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Biochemistry

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Abstract

Los filamentos intermedios (IF), junto con filamentos de actina y microtúbulos, forman el citoesqueleto, un elemento estructural crítico de cada célula. El funcionamiento normal de las IF proporciona a las células resistencia mecánica y al estrés, mientras que un citoesqueleto disfuncional de IF compromete la salud celular y se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Las modificaciones postraduccionales (PTMs) regulan críticamente la dinámica de IF en respuesta a cambios fisiológicos y bajo condiciones de estrés. Por lo tanto, la capacidad de supervisar los cambios en la firma PTM de IFs puede contribuir a una mejor comprensión funcional y, en última instancia, condicionamiento del sistema IF como un respondedor de estrés durante la lesión celular. Sin embargo, el gran número de proteínas IF, que están codificadas por más de 70 genes individuales y se expresan de una manera dependiente de los tejidos, es un reto importante para clasificar la importancia relativa de diferentes PTMs. Con este fin, los métodos que permiten el monitoreo de PTMs sobre las proteínas IFA nivel de todo el organismo, y no para miembros aislados de la familia, puede acelerar el progreso de la investigación en esta área. Aquí presentamos métodos bioquímicos para el aislamiento de la fracción total, soluble en detergente y resistente al detergente de las proteínas IF de 9 tejidos de ratón diferentes (cerebro, corazón, pulmón, hígado, intestino delgado, intestino grueso, páncreas, riñón y bazo). Demostramos además un protocolo optimizado para el aislamiento rápido de las proteínas IF utilizando matriz de lisis y homogeneización automatizada de diferentes tejidos de ratón. El protocolo automatizado es útil para perfilar IFs en experimentos con alto volumen de muestra (tal como en modelos de enfermedad que implican múltiples animales y grupos experimentales). Las muestras resultantes pueden utilizarse para diversos análisis de aguas abajo, incluyendo el perfilado de PTM basado en espectrometría de masas. Utilizando estos métodos, proporcionamos nuevos datos para demostrar que las proteínas IF en diferentes tejidos de ratón (cerebro e hígado) experimentan cambios paralelos con respecto a su expresiónY los PTM durante el envejecimiento.

Introduction

Las IF son una familia de proteínas que en los seres humanos están codificadas por 73 genes y categorizadas en seis tipos principales: los tipos I a IV son citoplásmicos ( por ejemplo, queratinas epiteliales y capilares (K), mi- cito desmina, neurofilamentos, proteína glicolar fibrilar (GFAP) y otros); Tipo V son las láminas nucleares; Y el tipo VI son IFs en la lente ocular 1 . En cuanto a su organización molecular, las proteínas IF tienen tres dominios comunes: un dominio "varado" de bobina en espiral altamente conservado y dominios globulares de "cabeza" y "cola". Los tetrámeros de proteínas IF se unen para formar precursores de filamentos cortos, que finalmente se incorporan en filamentos maduros que forman estructuras citoesqueléticas y nucleoesqueléticas dinámicas involucradas en la protección mecánica 2 , la detección de estrés 3 , 4 , la regulación de la transcripción 5 y el crecimiento y otras funciones celulares críticas"> 1 , 6 , 7 .

La importancia funcional del sistema de IF se pone de relieve por la existencia de muchas enfermedades humanas causadas por mutaciones missense en genes de IF, incluyendo neuropatías, miopatías, trastornos de la fragilidad de la piel, disfunciones metabólicas y síndromes de envejecimiento prematuro 8 . Algunas mutaciones del gen IF no causan, pero predisponen a sus portadores a la progresión de la enfermedad, como las queratinas epiteliales simples en la enfermedad hepática 9 . Este último se debe a las funciones críticas de protección del estrés de las IF en los epitelios. Las IF en general se encuentran entre las proteínas celulares más abundantes en condiciones basales, pero se induce además fuertemente durante varios tipos de estrés 10 . Por ejemplo, estudios recientes que evalúan los cambios en todo el proteoma en el nematodo C. elegans demostraron que múltiples IFs están altamente reguladas y propensas a agregatiDurante el envejecimiento del organismo 11 , 12 . Dado que el mantenimiento de una estructura de IF adecuada es esencial para la resistencia celular a diversas formas de estrés 10 , la agregación de IF también puede contribuir a la disminución funcional durante el envejecimiento. Sin embargo, los estudios a nivel de organismal que examinan múltiples proteínas de mamífero IF a través de diferentes tejidos sometidos a estrés son deficientes.

Las IF son estructuras altamente dinámicas que se adaptan para satisfacer las demandas celulares. Las queratinas, por ejemplo, experimentan un ciclo independiente de biosíntesis entre el pool de proteínas solubles (no filamentosas) e insolubles (filamentosas) 13 . En condiciones fisiológicas normales, aproximadamente el 5% del total de K8 / K18 se puede extraer en tampón exento de detergente, en comparación con aproximadamente 20% que se puede solubilizar en el detergente no iónico Nonidet P-40, que es bioquímicamente comparable al Triton- X100 14 , 15 . Durante la mitosis hay un notable aumento en la solubilidad de los epitelios de tipo simple K8 y K18 14 , que es menos evidente en las queratinas epidérmicas, pero más evidente en la vimentina y otras proteínas tipo III IF [ 15 , 16] . Las propiedades de solubilidad de las proteínas IF están estrechamente reguladas por la fosforilación, una modificación clave post-traduccional (PTM) para el reordenamiento de los filamentos y la solubilidad 17 , 18 , 19 , 20 . La mayoría de las IF se someten a regulación extensiva por una serie de PTM en sitios conservados, lo que resulta en cambios funcionales [ 17] .

El propósito de este método es introducir a los investigadores que son nuevos en el campo de IF a la extracción bioquímica y métodos analíticos para el estudio de las proteínas de IF a través de múltiples tejidos de ratón. EspecíficoNos centramos en el aislamiento de las proteínas IF utilizando un método de extracción de alta sal y la evaluación de los cambios en PTMs a través de espectrometría de masas y por anticuerpos dirigidos a PTM. Estos métodos se basan en los procedimientos publicados anteriormente 21, pero incluyen modificaciones para extraer diferentes tipos de proteínas IF para descubrir el mecanismo común de regulación en toda la familia IF. Por ejemplo, la acetilación de K8 en un residuo de lisina específico regula la organización del filamento, mientras que la hiperacetilación promueve la insolubilidad de K8 y la formación de agregados 22 . Recientes estudios de perfiles proteómicos globales han revelado adicionalmente que la mayoría de las proteínas específicas de tejido IF son también objetivos para la acetilación y que la mayoría de los sitios de acetilación IF están confinados al dominio de barras altamente conservadas. Esto pone de manifiesto la necesidad de métodos adecuados para el perfil global del sistema IF. También se introduce un método rápido de aislamiento IF proteínas de múltiples tejidos utilizando homogeneización automatizada en optiMatriz de lisis. Las preparaciones resultantes son adecuadas para análisis PTM aguas abajo a través de espectrometría de masas y otros métodos.

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Protocol

El protocolo es aprobado y realizado de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Carolina del Norte.

1. Preparaciones

  1. Preparar tampón Triton-X (Triton X-100 al 1%, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar el volumen en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml cada uno de Triton X-100 y 500 mM de EDTA en 490 ml de PBS, pH 7,4. Guarde la solución tampón Triton-X a 4 ° C.
  2. Preparar tampón de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,5%, aumentar el volumen en H _ { 2 } O doble destilado). Para preparar 500 ml: agitar 10 ml de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 ml de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 ml de EDTA 0,5 M y 2,5 ml de Triton X-100, ajustar el volumen a 500 Ml con agua destilada doble). Almacene la solución del almacenador intermediario de la sal a 4 ° C.
  3. Justo antes de su uso, complete una cantidad apropiada de Triton-X y High Salt Buffer (
  4. Preparar EDTA 5 mM en 1x PBS, pH 7,4. Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml de EDTA 0,5 M en 495 ml de 1x PBS, pH 7,4.
  5. Aislar los diferentes órganos del ratón (cerebro, corazón, pulmón, hígado, páncreas, colon, intestino, riñón, bazo) utilizando protocolos aprobados que cumplan con las directrices veterinarias y las normas institucionales 23 . El procedimiento de recolección de tejidos no debe tardar más de 5 minutos en conservar la integridad del ARN y la proteína de los tejidos ricos en proteasas ( por ejemplo, el páncreas debe ser procesado en primer lugar).
  6. Cortar una pequeña cantidad de tejido (~ 5-20 mg) y colocar en solución de almacenamiento de ARN, para la posterior extracción de ARN, la síntesis de ADNc, y el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real para la expresión de genes IF. Coloque los tubos de solución de almacenamiento de ARN con tejido a 4 ° C durante la noche y siga el protocolo del fabricante para más sTorage y pasos de aislamiento.
  7. Cortar el resto del tejido en fragmentos más pequeños ( por ejemplo, 0,5 cm) y colocar en criovial. Congelar y almacenar los viales a -80 ° C o nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

2. IF Análisis de la expresión génica

  1. Extraiga el ARN de los tejidos conservados en el reactivo de la solución de almacenamiento de ARN. Utilice cualquier método de extracción de ARN adecuado / preferido de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. Cuantificar la concentración de ARN y utilizar 2 μ g de ARN para generar cDNA utilizando un adecuado adecuado de transcripción de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. Utilizando los cDNA generados y los cebadores específicos del gen de ratón IF establecieron reacciones qPCR, incluyendo tres repeticiones técnicas de cada muestra, así como un control en blanco de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  4. Cuantificar IF expresión génica como cambio de veces comparando diferentes condiciones ( por ejemplo, jóvenes frente a los tejidos viejos).

3. PDe los lisados ​​totais de tejidos para la inmunotransferencia

  1. Homogeneizar 25 mg de tejido en 1 ml de tampón de muestra SDS no reductor 2x. Omitir colorante azul de bromofenol del tampón de muestra si se va a realizar un ensayo de proteína colorimétrica para cuantificar la concentración de proteína.
  2. Añadir 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (2-ME) para obtener muestras reducidas. A 200 μL de las muestras no reductoras, añadir 10 μl de 2-ME.
  3. Determinar la concentración de proteínas utilizando un detergente y un agente de reducción de proteínas compatibles de ensayo. Si el colorante ya está incluido en el tampón de muestra, la cantidad de proteína puede estimarse después de ejecutar un gel a través de una serie de técnicas, incluyendo la tinción basada en Coomassie 24 .
  4. Vórtice todas las muestras y calentar a 95 ° C durante 5 min.
  5. Realizar la transferencia western en condiciones reductoras y no reductoras. Exposición membrana brevemente (<1 min) para revelar las especies monoméricas, y más largo (> 1 min) para revelar complejos de alta masa molecular contenidaNg IF proteínas. Si monitorea la agregación, examine todo el gel / membrana (incluyendo los fondos de los pocillos de gel).
  6. Ejecutar un gel paralelo y mancha con una mancha de proteínas como un control de carga [ 24] . En los modelos de enfermedad o en los experimentos con lesiones, se debe utilizar la tinción de proteína total como un control de carga, en oposición a las inmunotransferencias para proteínas de "limpieza" ( por ejemplo , actina, GAPDH) porque estas últimas cambian bajo diferentes condiciones de estrés.

4. Preparación de extractos solubles en detergentes y salinas de FIs específicos de tejidos

  1. Añadir 1 ml de tampón Triton X-100 enfriado con hielo en un homogeneizador de tubo de vidrio y colocarlo sobre hielo.
  2. Retire un pequeño trozo de tejido (~ 25 mg) del almacenamiento de nitrógeno líquido y colóquelo directamente en el homogeneizador de vidrio. Utilice un mazo de politetrafluoroetileno para homogeneizar (50 golpes) y evite hacer burbujas. Mantenga el homogeneizador y el lisado en todo momento fríos.
  3. Transferir el lisado a un micrómetro de 1,5 mlOcentrifugar en hielo y centrifugar a 20.000 xg durante 10 minutos en una centrífuga previamente enfriada (4 ° C).
  4. Recoger la fracción sobrenadante en un tubo separado. Esta es la fracción soluble en Triton X, que puede usarse para la inmunoprecipitación (ip) y el análisis del conjunto soluble en detergente de las proteínas IF. Tenga en cuenta que los pasos 4.1-4.4 pueden repetirse para lograr un extracto IF más limpio del tejido cerebral.
  5. Añadir 1 mL de High Salt Buffer a la pastilla de tejido, transferir a un homogeneizador limpio y dounce 100 golpes. Transferir el homogenado de nuevo al tubo de microcentrífuga y colocar el tubo en un agitador giratorio en la habitación fría durante 1 h.
  6. Centrifugar los homogeneizados a 20.000 xg durante 20 minutos a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
  7. Añadir 1 mL de tampón PBS / EDTA enfriado con hielo al gránulo y homogeneizar el gránulo (20 carreras) en un homogeneizador limpio como paso final de limpieza *. Se transfiere a un nuevo tubo y se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para obtener la proteína IF-Rico extracto de sal alto (HSE).
    * Opcionalmente, vórtice en lugar de homogeneización en este paso.
  8. Desechar el sobrenadante y disolver los gránulos en 300 μl de tampón de muestra de SDS no reductor que ha sido precalentado. Romper el gránulo inicialmente pipeteando y agitando vorticialmente, y luego calentar las muestras durante 5 min a 95 ° C.
  9. Vortex y pipeta según sea necesario para asegurar que el pellet se disuelva. Puede tomar varios minutos para disolver completamente los gránulos.
  10. Almacene todas las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

5. Lisis automatizada de tejidos para la extracción de proteínas IF en experimentos de alto volumen

  1. Para la extracción de ARN, colocar un tampón de lisis (600 μl de tampón por 25 mg de tejido) en un tubo que contenga matriz de lisado D (usa pequeñas esferas cerámicas) y pulsar dos veces durante 25 s en la lisadora de tejidos. Se separa el lisado de la matriz por centrifugación a 20.000 xg y se procede al siguiente paso de forma aislada.
  2. Para la extracción de proteínas, coloque TritEn X-100 (o tampón de muestra de SDS, si se prepara el lisado total) en un tubo de lisis con matriz de lisis SS (utilice un solo cordón de acero inoxidable). Después de probar matrices múltiples, esto se seleccionó porque produce extractos de proteínas IF que son de calidad similar al método tradicional douncing. Tenga en cuenta que el método automatizado no es óptimo para el páncreas y el bazo, y el protocolo de homogeneización estándar debe utilizarse para estos tejidos.
  3. Para proceder con la preparación del Extracto de Alta Sal, retire el cordón de acero inoxidable del tubo usando un imán y centrifugue los tubos a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Continúe con el paso 4.4 (arriba) del protocolo manual.
  5. Almacene todas las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

6. Inmuno-enriquecimiento de proteínas IF modificadas después de la traducción

  1. Preparar tampón PBST (Tween-20 al 0,02% en PBS). Para hacer 50 ml, añada 10 μl de Tween-20 a 50 ml de PBS, pH 7,4.
  2. Preparar el anticuerpo PTM(1-10 mu g de anticuerpo en 200 mu l de PBST). En general, 3 μg de anticuerpo / reacción es una buena condición inicial que se puede optimizar más si es necesario.
  3. Para cada reacción, colocar alícuotas de 50 μl de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga, colocar en el imán y aspirar la solución de almacenamiento de perlas.
  4. Conjugar las perlas con el anticuerpo de inmunoprecipitación re-suspender en la solución de anticuerpo e incubar en el rotador (end-over-end, para asegurar la mezcla de pequeños volúmenes) a temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Colocar los tubos en el imán y aspirar la solución de anticuerpos.
  6. Enjuagar las perlas conjugadas con anticuerpo una vez en 200 μL de PBST y eliminar el tampón de lavado.
  7. Añadir 0,6-1 ml del lisado de tejido a las perlas, mezclar por pipeteado suave e incubar durante 3 h en el rotador en una habitación fría.
  8. Coloque los tubos en el imán, elimine el lisado y lave las perlas cinco veces con 200 μl de PBST. Después de la última etapa de lavado, recoger las perlas en 100 _6; L de PBS (no Tween-20) y transferir a un tubo nuevo y limpio. Coloque el tubo en el imán.
  9. Aspirar el PBS y agregar 100 μl de tampón de muestra no reductor. Eliminar 50 μL y agregar 2-ME (5%) para hacer muestras reductoras. Calentar las muestras a 95 ° C durante 5 min.
  10. Separar la fracción ip de las perlas en el imán y recogerlo en un nuevo tubo.
  11. Almacene las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

7. Preparación de muestras de proteínas IF para el análisis de espectrometría de masas

  1. Programe una consulta con un experto en proteómica antes de iniciar un estudio, ya que el análisis de espectrometría de masas implica un tiempo y un costo significativos.
  2. Tome las precauciones especiales para evitar la contaminación. Manipular todos los geles con guantes limpios e incubar en recipientes limpios, lavados sólo con DDH 2 O (evitar el jabón).
  3. Ejecutar 20-50 μL de la muestra HSE (de las secciones 4 y 5) en un gel de SDS-PAGE de acuerdo con las condiciones estándar. Mancha con una mancha de proteína durante 1 h. Enjuagar varias veces y eliminar la mancha en ddH 2 O durante la noche. Las bandas de proteínas IF deben ser fácilmente visibles después de la des-tinción.
  4. Coloque el gel entre los protectores de láminas de plástico, escanee y marque las bandas que serán escindidas y enviadas para análisis.
  5. Excise las bandas de la proteína IF usando una nueva maquinilla de afeitar limpia.
  6. Colocar las bandas de gel en tubos de microcentrífuga limpia y transferir a una instalación de espectrometría de masas.

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Representative Results

Un nuevo método rápido para la alta extracción basada en sal de las proteínas de IF de múltiples tejidos de ratón utilizando lysing matriz.

El método tradicional 25 , 26 de aislar el grueso de la fracción de proteína de filamento intermedio del tejido epitelial se modificó aquí para incluir 9 órganos diferentes y un procedimiento más rápido para la lisis de tejidos. Aunque se requieren 3 pasos de homogenización manual para el método tradicional, el procedimiento modificado sólo tiene 1 paso de homogeneización manual, que acorta el procedimiento en varias horas, especialmente cuando se procesan más de 6 muestras. La Figura 1A muestra un resultado típico de HSEs de 9 tejidos de ratón, mientras que la tabla de proteínas esperadas en el tejido y el peso molecular de cada proteína se muestra en la Figura 1B

El hígado K8 y K18 están fuertemente regulados y sufren una mayor fosforilación y acetilación de lisina en hígados de ratones viejos.

La Figura 2 muestra los resultados típicos de varios de los análisis descritos en este protocolo. El panel A representa el análisis de expresión de los dos genes IF principales en el hígado, la queratina 8 ( KRT8 )Y queratina 18 ( KRT18 ), que codifican las proteínas IF K8 y K18, respectivamente. Las queratinas epiteliales están fuertemente reguladas positivamente bajo diversas condiciones de estrés. En el resultado mostrado, esto ocurre durante el envejecimiento , ya que KRT8 es significativamente upregulated en los hígados de ratones de 24 m de edad en comparación con ratones de 3 m de edad. Los resultados a nivel proteico son más sorprendentes, como se observa por el aumento dramático en el monómero K8 así como complejos de alta masa molecular en los hígados viejos (24 m). La tinción proteica basada en Coomassie sirve aquí como un control de carga para asegurar la carga igual de proteína entre muestras. Obsérvese que con los lisados ​​de tejidos totales es fácil sobrecargar la proteína en un gel, como es en este caso. Cargar un volumen menor o diluir la muestra adicionalmente en tampón de dodecilsulfato sódico (SDS), aliviará este problema (especialmente si aparece viscoso y difícil de pipetear). El panel C representa un resultado típico de un extracto de sal alto de hígado obtenido usando el protocolo automatizado, demSuperando el fuerte enriquecimiento de queratinas 8 y 18 sobre el gel. Las líneas rojas demarcan el área que se escindió y se sometieron para análisis de espectrometría de masas. En el panel D, los resultados del análisis de espectros de masa de las muestras en el panel C muestran que K8 y K18 en el hígado antiguo tienen múltiples fosforilación y sitios de acetilación que no están presentes en el hígado joven.

GFAP es fuertemente upregulated y lisina acetilada en los cerebros de ratones viejos.

La Figura 3 demuestra que los métodos usados ​​para extraer las IF de los epitelios también pueden usarse en tejido no epitelial. Además, los resultados revelan un patrón general para el envejecimiento dependiente de upregulation de IF genes y proteínas. El resultado qPCR en la Figura 2A revela una inducción de 5 veces de mRNA GFAP en los cerebros de ratones de 24 m de edad en comparación con los ratones de 3 m de edad. Figura 2BRevela las proteínas totales presentes en la fracción Triton X-100 y la HSE enriquecida con IF. Obsérvese el aumento de la intensidad de banda a 50 kDa marcado por la flecha (correspondiente a GFAP) en el cerebro antiguo. El análisis de transferencia Western en la Figura 2C revela además la regulación positiva de GFAP y presencia significativa de monómero GFAP y complejo potencial de alto peso molecular en la fracción Triton X-100 (ambos marcados por flechas). El análisis Western blot de las mismas muestras con un anticuerpo de pan-acetil lisina muestra que el anticuerpo reconoce una banda a ~ 50 kDa en el HSE del cerebro de ratón antiguo y a ~ 250 kDa en la fracción Triton X-100 ( Figura 2D ). El inmunoenriquecimiento de proteínas acetiladas de las fracciones Triton X-100 revela una mayor presencia de proteína GFAP en el lisado obtenido del cerebro antiguo. Las condiciones reductoras y no reductoras muestran el monómero GFAP y los complejos de alta masa molecular. Análisis de espectrometría de masas (similar a la Figura 1

Figura 1
Figura 1: Lisis automatizada y extracción de proteínas IF de múltiples tejidos de ratón. ( A ) Tinción de gel basada en Coomassie de HSEs de los tejidos de ratón designados. Los tejidos mostrados se obtuvieron a partir del mismo ratón macho CBA adulto (3 m). Las muestras se procesaron como se describe en la sección 5. Cerebro : tenga en cuenta que NFL, NFM y NFH están fuertemente fosforilados 27 y migran más lentamente de lo esperado, a ~ 70, 145 y 200 kDa, respectivamente. Corazón : Además de la banda de 53 kDa correspondiente a desmina y vimentina), las muestras de corazón también contienen una banda de ~ 42 kDa, muy probablemente representando actina, que se sabe co-purificar con desmina 28 . LIntestino: Se desconoce la identidad de las bandas prominentes por encima de 25 kDa co-extraídas con K8 / K18, pero estas bandas no están presentes si los tejidos se procesan usando el método tradicional homogenizador dounce. Páncreas y bazo : Obsérvese que la homogeneización automática no es adecuada para el aislamiento de queratinas del páncreas y vimentina del bazo, presumiblemente debido a la sensibilidad del lisado al ligero aumento de temperatura durante el pulso en la lisina de tejido. ( B ) Tabla que muestra los principales tipos de proteínas IF presentes en los diferentes tejidos y su peso molecular predicho como referencia para el panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: MoleculAr y las diferencias bioquímicas en queratinas hepáticas de ratones jóvenes y viejos. ( A ) El análisis de ARNm de KRT8 y KRT8 usando un procedimiento estándar (Protocolo 1) revela una inducción significativa en el transcrito de KRT8 en los hígados de ratones viejos. N = 6 para cada condición (se utilizaron 3 ratones CBA machos y 3 hembras por grupo). ** p & lt; 0,01; ANOVA unidireccional. ( B ) Se obtuvieron lisados ​​hepáticos totales de 3 ratones CBA machos jóvenes (3 meses de edad) y 3 machos adultos (24 meses de edad) usando el Protocolo 2 y las muestras se analizaron en condiciones no reductoras. Se utilizó anticuerpo TS1 para investigar la expresión de K8 y se utilizó tinción de proteína basada en Coomassie como control de carga. ( C ) Extractos de alta sal de hígados de ratón jóvenes y viejos, correspondientes a los ratones # 1 y # 4, respectivamente del panel B. Las dos flechas apuntan a K8 y K18 en el gel y la caja roja indica la parte del gel que fue Se extirparon y se sometieron para análisis de espectrometría de masas. D Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Diferencias moleculares y bioquímicas en GFAP del cerebro de ratones jóvenes y viejos. ( A ) El análisis de ARNm de GFAP usando procedimiento estándar (Protocolo 1) revela inducción significativa en los cerebros de ratones viejos. N = 6 para cada condición (se utilizaron 3 ratones CBA machos y 3 hembras por grupo). ** p & lt; 0,01; ANOVA unidireccional. ( B ) tinción de proteína basada en Coomassie de fracciones Triton X-100 y HSE de tejido cerebral de ratón joven (3 meses) y viejo (24 meses). Obsérvese el aumento de la banda GFAP de ~ 50 kDa en HSE del cerebro antiguo (flecha). ( C ) GFInmunotransferencia de AP (monoclonal de ratón, clon GA5) de las mismas muestras que el panel B. ( D ) Immunotransferencia de acetil-lisina (policlonal de conejo, Abcam ab80178) de las mismas muestras que en el panel B. Lisina. Las muestras se analizaron en condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R) y las flechas apuntan a aumentar la presencia de GFAP en el inmunoprecipitado del cerebro antiguo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos que permiten la caracterización bioquímica de las proteínas IF pueden ser útiles para entender numerosos fenómenos fisiopatológicos en los sistemas de mamíferos, ya que las proteínas IF son a la vez marcadores y moduladores del estrés celular y tisular 29 . El principio detrás del método actual se basa en los procedimientos iniciales desarrollados en los años 70 y 80 para aislar, separar y reconstituir las proteínas IF de las células y tejidos, empleando generalmente soluciones de sales bajas y altas y detergente Triton-X100 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . Para una visión histórica de los estudios que apoyaron el aislamiento bioquímico de las proteínas de IF, por favor consulte revisiones recientes 36 , 37 . El método actualSe basa en los protocolos más recientes desarrollados para el estudio de queratinas epiteliales simples [ 26] . La ventaja del método es que puede servir como un paso inicial para permitir a los investigadores que son nuevos en el campo IF aislar eficazmente las proteínas IF de la mayoría de los tejidos de mamíferos. Representa una guía visual de procedimientos relacionados que son ampliamente utilizados por los investigadores en el campo para estudiar la regulación de la proteína IF 21 , 38 .

Esta técnica puede utilizarse para estudiar la regulación y la función de las IF en los mecanismos de comunicación de estrés entre los tejidos de mamíferos [ 39 , 40] . Está siendo bien apreciado que el estrés en un tejido puede afectar el funcionamiento de otros tejidos, por ejemplo bajo condiciones de estrés nutricional 41 , de plegamiento de proteínas 42 , de estrés metabólico 43 y de otrasCambios. Es de notar que la mayor parte del trabajo que se está realizando actualmente en esta área está en los modelos de Drosophila y C. elegans , mientras que los estudios sobre respuestas de estrés generalizadas en sistemas de mamíferos están faltando. Como el principal regulador del estrés celular 10 , el sistema de FIS puede desbloquear claves a respuestas de estrés a nivel de organismo, lo que puede tener implicaciones importantes para la enfermedad. Como tal, el protocolo actual se puede utilizar para estudiar los mecanismos fisiopatológicos globales en varios modelos de ratón de estrés, lesiones y enfermedades.

Una limitación de la técnica actual es que los extractos de alta sal son considerados preparaciones de "crudo" de IF puesto que también contienen otras proteínas asociadas a IF, tales como plectina por ejemplo 44 . Como se ha mostrado anteriormente, los HSE pueden desnaturalizarse en tampón de urea 8 M para obtener proteínas IF altamente puras que son capaces de reensamblarse in vitro en tampón fosfato 44 . Después de dos ciclos deDesmontaje y re-ensamblaje, la estequiometría de IF proteínas (aisladas de células HeLa) se mantuvo el mismo, mientras que el tratamiento con urea eliminado plectin [ 44] . Durante la purificación de desmina, la actina puede eliminarse por solubilización del HSE en ácido acético 45 . La inclusión de etapas adicionales de purificación depende del objetivo final del experimento. Por ejemplo, si el objetivo es caracterizar el estado de ensamblaje y generar IFs reconstituidas in vitro, se requiere la etapa de urea para obtener proteínas IF altamente puras. Por otro lado, si el objetivo es identificar asociaciones dependientes del contexto entre las IF y otras proteínas celulares, entonces se pueden usar los preparados "crudos". Las proteínas que interactúan se pueden identificar mediante espectrometría de masas utilizando digestión en gel para objetivos de alta abundancia visibles mediante tinción de gel o en digestión en solución para blancos de baja abundancia. Estudios previos utilizando inmunoprecipitación de IFs y HSEs solubles en detergentesQue contienen proteínas IF identificadas interacción específica funcionalmente importante entre las queratinas 8/18 y la proteína de choque térmico 70 (Hsp70), que se potencia después del estrés térmico 46 , la proteína adaptadora 14-3-3 después de la fosforilación 47 y K8 / K18 Raf-1 quinasa Bajo condiciones fisiológicas normales 48, entre otros. El protocolo actual puede permitir estudios similares sobre otras proteínas IF.

El uso de la matriz de lisis es una modificación clave de los métodos anteriores y debería permitir la extracción rápida de las IF de múltiples tejidos, con la excepción del páncreas y el bazo. La automatización de los pasos iniciales puede ser particularmente útil para experimentos de ratón de alto volumen. Por ejemplo, el aislamiento de las proteínas IF de 3 tejidos diferentes de 10 ratones por condición ( por ejemplo, normal y alguna forma de estrés o enfermedad sistémica) requerirá el procesamiento de 60 tejidos individuales. Usando el método manual tradicional este woUld necesidad de hacerse en lotes y puede tomar varios días. Sin embargo, utilizando el método automatizado con matriz de lisis, el procedimiento se puede hacer en pocas horas. Los pasos críticos del procedimiento incluyen: asegurar que la muestra permanezca fría durante todo el procedimiento; Incubación en tampón salino alto durante 1 h (etapa 4.5); Utilizando un tampón caliente y un vórtex extensivo para asegurar la resuspensión completa del gránulo antes del análisis (etapa 4.8); Y tomando todas las precauciones para evitar la contaminación de las muestras a analizar por espectrometría de masas (paso 7.2).

El principal inconveniente de la espectrometría de masas basada en la identificación de sitios PTM es que funciona muy bien para ciertos PTMs - fosforilación y acetilación de lisina son ejemplos principales -, pero otros, como sumoylation son mucho más difícil 49 . Sin embargo, la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la regulación de proteínas en tejidos normales y enfermos. Agnetti et al. Compilado un exhaustivo-to-fecha de las técnicas proteómicas de vanguardia actualmente en uso para estudiar varios PTMs en el contexto de tejido de proteínas expresadas [ 50] . El propósito del método actual es generar muestras que se pueden aplicar para diferentes tipos de análisis. Por ejemplo, se puede realizar sumoylation in vitro sobre proteínas IF inmunoprecipitadas, y la sumoylación total puede evaluarse en IF aisladas en preparaciones HSE utilizando anticuerpos sumo-específicos 18 , 21 . Por lo tanto, la aplicación de este método no se limita a la generación de muestras sólo para el análisis de espectrometría de masas, pero puede utilizarse para sondear múltiples IF propiedades utilizando una variedad de técnicas aguas abajo.

IF proteínas están ampliamente regulado por numerosos PTMs en sitios conservados, lo que resulta en la solubilidad alterada, el montaje de filamentos, y las interacciones de proteínas [ 17] . Los recientes avances tecnológicos hanLa magnitud increíble, la complejidad, y la importancia de la enfermedad de post-translational modificaciones (PTMs) en las proteínas celulares [ 51 , 52 , 53] . El mejoramiento de los métodos de detección para las PTM comunes, como la fosforilación 54 y la acetilación 51 , han dado vastos catálogos de datos, pero comprender su significado biológico - agrietarse el "código PTM" - es un reto importante restante 55 , 56 . Una forma de evaluar los roles funcionales y la importancia relativa de cada PTM es determinar qué tan bien se conserva a través de múltiples miembros de la familia de proteínas IF. Por ejemplo, la identificación de un nuevo sitio de fosfo-tirosina en K8 reveló que este sitio está contenido dentro de un motivo QYE que se encuentra esencialmente en todas las proteínas citoplásmicas IF y es crítico para regular la solubilidad y el filamento dyNamics 57 . Es importante destacar que la mutación del residuo de tirosina conservado en GFAP a un ácido aspártico "fosfomímico" cargado negativamente (Y242D) causa la enfermedad de Alexander 58 . Los datos representativos demostrados aquí demuestran cómo dos tipos diferentes de proteínas específicas de tejido específico (K8 y GFAP) experimentan un patrón similar de upregulation y acetilación aumentada durante el envejecimiento, que puede ser un efecto de metabolismo alterado [ 22 , 51] . Este ejemplo ilustra la utilidad del método para comprender la función de las proteínas IF a escala fisiológica global.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el NIH otorga NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], y P30 DK034987 [a UNC-Chapel Hill]. Los autores agradecen a Deekshita Ramanarayanan por su ayuda con los experimentos de qPCR y western blot.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

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Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento
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Battaglia, R. A., Kabiraj, P.,… More

Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

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