Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Bu yöntemde, birden fazla fare dokusundan ara fılaman (IF) proteinlerinin hızlı ve etkin izolasyonu için biyokimyasal prosedürler sunulmaktadır. İzole edilmiş IF'ler, kütle spektrometresi ve diğer biyokimyasal testlerle translasyon sonrası modifikasyon değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.

Abstract

Orta filamentler (IF), aktin filamentleri ve mikrotübüller ile birlikte, her hücrenin kritik bir yapısal öğesi olan hücre iskeletini oluştururlar. Normal işleyen IF'ler mekanik ve stres direnci hücrelere neden olurken, işlevsiz bir IF sitoskeletonu hücresel sağlığa zarar verir ve birçok insan hastalıklarıyla ilişkilendirilmiştir. Translasyon sonrası modifikasyon (PTM), fizyolojik değişikliklere ve stres koşullarına bağlı olarak IF dinamiklerini eleştirel olarak düzenler. Bu nedenle, IF'lerin PTM imzasındaki değişiklikleri izleyebilme özelliği, IF sisteminin hücresel yaralanma sırasında bir stres tepkisi olarak daha iyi bir fonksiyonel anlayışa ve nihai olarak şartlandırılmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, 70'den fazla bireysel gen tarafından kodlanan ve dokuya bağlı bir şekilde ifade edilen çok sayıda IF proteini, farklı PTM'lerin göreli önemini belirlemede önemli bir zorluktur. Bu amaçla IF proteinleri üzerinde PTM'lerin izlenmesini sağlayan yöntemlerAilenin izole edilmiş üyeleri yerine bir organizma genelinde bu alanda araştırma ilerlemesini hızlandırabilir. Burada, 9 değişik fare dokusundan (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, ince bağırsak, kalın bağırsak, pankreas, böbrek ve protein) IF proteinlerinin toplam, deterjana özülebilir ve deterjana dirençli fraksiyonunun izolasyonu için biyokimyasal yöntemler sunuyoruz. dalak). Ayrı bir fare dokusunun lizing matrisi ve otomatik homojenizasyonunu kullanarak IF proteinlerinin hızlı izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol daha ortaya koyduk. Otomatik protokol, yüksek numune hacmi olan deneylerde (birden çok hayvanı ve deney grubu içeren hastalık modellerinde olduğu gibi) IF'leri profillemek için kullanışlıdır. Ortaya çıkan numuneler, kütle spektrometresi tabanlı PTM profillemesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akım analizleri için kullanılabilir. Bu yöntemleri kullanarak, farklı fare dokularındaki (beyin ve karaciğer) IF proteinlerinin ekspresyonlarına paralel olarak değiştiğini gösteren yeni veriler sunmaktayızYaşlanma esnasında serum düzeyleri ve PTM'ler.

Introduction

IF'ler, insanlarda 73 gen ile kodlanan ve altı ana tipte sınıflandırılan protein ailesidir: I-IV tipleri sitoplazmiktir ( örn., Epitelyal ve saç keratinleri (K), miyosit desmin, nevrofilamentler, glial fibriler asidik protein (GFAP) ve diğerleri); V tipi nükleer lamindir; Ve tip VI, göz mercekinde 1 IF'lerdir. Moleküler organizasyonları bakımından, IF proteinleri üç ortak alana sahiptir: yüksek oranda korunmuş sargılı bobin çubuk alanı ve küresel "baş" ve "kuyruk" alanları. IF protein tetramers, mekanik koruma 2 , stres algılama 3 , 4 , transkripsiyon regülasyonu 5 ve büyüme ve diğer kritik hücresel fonksiyonlarla ilgili olan dinamik sitoskelet ve nükleoskelet yapılarını şekillendiren olgun filamentlere dahil olan kısa filament öncüleri oluşturmak üzere bir araya gelir."1 , 6 , 7 .

IF sisteminin işlevsel önemi, nöropatiler, miyopati, cilt kırılganlık bozuklukları, metabolik işlev bozuklukları ve erken yaşlanma sendromları gibi IF genlerinde missense mutasyonlarının yol açtığı birçok insan hastalıklarının varlığı ile vurgulanır. Bazı IF geni mutasyonları neden olmaz, ancak taşıyıcılarını karaciğer hastalığında basit epitel keratin gibi hastalığın ilerlemesine yatkın hale getirir. İkincisi, epitelde IFN'lerin kritik stres koruyucu işlevlerinden kaynaklanmaktadır. Genel olarak IF'ler bazal koşullar altında en bol hücresel proteinler arasındadır, ancak çeşitli stres türleri boyunca daha da kuvvetle uyarılırlar10. Örneğin, nematod C. elegans'daki proteom çapındaki değişiklikleri değerlendiren son çalışmalar, çoklu IF'lerin yüksek şekilde düzenlendiğini ve aga eğilimli olduğunu ortaya koymuşturOrganizmal yaşlanma sırasında 11 , 12 . Uygun bir IF yapısının idame ettirilmesi, çeşitli stres biçimlerine karşı hücresel direnç için zorunlu olduğu için, IF agregasyonu yaşlanma sırasında işlevsel düşüşe katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, stres yaşayan farklı dokularda birden fazla memeli IF proteinini inceleyen organizma düzeyinde çalışmalar bulunmamaktadır.

IF'ler, hücresel talepleri karşılamak için adapte olmuş dinamik yapılardır. Örneğin, Keratinler, çözünebilir (lifsiz) ve çözünmeyen (lifli) protein havuzu 13 arasında biyosentezden bağımsız bir şekilde geçiş yapmaktadır. Normal fizyolojik koşullar altında, toplam K8 / K18 havuzunun deterjan içermeyen tamponda yaklaşık% 5 oranında ekstrakte edilebileceği, non-iyonik deterjan Nonidet P-40'da çözünür hale getirilebilecek yaklaşık% 20'ye kıyasla biyokimyasal olarak Triton- X100 14 , 15 yaş üstü. Mitoz sırasında basit tip epitelyal K8 ve K18 14'ün çözünürlüğünde dikkate değer bir artış vardır; bu, epidermal keratinlerde daha az belirgindir, ancak vimentin ve diğer tip III IF proteinleri 15 , 16'da daha belirgindir. IF proteinlerinin çözünürlük özellikleri, filament yeniden düzenlenmesi ve çözünürlüğü için anahtar post-translasyonel modifikasyon (PTM) olan fosforilasyon ile sıkıca düzenlenir 17 , 18 , 19 , 20 . Çoğu İE, korunan alanlarda bir dizi PTM tarafından kapsamlı bir düzenleme altına girer ve işlevsel değişikliklerle sonuçlanır 17 .

Bu yöntemin amacı IF alanında yeni araştırmacılar ile IF fare dokularında IF proteinlerinin çalışılması için biyokimyasal ekstraksiyon ve analitik yöntemler getirmektir. ÖzelMüttefik olarak, yüksek tuz ekstraksiyon yöntemiyle IF proteinlerinin izole edilmesine ve kütle spektrometresi ve PTM hedefleyen antikorlar vasıtasıyla PTM'lerin değişimlerinin değerlendirilmesine odaklanıyoruz. Bu yöntemler, önceden yayınlanmış prosedürleri 21 üzerine inşa etmekte ancak IF ailesinde düzenleme için ortak mekanizma ortaya çıkarmak için farklı IF protein tiplerini çıkarmak için değişiklikler içermektedir. Örneğin, belirli bir lisin kalıntısındaki K8 asetilasyonu filament organizasyonunu düzenlerken, hiperazetillenme K8 çözünmezliğini ve agregat oluşumunu teşvik eder 22 . Yakın zamanda yapılan küresel proteomik profil çalışmaları, dokuya özgü IF proteinlerinin çoğunun aynı zamanda asetilasyon hedefi olduğunu ve çoğu IF asetilasyon sahasının yüksek oranda korunmuş çubuk alanıyla sınırlandırıldığını ortaya koymuştur. Bu, IF sisteminin küresel profillemesi için uygun yöntemlere duyulan ihtiyacın altını çizer. Opti'de otomatik homojenizasyon kullanarak çok sayıda dokudan IF proteinlerini izole etmek için hızlı bir yöntem de sunuyoruzMized lysing matrisi. Elde edilen müstahzarlar, kütle spektrometrisi ve diğer metotlar ile aşağı akım PTM analizi için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol, Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.

1. Preparatlar

  1. Triton-X tamponu (% 1 Triton X-100, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde hacim getirin). 500 mL yapmak için: Triton X-100 ve 500 mM EDTA'dan her biri 5 mL, 490 mL PBS'ye, pH 7.4'e karıştırın. Triton-X tampon çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  2. Yüksek Tuz Tamponu (10 mM Tris-HC1, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCI, 5 mM EDTA,% 0.5 Triton X-100, çift damıtılmış (dd) H20 ile hacim getirin) hazırlayın. 500 mL yapmak için: 10 mL 0.5 M Tris-HC1 (pH 7.6), 14 mL 5 M NaCI, 55.9 g KCI, 5 mL 0.5 M EDTA ve 2.5 mL Triton X-100 karıştırın, hacmi 500'e ayarlayın ML, çift damıtılmış su kullanılarak). Yüksek Tuz Tamponu çözeltisini 4 ° C'de saklayın.
  3. Kullanımdan hemen önce, uygun bir miktarda Triton-X ve Yüksek Tuz Tamponu (
  4. 1 x PBS, pH 7.4 içinde 5 mM EDTA hazırlayın. 500 mL yapmak için: 5 mL 0.5 M EDTA, 495 mL 1x PBS (pH 7.4) içine karıştırılır.
  5. Veteriner kılavuzlarına ve kurumsal standartlara uygun onaylanmış protokolleri kullanarak farklı fare organlarını (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, pankreas, kolon, bağırsak, böbrek, dalak) izole edin 23 . Doku toplama prosedürü, proteaz bakımından zengin dokuların RNA ve protein bütünlüğünü korumak için ( örneğin pankreasın ilk önce işlenmesi gerekir) 5 dakikayı aşmamalıdır.
  6. İleriki RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve IF gen ekspresyonu için nicel gerçek zamanlı PCR analizi için az miktarda doku (~ 5-20 mg) kesin ve RNA depolama çözeltisine yerleştirin. RNA depolama çözeltisi tüplerini gece boyunca 4 ° C'de doku ile birlikte yerleştirin ve daha fazlaToraj ve izolasyon adımları.
  7. Doku geri kalanını daha küçük parçalara ( örneğin 0.5 cm) kesin ve cryovial içine yerleştirin. Viyalleri -80 ° C'de veya sıvı azot ile sıkıca tutun ve depolayın, daha uzun süreli depolama için.

2. IF Gen İfade Analizi

  1. RNA depolama çözeltisi reaktifinde saklanan dokulardan RNA'yı çıkarın. Üreticinin protokolüne göre herhangi bir uygun / tercih edilen RNA ekstraksiyon yöntemini kullanın.
  2. RNA konsantrasyonunu ölçün ve üreticinin protokolüne göre uygun bir ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA üretmek için 2 μg RNA kullanın.
  3. Üretilen cDNA ve fare IF genine spesifik primerler kullanılarak, her örnekteki üç teknik kopyalama ve üreticinin protokolüne göre boş kontrol içeren qPCR reaksiyonları oluşturuldu.
  4. IF gen ekspresyonunu, farklı koşulları ( örneğin genç yaşlı dokuya kıyasla) karşılaştırarak katlama değişimi olarak nicelendirin.

3. PImmunoblot için Toplam Doku Lizatlarının Tazmini

  1. 1 mL 2x azaltılmayan SDS numune tamponunda 25 mg doku homojenize edin. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir kolorimetrik protein deneyi yapılacaksa örnek tamponundan bromofenol mavisi boyası atın.
  2. İndirgenmiş numuneler yapmak için% 5 (v / v) 2-merkaptoetanol (2-ME) ilave edin. İndirgeyici olmayan örneklerin 200 μL'sine 10 μL 2-ME ekleyin.
  3. Deterjan ve indirgeme ajanı ile uyumlu protein deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Boya, numune tamponuna zaten dahil edilmişse, protein miktarı, Coomassie esaslı leke 24 de dahil olmak üzere çeşitli teknikler yoluyla bir jel çalıştırıldıktan sonra tahmin edilebilir.
  4. Tüm örnekleri vorteksleyin ve 95 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  5. Hem indirgeyici hem de indirgeyici olmayan koşullar altında western blotlama yapın. Monomerik türlerin ortaya çıkması için maruz kalma zarını kısa bir süre (<1 dak) ve yüksek moleküler kütle kompleksleri içeriğini ortaya çıkarmak için daha uzun (> 1 dk.)IF proteinleri. Toplama izlenmesi halinde, tüm jel / membranı inceleyin (jel kuyularının dipleri dahil).
  6. Paralel bir jel çalıştırın ve yükleme kontrolü olarak protein lekesi ile leke 24 . Hastalık modellerinde veya yaralanma deneylerinde toplam protein lekesi, farklı stres koşulları altında değiştiği için, 'oda temizliği' proteinleri ( örn., Aktin, GAPDH) için immünoblotlara karşı bir yükleme kontrolü olarak kullanılmalıdır.

4. Dokuya Özgü IF'lerin Deterjanlarda Çözünür ve Yüksek Tuzlu Eksiklerinin Hazırlanması

  1. 1 mL buz gibi Triton X-100 tamponunu bir cam tüp homojenleştiricisine ilave edin ve buz üzerine yerleştirin.
  2. Sıvı nitrojen deposundan küçük bir doku parçasını (~ 25 mg) çıkartın ve doğrudan cam homojenleştiriciye yerleştirin. Homojenleştirmek (50 vuruş) için bir politetrafloroetilen havlu kullanın ve kabarcık oluşumunu önleyin. Homojenizatörü ve lizatını her zaman soğuk tutun.
  3. Lizatı bir 1.5 mL micr'ye aktarınBuz üzerinde osantrifüj tüpü ve önceden soğutulmuş santrifüjde (4 ° C) 10 dakika süreyle 20,000 xg'deki santrifüj.
  4. Süpernatant fraksiyonunu ayrı bir tüp içine alın. İmmünopresipitasyon (ip) ve IF proteinlerinin deterjana-çözünür havuzunun analizi için kullanılabilen Triton X çözünür fraksiyonu. Beyin dokusundan daha temiz bir IF çıkarımı elde etmek için 4.1-4.4 adımlarının tekrarlanabileceğini unutmayın.
  5. 1 mL Yüksek Tuz Tamponunu doku peletine ilave edin, temiz bir homojenleştiriciye aktarın ve 100 darbeden kurtulun. Homojenat'ı tekrar mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüp, soğuk odada 1 saat boyunca dönen bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  6. Homojenatları 20,000 xg'de 20 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  7. Pelete 1 mL buz soğukluğundaki PBS / EDTA tamponunu ilave edin ve son bir temizleme aşaması olarak temiz bir homojenleştiricide pelleti homojenize edin (20 vuruş) *. Yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle 20.000 xg'da santrifüj ederek IF protein-Zengin yüksek tuzlu ekstrakt (HSE).
    * İsteğe bağlı olarak, bu adımda homojenleştirme yerine girdap.
  8. Süpernatantı atın ve önceden ısıtılan 300 μL azaltılmayan SDS numune tamponu içindeki peletleri eritin. Peleti başlangıçta pipetleme ve vorteksleme ile parçalayın ve daha sonra numuneleri 95 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  9. Pelet sağlamak için girdap ve pipet eritilir. Pelletlerin tamamen çözülmesi birkaç dakika sürebilir.
  10. Analiz edilene kadar tüm numuneleri -20 ° C'de saklayın.

5. Yüksek hacimli Deneylerde IF Protein Ekstraksiyonu için Otomatik Doku Lizisi

  1. RNA ekstraksiyonu için, parçalama matrisi D (küçük seramik küreler kullanır) içeren bir tüp içine lizis tamponu (25 mg doku başına 600 μL tampon) yerleştirin ve doku lizerinde 25 sn süreyle iki kez nabız atın. 20.000 xg'de santrifüj ederek lisatı matristen ayırın ve izole olarak bir sonraki aşamaya geçin.
  2. Protein ekstraksiyonu için, Trit'i yerleştirin.(Ya da toplam lizat hazırlıyorsa SDS numune tamponu) SS lising matrisi bulunan bir liz tüpünde (tek bir paslanmaz çelik boncuk kullanınız). Birden çok matrisi test ettikten sonra bu seçildi, çünkü geleneksel douncing yöntemi ile benzer kalitede IF protein özleri üretti. Otomatik yöntemin pankreas ve dalak için optimal olmadığını ve bu dokular için standart homojenleştirme protokolünün kullanılması gerektiğini unutmayın.
  3. Yüksek Tuzlu Ekstraktın hazırlanmasına devam etmek için, bir mıknatıs kullanarak borudaki paslanmaz çelik boncuğu çıkarın ve tüpleri 20,000 xg'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  4. El ile protokolün 4. adıma (yukarıdaki) devam edin.
  5. Analiz edilene kadar tüm numuneleri -20 ° C'de saklayın.

6. Translasyon sonrası modifiye edilmiş IF proteinlerinin immüno-zenginleştirilmesi

  1. PBST tamponu (PBS içinde% 0.02 Tween-20) hazırlayın. 50 mL yapmak için 10 mL Tween-20, 50 mL PBS, pH 7.4 ekleyin.
  2. PTM antikorunu hazırlayınSolüsyonu (200 uL PBST içinde 1-10 ug antikor). Genel olarak, 3 μg antikor / reaksiyon, gerekirse daha da optimize edilebilecek iyi bir başlangıç ​​koşuludur.
  3. Her reaksiyon için, bir mikrosantrifüj tübüne manyetik boncukların 50 mcL'si alınır, mıknatısa yerleştirilir ve boncuk saklama çözeltisini aspire edin.
  4. Antikor çözeltisinde yeniden askıya alınarak ve rotatöre (küçük hacimlerin karıştırılmasını sağlamak için uçtan uca) inkübe edilerek 20 dakika boyunca oda sıcaklığında boncuklar immüno çökeltme antikoruna konjuge edin.
  5. Tüpleri mıknatısa yerleştirin ve antikor çözeltisini aspire edin.
  6. Antikor-konjüge boncuklar bir kez 200 mcL PBST durulayın ve yıkama tamponu kaldırın.
  7. Boncuklara 0.6-1 mL doku lisatı ilave edin, nazik pipetleme ile karıştırın ve rotatorda soğuk bir odada 3 saat inkübe edin.
  8. Tüpleri mıknatısa yerleştirin, lisatı çıkarın ve boncukları PBST'nin 200 μL'si ile beş kez yıkayın. Son yıkama adımından sonra boncukları 100 _6; L PBS (Tween-20 yok) ve temiz yeni bir tüpe aktarın. Boruyu mıknatısa yerleştirin.
  9. PBS'yi aspire edin ve 100 μL'lik indirgenmeyen numune tamponu ekleyin. İndirgeme örnekleri yapmak için 50 μL'yi çıkarın ve 2-ME (% 5) ekleyin. Numuneleri 95 ° C'ye 5 dakika ısıtın.
  10. İP parçasını mıknatıs üzerindeki boncuklardan ayırın ve yeni bir tüp içine alın.
  11. Analiz edilene kadar örnekleri -20 ° C'de saklayın.

7. Kütle Spektrometresi Analizinde IF protein numunelerinin hazırlanması

  1. Kütle spektrometri analiziyle ilgili önemli zaman ve maliyet olduğundan, bir çalışma başlatmadan önce bir proteomik uzmanı ile bir istişarede bulunun.
  2. Kirlenmeyi önlemek için özel tedbirler alın. Tüm jelleri temiz eldivenlerle tutun ve temiz kaplarla inkübe edin, sadece ddH2O kullanarak yıkayın (sabuntan kaçının).
  3. Standart koşullara göre bir SDS-PAGE jelinde 20-50 μL HSE örneğini (Bölüm 4 ve 5'ten) çalıştırın. Bir protein lekesi ile 1 saat boyayın. Birkaç kez durulayın ve gece boyunca ddH2O de leke temizleyin. IF protein bantları lekelemeden sonra kolayca görülebilir olmalıdır.
  4. Jeli plastik tabaka koruyucuların arasına yerleştirin, eksize edilecek ve analiz için gönderilecek bantları tarayın ve işaretleyin.
  5. IF protein bantlarını yeni bir temiz tıraş bıçağı kullanarak ayırın.
  6. Jel bantlarını temiz mikro santrifüj tüplerine yerleştirin ve bir kütle spektrometresi tesisine nakledin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lizing matrisi kullanarak birden çok fare dokusundan IF proteinlerinin yüksek tuz esaslı ekstraksiyonu için yeni hızlı bir yöntem.

Orta fılamat protein fraksiyonunun hacmini epitel dokudan izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem 25,26 burada dokuz farklı organı ve doku lizisi için daha hızlı bir prosedürü içerecek şekilde değiştirildi. Geleneksel yöntem için 3 manuel homojenizasyon basamağı gerekliyken, modifiye edilmiş prosedür sadece 1 numune manuel homojenleştirme basamağına sahiptir, bu da prosedürü birkaç saatte kısaltır, özellikle 6 numuneden fazlasını işlerken. Şekil 1A , dokuda beklenen proteinlerin tablosu ve her proteinin molekül ağırlığı Şekil 1B'de gösterildiği gibi, 9 fare dokusundan alınan SEÇ'lerin tipik bir sonucunu göstermektedir.

Karaciğer K8 ve K18 kuvvetle yukarı doğru düzenlenir ve yaşlı farelerden gelen karaciğerlerde artmış fosforilasyon ve lisin asetillenmesine uğrar.

Şekil 2 , bu protokolde açıklanan birkaç analizin tipik sonuçlarını göstermektedir. Panel A karaciğerdeki iki ana IF geninin ekspresyon analizini , keratin 8 ( KRT8 )Ve sırasıyla IF proteinleri K8 ve K18'i kodlayan keratin 18 ( KRT18 ) bulunur. Epitel keratinleri, çeşitli stres koşulları altında kuvvetle yukarı doğru düzenlenmiştir. Gösterilen sonuçta , KRT8, 24 yaşında farelerin karaciğerlerinde 3 m'lik yaşlı fareler ile kıyaslandığında belirgin bir şekilde yukarı doğru düzenlendiğinden, bu yaşlanma sırasında gerçekleşir. Protein seviyesindeki sonuçlar, daha eski (24 m) karaciğerlerdeki K8 monomerinin yanı sıra yüksek molekül ağırlıklı komplekslerin dramatik bir şekilde artmasıyla gözlemlendiği üzere daha çarpıcıdır. Buradaki kuaför bazlı protein lekesi, örnek boyunca proteinlerin eşit yüklenmesini sağlamak için bir yükleme kontrolü görevi görür. Toplam doku lizatları ile, bu durumda olduğu gibi bir jel üzerinde proteinin aşırı yüklenmesinin kolay olduğunu unutmayın. Daha küçük bir hacim yüklenmesi veya numunenin sodyum dodesil sülfat (SDS) tamponunda daha da seyreltilmesi, bu problemi hafifletecektir (özellikle viskoz görünüyorsa ve pipetlemek zor ise). Panel C, karaciğerden gelen tipik bir sonucu göstermektedir. Yüksek Tuzlu Ekstre, otomatik protokol kullanılarak elde edilmiş demKeratin 8 ve 18'in jel üzerinde kuvvetli zenginleşmesini önledi. Kırmızı çizgiler, kesilen ve kütle spektrometresi analizi için gönderilen alanı sınırlar. D panelinde C panelindeki numunelerin kütle spektroskopi sonuçları, yaşlı karaciğerdeki K8 ve K18'in genç karaciğerde bulunmayan çok sayıda fosforilasyon ve asetilasyon bölgesine sahip olduğunu göstermektedir.

GFAP, eski farelerdeki beyinlerde kuvvetle yukarı doğru düzenlenmiş ve lisin asetile edilmiştir.

Şekil 3, IF'leri epitelden ekstrakte etmek için kullanılan yöntemlerin epitel dışı doku üzerinde de kullanılabileceğini göstermektedir. Dahası, sonuçlar IF genleri ve proteinlerin yaşlanmaya bağlı yukarı düzenlenmesi için genel bir model ortaya koymaktadır. Şekil 2A'daki qPCR sonucu, 3 m yaşlı fareler ile karşılaştırıldığında 24 m'lik farelerin beyinlerinde 5 katlık bir GFAP mRNA'sı indüksiyonu olduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 2BTriton X-100 fraksiyonunda ve IF-zenginleştirilmiş FSSE'de bulunan toplam proteinleri ortaya çıkarmaktadır. Eski beyindeki okla (GFAP'a karşılık gelir) işaretlenen 50 kDa'da bant yoğunluğundaki artışa dikkat edin. Şekil 2C'deki Western blot analizi ayrıca GFAP'ın upregülasyonunu ve Triton X-100 fraksiyonunda potansiyel yüksek moleküler kütle kompleksinin varlığını ortaya koymaktadır (her ikisi de oklarla işaretlenmiştir). Aynı örneklerin bir pan-asetil lisin antikoru ile Western lekeleme analizi, antikorun eski fare beyninin HSE'sinde ~ 50 kDa'da ve Triton X-100 fraksiyonunda ~ 250 kDa'da bir bandı tanıdığını gösterir ( Şekil 2D ). Triton X-100 fraksiyonlarından asetillenmiş proteinlerin immüno-zenginleştirilmesi, eski beyinden elde edilen lisatta artmış GFAP proteini varlığını ortaya çıkarmaktadır. İndirgeyici ve indirgeyici olmayan koşulların GFAP monomerini ve yüksek moleküler kütle komplekslerini vurguladığı gösterilmiştir. Kütle spektrometri analizi ( Şekil 1'e benzer

Şekil 1
Şekil 1: Birden fazla fare dokusundan otomatik liziz ve IF proteinlerinin ekstraksiyonu. ( A ) Belirtilen fare dokularından HSE'lerin kümes temelli jel lekesi. Gösterilen dokular aynı yetişkin (3 yaşlı) erkek CBA fare alındı. Numuneler, Bölüm 5'te açıklandığı gibi işlendi. Beyin : NFL, NFM ve NFH'nin ağırlıklı olarak fosforile edildiğini ve sırasıyla 70, 145 ve 200 kDa'da beklenenden daha yavaş göç ettiğini unutmayın. Kalp : Desmin ve vimentin'e karşılık gelen 53 kDa bandına ek olarak, kalp numuneleri, büyük ihtimalle desmin 28 ile birlikte saflaştırılacağı bilinen aktin'i temsil eden ~ 42 kDa bant içerir. LArge bağırsağı: K8 / K18 ile birlikte ekstrakte edilen 25 kDa üzerindeki belirgin bantların kimliği bilinmemekle birlikte, dokular geleneksel dounce homojenizatör metodu kullanılarak işlenirse bu bantlar mevcut değildir. Pankreas ve Dalak : Otomatik homojenizasyonun muhtemelen lizatın doku lizerlerindeki nabız boyunca az miktarda sıcaklık artışı hassasiyeti yüzünden dalaktan pankreas ve vimentin'den keratin izolasyonu için uygun olmadığını unutmayın. ( B ) Farklı dokularda bulunan ana IF protein tiplerini ve panel A için referans olarak tahmin edilen molekül ağırlığını gösteren tablo. Bu şekli daha büyük görmek için lütfen tıklayınız .

şekil 2
Şekil 2: MolekülAr ve karaciğer keratinlerinde genç ve yaşlı farelerdeki biyokimyasal farklılıklar. ( A ) Standart prosedürü (Protokol 1) kullanarak KRT8 ve KRT8 mRNA'sının analizi eski farelerdeki karaciğerlerde KRT8 transkriptinde önemli indüksiyonu ortaya koymaktadır. Her durum için n = 6 (grup başına 3 erkek ve 3 kadın CBA faresi kullanıldı). ** p <0.01; Tek yönlü ANOVA. ( B ) Toplam karaciğer lisatı, Protokol 2 kullanılarak 3 genç (3 aylık) ve 3 yaşlı (24 aylık) erkek CBA farelerinden elde edildi ve örnekler, indirgeyici olmayan koşullar altında analiz edildi. K8 ekspresyonu için TS1 antikoru kullanıldı ve yükleme kontrolü olarak Coomassie-bazlı protein lekesi kullanıldı. ( C ) Genç ve yaşlı fare karaciğerlerinden elde edilen, sırasıyla panel B'den farelere # 1 ve # 4 karşılık gelen yüksek tuz özleri. İki ok, jel üzerinde K8 ve K18'i işaret eder ve kırmızı kutu, jelin Kesilmiş ve kütle spektrometri analizi için gönderildi. ( D . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız .

Şekil 3
Şekil 3: Genç ve yaşlı farelerin beyindeki GFAP'teki moleküler ve biyokimyasal farklılıklar. ( A ) Standart prosedür (Protokol 1) kullanılarak GFAP mRNA'nın analizi, eski farelerdeki beyinde önemli indüksiyonu ortaya koymaktadır. Her durum için n = 6 (grup başına 3 erkek ve 3 kadın CBA faresi kullanıldı). ** p <0.01; Tek yönlü ANOVA. ( B ) genç (3 aylık) ve yaşlı (24 aylık) fare beyin dokusundan Triton X-100 ve HSE fraksiyonlarının Coomassie temelli protein lekesi. Yaşlı beyinden SEÇ'de ~ 50 kDa GFAP bandındaki artışa dikkat edin (ok). ( C ) GF( D ) Panel B'deki gibi aynı numunelerin asetil-lisin immünoblotu (tavşan poliklonal; Abcam ab80178). ( E ) asetil-laktam ile immüno-çökeltme sonrası immüno-blokerler ( F ) Lisin antikoru. Numuneler, azalmayan (NR) ve indirgenme (R) koşulları altında analiz edildi ve oklar, eski beyindeki immüno çöktürücüde GFAP varlığını arttırdılar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IF proteinlerinin biyokimyasal olarak tanımlanmasını sağlayan yöntemler, IF proteinleri hem hücresel hem de doku stresinin belirteçleri ve modülatörleri olduğu için, memeli sistemlerinde çok sayıda patofizyolojik olayı anlamak için yararlı olabilir. Mevcut yöntemin arkasındaki ilke, IF proteinlerini hücrelerden ve dokulardan izole etmek, ayırmak ve yeniden oluşturmak için 1970'lerde ve 1980'lerde geliştirilen başlangıç ​​prosedürlerine dayanmaktadır, bunlar genellikle düşük ve yüksek tuzlu çözeltiler ve Triton-X100 deterjan 25 , 30 , 31 , 32 kullanmaktadır , 33 , 34 , 35 . IF proteinlerinin biyokimyasal izolasyonunu destekleyen çalışmaların tarihsel içgörüsü için lütfen son değerlendirmelere bakınız 36 , 37 . Geçerli yöntemBasit epitel keratinleri 26 için geliştirilen daha yeni protokollere dayanmaktadır. Yöntemin avantajı, IF alanındaki yeni araştırmacıların, çoğu memeli dokudan IF proteinlerini etkin bir şekilde izole etmesini sağlamak için ilk adım olarak hizmet edebilmesidir. Alan araştırmacılar tarafından IF protein yönetmeliği 21,38 incelemek için yaygın olarak kullanılan ilgili prosedürlerin görsel bir rehberini temsil eder.

Bu teknik, memeli dokuları 39 , 40 arasındaki stres iletişim mekanizmalarındaki IF'lerin düzenlenmesini ve işlevini incelemek için kullanılabilir. Bir dokudaki stresin diğer dokuların işleyişini, örneğin beslenme stresinin koşulları 41 , protein misfolding 42 , metabolik stres 43 ve diğerleri altında etkileyebileceği iyi bilinmektedirDeğişiklikler. Dikkat çekin, bu alanda yapılan çalışmaların çoğu Drosophila ve C. elegans modellerinde yapılırken, memeli sistemlerinde yaygın stres tepkileri üzerine yapılan çalışmalar eksiktir. Hücresel stresin ana regülatörü 10 olarak IF sistemi, önemli hastalık etkileri gösterebilen organizma düzeyinde stres tepkileriyle ilgili ipuçlarını açabilir. Bu nedenle, mevcut protokol, çeşitli fare stres, yaralanma ve hastalık modellerinde küresel patofizyolojik mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Mevcut tekniğin bir kısıtlaması, yüksek tuzlu ekstraktların, örneğin plazma pektin gibi diğer IF ile ilgili proteinleri de içerdikleri için "ham" IF preparatları olarak kabul edilmesidir. Daha önce gösterildiği gibi, HSE'ler, fosfat tamponunda 44 in vitro yeniden birleştirilebilen yüksek seviyede saf IF proteinleri elde etmek için 8 M üre tamponunda denatüre edilebilir. Böyle iki döngüden sonraDemonte ve yeniden birleştirildiğinde, IF proteinlerinin stokiyometrisi (HeLa hücrelerinden izole edilmiş) aynı kaldı, oysa üre işlemi pektin 44'ü kaldırdı. Desmin saflaştırması sırasında, aktin, asetik asit 45 içerisinde HSE'nin çözünürleştirilmesi yoluyla uzaklaştırılabilir. Ek saflaştırma adımlarının dahil edilip edilmeyeceği, deneyin nihai hedefine bağlıdır. Örneğin, amaç, montaj durumunu karakterize etmek ve in vitro sulandırılmış IF'ler üretmek ise, üre basamakının saf saf IF proteinlerini elde etmek için gereklidir. Öte yandan, eğer IF IF'ler ve diğer hücresel proteinler arasındaki bağlam-bağımlı ilişkileri tanımlamak ise "ham" preparatlar kullanılabilir. Etkileşen proteinler, jel lekesi tarafından görülebilen yüksek miktarda hedefler için in-jel digest veya düşük bereketli hedefler için in-solution digest kullanarak kütle spektrometresi ile tanımlanabilir. Deterjan çözünür IF'lerin ve HSE'lerin immüno çökeltisini kullanan önceki çalışmalarIçeren IF proteini, ısı stresinden 46 sonra güçlendirilen ısı şok proteini 70 (Hsp70) ile fosforilasyon sonrası adaptör proteini 14-3-3 ve K8 / K18 Raf-1 kinaz Normal fizyolojik koşullar altında 48 diğerleri arasında. Mevcut protokol, diğer IF proteinleri üzerinde benzer çalışmaları sağlayabilir.

Lizing matrisinin kullanımı önceki yöntemlerden önemli bir değişiklik olup, pankreas ve dalak haricinde IF'lerin birden çok dokudan hızlı bir şekilde çıkarılmasına izin vermelidir. İlk adımların otomasyonu, yüksek hacimli fare deneyleri için özellikle faydalı olabilir. Örneğin, IF proteinleri, durum başına 10 fareden 3 farklı dokudan izole edilir ( örn. Normal ve bazı sistemik stres veya hastalık formları), tek tek 60 dokunun işlenmesi gerekecektir. Geleneksel elle kullanılan yöntemi kullanarak bunuUld grup halinde yapılması gerekir ve birkaç gün sürebilir. Bununla birlikte, lizing matrisi ile otomatik yöntemi kullanarak, prosedür sadece birkaç saat içinde yapılabilir. Prosedürün kritik basamakları şunları içerir: Numunenin prosedür boyunca soğuk kalmasını sağlama; Yüksek tuzlu tamponda 1 saat kuluçka (adım 4.5); Analizden önce peletin tamamen yeniden süspansiyon haline getirilmesini sağlamak için sıcak tampon ve geniş vorteksleme (adım 4.8); Ve analiz edilecek numunelerin kütle spektrometresi ile bulaşmasını önlemek için tüm önlemleri almak (basamak 7.2).

PTM alanlarının kütle spektrometresine dayalı tanımlanmasının en büyük dezavantajı, belli PTM'ler için çok iyi çalışmasıdır - fosforilasyon ve lisin asetilasyonu asal örnektir - ancak sumoilasyon gibi diğerleri daha da zorlayıcıdır. Bununla birlikte, proteomik, normal ve hastalıklı dokularda protein regülasyonunun çalışılması için güçlü bir araçtır. Agnetti ve ark. Kapsamlı bir derlemeDoku ile ifade edilen proteinler 50 bağlamında çeşitli PTM'leri incelemek için halen kullanılmakta olan en ileri proteomik teknikler hakkında güncel bir bakış. Mevcut yöntemin amacı farklı analiz türleri için uygulanabilen örnekler oluşturmaktır. Örneğin, in vitro olarak sumoilasyon, bağışıklık çökeltilmiş IF proteinleri üzerinde gerçekleştirilebilir ve toplam sumoilasyon, sumo'ya özel antikorlar 18 , 21 kullanılarak HSE preparatlarında izole edilmiş IF'ler üzerinde değerlendirilebilir. Bu nedenle, bu yöntemin uygulanması, yalnızca kütle spektrometresi analizi için numuneler üretmekle sınırlı değildir, çeşitli aşağı akım teknikleri kullanılarak birden fazla IF özelliğini araştırmak için kullanılabilir.

IF proteinleri, muhafaza edilen yerlerde sayısız PTM'ler tarafından geniş ölçüde düzenlenir ve çözünürlük, filament montajı ve protein etkileşimleri değiştirilir ( 17) . Son teknolojik gelişmeler açıklandı tHücresel proteinler 51 , 52 , 53 üzerinde post-translasyonel değişikliklerin (PTM'ler) inanılmaz büyüklüğü, karmaşıklığı ve hastalık önemi. Fosforilasyon 54 ve asetilasyon 51 gibi ortak PTM'ler için saptama yöntemlerinde iyileşme, geniş veri katalogları üretti, ancak "PTM kodunu" çatlatarak biyolojik anlamlarını anlama 55 , 56 önemli bir sorundur. Fonksiyonel rollerini ve her PTM'nin göreli önemini değerlendirmenin bir yolu, IF proteini ailesinin birden fazla üyesinde ne kadar iyi korunduğunu belirlemektir. Örneğin, K8 üzerinde yeni bir fosfo-tirosin alanının belirlenmesi, bu alanın esas itibariyle tüm sitoplazmik IF proteinlerinde bulunan ve IF protein çözünürlüğünü ve filament dy'sini düzenleyen kritik bir QYE motifi içerdiğini ortaya çıkarmıştırNamellik 57 . Önemlisi, GFAP üzerindeki korunmuş tirozin kalıntısının negatif yüklü bir "fosfomimik" aspartik asit (Y242D) mutasyonu, Alexander Disease 58'e neden olur. Burada gösterilen temsili veriler, iki farklı dokuya özgü IF protein tipinin (K8 ve GFAP) benzer şekilde yukarı regülasyon desenine girdiğini ve yaşlanma sırasında artmış asetilasyon geçirdiğini göstermektedir; bu, değişmiş metabolizma 22 , 51'in bir etkisi olabilir. Bu örnek, yöntemin, IF proteinlerinin fonksiyonunu global fizyolojik ölçekte anlamadaki faydasını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Acknowledgments

Bu çalışma, NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] ve P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill'e] tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, qPCR ve batı leke deneyleriyle ilgili yardım için Deekshita Ramanarayanan'a teşekkür ederler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

Tags

Biyokimya Sayı 123 ara fılamentler post translasyonel modifikasyon kütle spektrometresi immüno çökelme yaşlanma stres hayvan modelleri doku fraksiyonasyonu
Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Battaglia, R. A., Kabiraj, P.,… More

Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter