 250 kDa i Triton X-100-fraktionen ( Figur 2D ). Immunberikning av acetylerade proteiner från Triton X-100-fraktionerna avslöjar ökad närvaro av GFAP-protein i lysatet erhållet från den gamla hjärnan. Reduktions- och icke-reducerande betingelser visas för att markera GFAP-monomer och högmolekylära komplex. Masspektrometrianalys (liknande Figur 1
Figur 1: Automatiserad lysis och extraktion av IF-proteiner från multipla musvävnader. ( A ) Coomassie-baserad gelfärgning av HSE från de angivna musvävnaderna. De visade vävnaderna erhölls från samma vuxna (3 m gamla) manliga CBA-mus. Prover behandlades som beskrivet i avsnitt 5. Hjärna : notera att NFL, NFM och NFH är starkt fosforylerade 27 och migrera långsammare än förväntat, vid respektive ~ 70, 145 respektive 200 kDa. Hjärta : Förutom det 53 kDa-bandet som motsvarar desmin och vimentin) innehåller hjärtprover också ett ~ 42 kDa band, vilket troligen representerar aktin, vilket är känt att samvrengöra med desmin 28 . LArge-intestin: Identiteten hos de framträdande banden över 25 kDa som samekstraheras med K8 / K18 är inte känd, men dessa band är inte närvarande om vävnaderna behandlas med användning av den traditionella doseringshomogenisationsmetoden. Bukspottkörtel och mjälte : Observera att den automatiska homogeniseringen inte är lämplig för isolering av keratiner från bukspottkörteln och vimentin från mjälte, förmodligen på grund av lysatets känslighet till den svaga temperaturförhöjningen under pulsen i vävnadslysern. ( B ) Tabell som visar de huvudsakliga IF-proteintyperna som finns i de olika vävnaderna och deras förutspådda molekylvikt som referens för panel A. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: MoleculAr och biokemiska skillnader i leverkeratiner från unga och gamla möss. ( A ) Analys av KRT8- och KRT8- mRNA med användning av standardförfarandet (protokoll 1) avslöjar signifikant induktion i KRT8- transkript i leverorna från gamla möss. N = 6 för varje tillstånd (3 manliga och 3 kvinnliga CBA-möss användes per grupp). ** p <0,01; Envägs ANOVA. ( B ) Totalt leverlysat erhölls från 3 unga (3 månader gamla) och 3 gamla (24 månader gamla) manliga CBA-möss med användning av protokoll 2 och proverna analyserades under icke-reducerande betingelser. TS1-antikropp användes för att proba för K8-uttryck och Coomassie-baserad proteinfläck användes som en laddningskontroll. ( C ) Höga saltekstrakter från unga och gamla muselever, som motsvarar möss nr 1 respektive 4 från panel B. De två pilarna pekar på K8 och K18 på gelén och den röda rutan indikerar den del av gelén som var Excised och inlämnad för masspektrometrianalys. ( D Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Molekylära och biokemiska skillnader i GFAP från hjärnan hos unga och gamla möss. ( A ) Analys av GFAP- mRNA med användning av standardförfarandet (protokoll 1) avslöjar signifikant induktion i hjärnorna från gamla möss. N = 6 för varje tillstånd (3 manliga och 3 kvinnliga CBA-möss användes per grupp). ** p <0,01; Envägs ANOVA. ( B ) Coomassie-baserad proteinfärgning av Triton X-100 och HSE-fraktioner från hjärnvävnad av ung (3 månader gammal) och gammal (24 månader gammal) mus. Notera ökningen i ~ 50 kDa GFAP-bandet i HSE från gammal hjärna (pil). ( C ) GFAP-immunoblot (musmonoklonal; GA5-klon) av samma prover som panel B. ( D ) Acetyl-lysinimmunoblot (kaninpolyklonal; Abcam ab80178) av samma prover som i panel B. ( E ) GFAP-blot efter immunutfällning med acetyl- Lysin antikropp. Prover analyserades under icke-reducerande (NR) och reducerande (R) betingelser och pilar pekar på att öka närvaron av GFAP i immunprecipitatet från den gamla hjärnan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som möjliggör biokemisk karakterisering av IF-proteiner kan vara användbara för att förstå många patofysiologiska fenomen i däggdjursystem, eftersom IF-proteiner är både markörer och modulatorer av cellulär och vävnadsspänning 29 . Principen bakom den nuvarande metoden är baserad på de initiala procedurer som utvecklats på 1970-talet och 1980-talet för att isolera, separera och rekonstruera IF-proteiner från celler och vävnader, som i allmänhet använder låg- och högsaltlösningar och Triton-X100-tvättmedel 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . För historisk inblick i studierna som stödde biokemisk isolering av IF-proteiner, se senaste recensionerna 36 , 37 . Den nuvarande metodenBaseras på senare protokoll som utvecklats för studier av enkla epithelialkeratiner 26 . Fördelen med metoden är att den kan tjäna som ett första steg för att möjliggöra utredare som är nya på IF-fältet för att effektivt isolera IF-proteiner från de flesta däggdjursvävnader. Det representerar en visuell guide till relaterade förfaranden som används ofta av utredare inom området för att studera IF-proteinreglering 21 , 38 .
Denna teknik kan användas för att studera reglering och funktion av IF i stresskommunikationsmekanismer mellan däggdjursvävnader 39 , 40 . Det blir väl uppskattat att stress i en vävnad kan påverka funktionen hos andra vävnader, till exempel under näringsstress 41 , proteinfyllnad 42 , metabolisk stress 43 och othEr förändringar. Observera, det mesta av det arbete som för närvarande görs på detta område finns i modellerna Drosophila och C. elegans , medan studier om omfattande stressrespons i däggdjursystem saknas. Som huvudregulatorn av cellulär spänning 10 kan IF-systemet låsa upp ledtrådar till spänningsresponser på organismerivå, vilket kan ha viktiga sjukdomsimplikationer. Som sådant kan det nuvarande protokollet användas för att studera globala patofysiologiska mekanismer i olika musmodeller av stress, skada och sjukdom.
En begränsning av den nuvarande tekniken är att högsaltekstrakten anses vara "råa" IF-preparat eftersom de också innehåller andra IF-associerade proteiner, såsom plektin till exempel 44 . Som tidigare visat kan HSE-celler denatureras i 8 M urea-buffert för att erhålla mycket rena IF-proteiner som kan återuppbygga in vitro i fosfatbuffert 44 . Efter två sådana cykler avDemontering och ommontering, stökiometrin för IF-proteiner (isolerade från HeLa-celler) förblev densamma, medan ureabehandlingen avlägsnades plectin 44 . Under desminrening kan aktin avlägsnas genom solubilisering av HSE i ättiksyra 45 . Huruvida ytterligare reningssteg ska ingå beror på experimentets slutliga mål. Om målet till exempel är att karakterisera monteringstillståndet och generera in vitro rekonstituerade IF-er, krävs ureatsteget för att erhålla mycket rena IF-proteiner. Å andra sidan, om målet är att identifiera kontextberoende föreningar mellan IF och andra cellulära proteiner, kan de "råa" preparaten användas. Interaktiva proteiner kan identifieras genom masspektrometri med användning av antingen in-gel-digestning för höga överflödsmål för synliga genom gelfläckning eller upplösning i lösningen för låga överflödsmål. Tidigare studier med immunutfällning av tvättmedelslösliga IFS och HSEInnehållande IF-proteiner identifierade funktionellt viktiga specifika interaktioner mellan keratiner 8/18 och värmekokprotein 70 (Hsp70), som förstärks efter värmestress 46 , adaptrinsproteinet 14-3-3 efter fosforylering 47 och K8 / K18 Raf-1-kinas Under normala fysiologiska förhållanden 48 bland annat. Det aktuella protokollet kan möjliggöra liknande studier på andra IF-proteiner.
Användning av lyseringsmatrisen är en nyckeländring från tidigare metoder och bör möjliggöra snabb extraktion av IF från flera vävnader, med undantag av bukspottkörtel och mjälte. Automatiseringen av de initiala stegen kan vara speciellt användbar för högvolym musförsök. Exempelvis kommer isolering av IF-proteiner från 3 olika vävnader från 10 möss per tillstånd ( t.ex. normal och någon form av systemisk stress eller sjukdom) att kräva behandling av 60 individuella vävnader. Med den traditionella manuella metoden här woUld måste göras i partier och kan ta flera dagar. Men med hjälp av den automatiserade metoden med lysningsmatris kan proceduren göras på bara några timmar. Kritiska steg i förfarandet är att se till att provet är kallt under hela förfarandet; Inkubation i hög saltbuffert under 1 h (steg 4.5); Med hjälp av varm buffert och omfattande virvelbildning för att säkerställa fullständig återuppslamning av pelleten före analys (steg 4.8); Och vidta alla försiktighetsåtgärder för att undvika förorening av prover som ska analyseras med masspektrometri (steg 7.2).
Den stora nackdelen med masspektrometribaserad identifiering av PTM-ställen är att det fungerar mycket bra för vissa PTM-fosforylering och lysinacetylering är främsta exempel - men andra, såsom sumoylering, är mycket mer utmanande 49 . Ändå är proteomics ett kraftfullt verktyg för att studera proteinreglering i normala och sjuka vävnader. Agnetti et al. Sammanställd en omfattande uppgiftTill-datum-översikt över banbrytande proteomtekniker som för närvarande används för att studera olika PTM i sammanhanget av vävnadsuttryckta proteiner 50 . Syftet med den nuvarande metoden är att generera prover som kan tillämpas för olika typer av analyser. Till exempel kan sumoylering in vitro utföras på immunkipiterade IF-proteiner och övergripande sumoylering kan bedömas på isolerade IF i HSE-preparat med användning av sumo-specifika antikroppar 18 , 21 . Därför är tillämpningen av denna metod inte begränsad till att generera prover endast för masspektrometrianalys men kan användas för att proba flera IF-egenskaper med användning av en rad olika nedströms tekniker.
IF-proteiner regleras i stor utsträckning av många PTM på konserverade ställen, vilket resulterar i förändrad löslighet, filamentmontering och proteininteraktioner 17 . Nyliga tekniska framsteg har avslöjat tHan otroligt storleksgrad, komplexitet och sjukdomsbetydelse av posttranslationella modifieringar (PTM) på cellulära proteiner 51 , 52 , 53 . Förbättring av detekteringsmetoder för vanliga PTM, såsom fosforylering 54 och acetylering 51 , har givit stora katalogkataloger, men förstå deras biologiska mening - sprickbildning av "PTM-koden" - är en viktig återstående utmaning 55 , 56 . Ett sätt att bedöma funktionella roller och relativ betydelse för varje PTM är att bestämma hur väl den är bevarad över flera medlemmar av IF-proteinfamiljen. Exempelvis avslöjade identifiering av en ny fosfortyrosin-plats på K8 att denna plats är innehållen i ett QYE-motiv som finns i väsentligen alla cytoplasmatiska IF-proteiner och är kritiskt för att reglera IF-proteinlöslighet och filament-dyNamiker 57 . Viktigt är att mutation av den konserverade tyrosinresten på GFAP till en negativt laddad "fosfomimisk" asparaginsyra (Y242D) orsakar Alexander Disease 58 . De representativa data som visas här visar hur två olika vävnadsspecifika IF-proteintyper (K8 och GFAP) genomgår ett liknande uppmönstermönster och ökad acetylering under åldring, vilket kan vara en effekt av förändrad metabolism 22 , 51 . Detta exempel illustrerar användbarheten av metoden för att förstå funktionen av IF-proteiner på en global fysiologisk skala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] och P30 DK034987 [till UNC-Chapel Hill]. Författarna tackar Deekshita Ramanarayanan för hjälp med qPCR och western blot-experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein G | ThermoFisher Scientific | 10009 | immunoprecipitation beads |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for buffers |
| Purelink RNA mini kit | ThermoFisher Scientific | 12183018 | RNA extraction from tissue |
| Purelink DNAse set | ThermoFisher Scientific | 12185010A | on column DNA digestion |
| Dynamag-2 | ThermoFisher Scientific | 12321D | magnet for use with dynabeads |
| GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24592 | mass spectrometry-compatible gel stain |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher Scientific | 32106 | for use in western blot |
| High Capacity cDNA reverse transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4368813 | for use in gene expression analysis |
| Proflex 3 x 32-well PCR System | ThermoFisher Scientific | 4484073 | PCR system |
| PVDF transfer membrane | ThermoFisher Scientific | 88520 | for western blot |
| Power Up SYBR master mix | ThermoFisher Scientific | A25778 | for qPCR analysis |
| RNAlater | ThermoFisher Scientific | AM7020 | solution for tissue storage prior to RNA isolation |
| Novex 4-20% Tris Glycine Gel | ThermoFisher Scientific | XP04205BOX | Precast protein gel |
| Anti-Keratin 8 antibody (TS1) | ThermoFisher Scientific | MA514428 | for western blot detection of K8 |
| Anti-Vimentin | ThermoFisher Scientific | MA511883 | for western blot detection of vimentin |
| Tris Glycine Transfer Buffer (25x) | ThermoFisher Scientific | LC3675 | for wet transfer of protein gels |
| 2x SDS Sample Buffer | ThermoFisher Scientific | LC2676 | for preparing protein gel samples |
| Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) | ThermoFisher Scientific | LC26755 | for running protein gels |
| Lysing beads - Matrix D | MP Biomedicals | 116913100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction |
| Lysing beads - Matrix SS | MP Biomedicals | 116921100 | Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-LITE | measurement of protein and nucleic acid |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119 | Automated tissue homogenizer |
References
- Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
- Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
- Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
- Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
- Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
- Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
- Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
- Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
- Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
- Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
- Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
- Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
- Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
- Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
- Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
- Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
- Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
- Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
- Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
- Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
- Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
- Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
- Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
- Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
- Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
- Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
- Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
- Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
- Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
- Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
- Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
- Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
- Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
- Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
- Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
- Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
- Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
- Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
- Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
- Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
- Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
- Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
- Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
- Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
- Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
- Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
- Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
- Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
- Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
- Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
- Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).
