Summary
Stress Granuler (SGs) är icke-membranformiga cytoplasmatiska strukturer som bildas i celler utsatta för en mängd stress. SG innehåller mRNA, RNA-bindande proteiner, små ribosomala subenheter, translationsrelaterade faktorer och olika cellsignalproteiner. I det här protokollet beskrivs ett arbetsflöde som använder flera experimentella metoder för att upptäcka, karakterisera och kvantifiera bona fide SG.
Abstract
Celler utmanas ofta av plötsliga miljöförändringar. Stresskorn (SG), cytoplasmatiska ribonukleoproteinkomplex som bildar sig i celler utsatta för stressförhållanden, är inblandade i olika aspekter av cellmetabolism och överlevnad. SG: er modulerar cellulära signaleringsvägar, post-transkriptionella genuttryck och stressresponsprogram. Bildningen av dessa mRNA-innehållande granuler är direkt kopplad till cellulär translation. SG-sammansättningen utlöses genom inhiberad translationsinitiering och SG-demontering promoteras genom translationaktivering eller genom inhiberad translationsöjning. Detta förhållande framhävs ytterligare av SG-sammansättningen. Core SG-komponenter är stallade translationsförinitieringskomplex, mRNA och utvalda RNA-bindande proteiner (RBP). Syftet med SG-montering är att bevara cellulär energi genom att sekvestrera translationellt stalled hushålls-mRNA, vilket möjliggör förhöjd översättning av stress-responsiva proteiner. I additiPå kärnkomponenterna, såsom stalled translation preinitiation complexes, innehåller SGs en uppsjö av andra proteiner och signalmolekyler. Defekter i SG-bildning kan försämra cellulär anpassning till stress och kan därmed främja celldöd. SG och liknande RNA-innehållande granuler har kopplats till ett antal humana sjukdomar, inklusive neurodegenerativa störningar och cancer, vilket leder till den senaste intressen att klassificera och definiera RNA-granulatsubtyper. Detta protokoll beskriver analyser för att karakterisera och kvantifiera däggdjurs SGs.
Introduction
Celler använder många mekanismer för att reagera på stress. Vissa svar uppträder på post-transkriptionsnivå och involverar reglering av mRNA-översättning och / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmodulerad mRNA-translationell arrestering och nedbrytning är associerad med bildandet av specifika icke-membrancelliga foci, den mest välkännade som Stress Granules (SGs) 3 . SG är cytoplasmatiska foci som koncentrerar icke-translaterande mRNP i translationellt-arresterade celler som svarar på stress ( t.ex. oxidation, värmechock, näringsstörning och virusinfektion) 4 . Förutom icke-translaterande mRNA innehåller SG: s translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindande proteiner och olika signaleringsproteiner 5 . SG är biomarkörer av inhiberad proteintranslation och förändrad RNA-metabolism och har kopplats till cellöverlevnad och apoptos, signalvägenS och kärnprocesser 5 .
SG är dynamiska enheter, och deras bildning är starkt kopplad till statusen för cellulär översättning 6 . Trots sitt till synes sola utseende, transporterar de flesta SG-proteinkomponenterna snabbt in och ut, med en uppehållstid på sekunder. Medan SGs kvarstår i minuter till timmar, är de flesta av deras komponenter i snabb flöde. Inhiberingen av translationsinitiering och den därmed följande demonteringen av translerande polysomer främjar bildandet av SG; Sålunda står SG i jämvikt med översättningen av polysomer. Denna polysom / SG-jämvikt är nyckeln till att skilja bona fide SG från andra stressinducerade foci 6 , 7 .
Hållande translationsinitiering innebär omvandling av översättningskompetenta förinitieringskomplex som innehåller mRNA, translationsinitieringsfaktorer (eIF) och 40S ribosomala subenheter (s O-kallade 48S-komplex) till translationellt stoppade komplex (så kallade 48S * komplex) som kan samlas i SG 4 , 6 . SG s främjas genom translationell anhållning i två olika steg uppströms 48S komplexbildning: störning av funktionerna hos det kaps-bindande eIF4F-komplexet ( t.ex. inriktning på dess eIF4A-subenhet) eller fosforylering av a-underenheten för translationsinitieringsfaktor eIF2, medierad av en Eller flera av de fyra eIF2-kinaserna. Närvaron av stalled 48S-komplex ( dvs 40S ribosomala underenheter och valda translationsinitieringsfaktorer) är ett kännetecken för SGs 8 , 9 .
SG har kopplats till olika patologiska tillstånd, såsom virusinfektioner, neurodegeneration, autoimmunitet och cancer 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Muterade former av flera SG-komponenter är associerade med neurodegenerativa sjukdomar ( t.ex. amyotrofisk lateralskleros), i vilken neuroner uppvisar intracellulära patologiska inklusioner som kan spela aktiva roller vid neuronal död 13 . Vissa virus kapar SG-komponenter för att hämma SG-bildning och för att förbättra viral replikation 14 . Tidigare studier kopplar också SG till cancer 15 och till cancercellsöverlevnad under kemo- och strålbehandlingsterapi 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Även om sådana fynd har stimulerat stort intresse för SG-biologi, saknar många av de publicerade rapporterna viktiga kontroller för att särskilja bildandet av bona fide SG från andra stressinducerade foci.
SGs beskrivs initialt som icke-membrantiska cytoplasmatiska foci sammansatta av utvalda mRNA-bindande proteiner (RBP), innefattande T-cell-ntracellulärt antigen 1 (TIA-1) och poly-A-bindande protein (PABP); Översättning initieringsfaktorer; Polyadenylerad mRNA; Och små ribosomala subenheter 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionellt har deras komposition bestämts medelst tekniker såsom immunförstärkning och det ektopiska uttrycket av fluorescensmärkta proteiner 23 , 24 . På grund av sin högt dynamiska natur förblir immunokalokalisering av SG-proteiner och / eller mRNA den avgränsande metoden för detektering av SGs 23 , 24 . Hittills beskrivs många RBP och andra proteiner (över 120 distinkta proteiner) som SG-komponenter 11 . Så många SG-lokaliserade proteiner ändrar lokaliseringen både på ett stressberoende och ett oberoende sätt och kan ackumuleras vid andra intracellulära fack och foci. Det är viktigt att välja rätt SG-markörer och att använda funktionella kriterier för att skilja SG från andra typer av stressinducerad foci. Bona fide SG innehåller mRNA, translationsinitieringsfaktorer och små ribosomala subenheter och är i dynamisk jämvikt med translation.
Detta enkla arbetsflöde är utformat för att bestämma huruvida stressinducerade foci är bona fide SG. Detta arbetsflöde innehåller flera experimentella tillvägagångssätt med U2OS-celler, celler som vanligtvis används för att studera SG. Dessa celler är idealiska, eftersom de har en stor cytoplasma, är relativt platta och fäster starkt på glasöverdrag. Andra celltyper kan användas för att studera SG, men det är viktigt att vara medveten om att skillnader i timing, läkemedelskoncentration och överflöd av SG-kärnbildande proteiner kan förändra kinetiken och komposition. Dessutom svarar vissa celler på paraformaldehydfixering genom att bilda cellytor, vilket ger ett ruffled utseende som orsakar punktatlokalisering av vissa SG-markörer; Utan noggrann analys kan dessa kategoriseras som SG: er. Detta belyser behovet av att bedöma alla kriterier som krävs för att identifiera stressinducerade foci som bona fide SG. Vinorelbine (VRB), en cancerterapeutisk som främjar SGs 20 , liksom natrium arsenit (SA), en robust och välkarakteriserad SG-inducerare, används som stress för experimenten i detta protokoll.
Canonical SG innehåller flera SG-markörer (både proteiner och mRNA) som kolokaliserar i cytoplasmatiska foci. Detta protokoll använder både immunofluorescens och fluorescens in situ- hybridisering (FISH) för att detektera lokaliseringen av proteinmarkörer respektive polyadenylerade mRNA 22 . Kortfattat använder indirekt immunofluorescens antikroppar ( dvs.e. Primära antikroppar) specifika för ett givet protein för att detektera det i cellen. Därefter känner sekundära antikroppar (vanligtvis speciesspecifika) bundna till fluorokromer den primära antikroppen och avslöjar målproteinlokaliseringen. Fluorescerande mikroskopi används för att detektera den lokaliserade signalen i cellen. Användning av antikroppar producerade i olika arter och detektering av dem med olika färgade sekundära antikroppar möjliggör detektion av kolokalisering av flera antikroppar, vilket indikerar att deras proteinmål återfinns på samma plats 23 . Det är viktigt att välja markörer som har verifierats för att kolokalisera på bona fide SG.
FISH använder en märkt sond som baspar till en specifik RNA- eller DNA-sekvens 25 . För att detektera mRNA använder detta protokoll en biotinylerad oligo (dT) 40- sond som hybridiserar (eller baspar) till polyA-svansen av mRNA ( dvs polyA FISH). Den biotinylerade proben detekteras sedan med fluorescenskonjugerad streptavidin, eftersom streptavidin har en hög affinitet för biotin. Vid bedömning av SG, är det viktigt att koppla polyA FISH med immunofluorescens som detekterar en SG-markör, som i bona fide SG, bör de båda signalerna kolokalisera.
Med hjälp av detta protokoll utvärderas kolokalisering på flera sätt. I en flerkanalig ( dvs. RGB: röd, grön och blå) bild kommer kolokalisering att ändra färg på den överlappade signalen ( t.ex. kolokaliserad röd och grön blir gult) 23 . Dessutom kvantifieras kolokalisering grafiskt med hjälp av linjeskanningsanalys, där intensiteten hos varje färg mäts över en given linje 8 , 20 . Detta protokoll beskriver två linjeskanningsanalysprocedurer med hjälp av ImageJ 26 . Ett förfarande är manuellt och går igenom hela processen, whiDen andra använder ett makro eller ett enkelt program som automatiserar de manuella stegen. Det är viktigt att gå igenom det manuella programmet för att förstå makroproceduren.
SG-blanketter i celler där översättning är undertryckt; Celler med SG bör därför visa minskade nivåer av global översättning jämfört med obehandlade celler. Experimentellt används ribopuromycylering. Puromycin och emetin tillsätts till celler under en kort varaktighet före fixering, vilket medger att puromycinet införlivas i aktivt bildande polypeptider, vilket orsakar avslutning 27 , 28 . Behandling med emetin krävs för att förhindra återinitiering 29 . Puromycin kan sedan detekteras med anti-puromycinantikropp, vilket ger en ögonblicksbild av aktiv översättning. Denna metod används eftersom den är snabb, kräver inte försvältande med ett medium som saknar en viss aminosyra (och potentiellt förspänner cellerna) och avslöjarSubcellulär lokalisering av proteintranslation. Andra förfaranden, särskilt med användning av modifierade aminosyraanaloger, såsom metioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kopplad med "click-it" -kemi 30 , har använts för att visa att celler innehållande SGs uppvisar mycket lägre översättning än närliggande celler 31 . Denna teknik kräver emellertid metionin-svält följt av pulsmärkning i 15-30 min. Methionin-svält utgör en extra stress, medan den långa märkningstiden ( dvs. 15-30 min) resulterar i mätning av kumulativ snarare än pågående översättning och gör det också möjligt för de nyssyntetiserade proteinerna att flytta från deras syntesplats till deras slutliga destination inom cell. I motsats härtill är ribopuromycylering mycket snabbare och är kompatibel med vilket som helst medium, såsom det glukosfria mediet som används för att inducera SG genom glukoshushållning.
Canonical SGs är i dynamisk jämviktMed aktivt översättande av polysomer. Detta kan utvärderas experimentellt genom att behandla prover med de läkemedel som stabiliserar eller destabiliserar polysomer och därigenom tippar balansen mellan SG och polysomer 23 . Cykloheximid (eller emetin, som beter sig på liknande sätt) blockerar töjningen genom att "frysa" ribosomer på mRNA, vilket minskar poolen av tillgängliga icke-polysomala mRNP som kan bilda SG. Experimentellt kan detta användas på två sätt: genom tillsats av cykloheximid (eller emetin) före stress för att förhindra SG-bildning eller genom att tillsätta cykloheximid (eller emetin) efter det att SG har bildat, även utan att avlägsna stressmedlet, vilket orsakar SG-demontering, Preinitiationskomplex tas långsamt in i polysomfraktionen. I motsats härtill orsakar puromycin för tidig uppsägning och främjar polysomdisolering, vilket ökar poolen av initierande mRNA som kan monteras i SG. Experimentellt ökar puromycinbehandlingen antalet SG eller sänker tresolenD vid vilken de bildas som svar på graderad stress eller läkemedelsdosering. Vid bedömning av effekten av puromycin är det viktigt att använda en sub-maximal nivå av läkemedlet av intresse, eftersom puromycin förväntas öka verkan av läkemedlet och öka andelen celler som uppvisar SG - det kan inte ske om drogen / Stress orsakar SG i 100% av cellerna initialt. Detta står i kontrast till cykloheximidbehandling, som demonterar SG och fungerar bäst när ~ 95% av cellerna initialt visar SG så att den största möjliga minskningen kan observeras och kvantifieras exakt.
Detta protokoll tillhandahåller en ram för att studera SG i däggdjursceller. Metoder innefattar: (1) immunofluorescerande färgning och ImageJ-analys för att utvärdera kolokaliseringen av de klassiska SG-associerade markörerna eIF4G, eIF3b och Ras GTPase-aktiverande proteinbindande protein 1 (G3BP1) i förmodade SG; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) för att detektera polyadenylerat mRNA; (3) cykloheximid- och puromycinbehandling för att bestämma huruvida stressinducerad foci är i dynamisk jämvikt med polysomer; Och (4) ribopuromycylering för att bedöma den translationella statusen hos celler som innehåller förmodade SGs. Tillsammans kan dessa analyser avgöra om stressinducerad foci kan klassificeras som bona fide SG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellberedning
- Lägg till autoklaverade täckglas till 12 brunnar i en 24-brunnsplatta, såsom indikeras i Figur 1A ; Detta kan göras med en steril Pasteur pipette fäst vid ett vakuum för att plocka upp varje täckglas. Tryck försiktigt på täckglaset på sidan av brunnen för att släppa suget, så att täckglaset faller i brunnen.
- Platta 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkomceller per brunn vid en slutlig volym av 500 | il medium. Flytta plattan sida till sida och upp och ner flera gånger för att säkerställa att cellerna är jämnt fördelade.
- Tryck försiktigt på täckglasen med en ren P1000-spets för att säkerställa att täckglaset ligger på botten av brunnen och att det inte finns några bubblor under täckglaset.
2. Stressceller
- Följande dag, kontrollera plattan visuellt för att säkerställa att cellerna är jämnt dispergerade och jämnt sammanflöde över täckglaset, som variationer mellan saMples kan påverka reproducerbarheten av resultaten negativt. Använd ett 10X-mål på ett inverterat vävnadskulturmikroskop.
- Förvärm mediet till 37 ° C. Undvik att använda kallt eller hett medium till cellerna, eftersom dessa orsakar kall chock eller värmeskock.
- Späd läkemedel i förvärmda medier. För varje olika läkemedelskoncentration, förbereda 2 brunnar innehållande 500 μl medium. Förbered ytterligare 500 μL för att möjliggöra förlust vid pipettering. Aliquot 4-rör, vardera innehållande 1,5 ml.
- För natrium arsenit: Till varje brunn innehållande 500 μl tillsätt 1,5 μl 100 mM natriumarsenit (slutkoncentration: 100 μM) eller tillsätt 0.75 μL 100 mM natriumarsenit (slutkoncentration: 50 μM).
- För vinorelbin: till varje brunn innehållande 500 μl tillsätt 22,5 μL 10 mM vinorelbin (slutkoncentration: 150 μM) eller tillsätt 18,75 μl 10 mM vinorelbin (slutkoncentration: 100 μM).
OBS: Natriumarsenit Är en välkänd och allmänt använd stresskristallinducerare och används därför klassiskt som en positiv kontroll.
- Ta bort och kassera mediet från brunnar B1 - 4 och C1 - 4. Lägg i media med droger och vänta i 60 minuter (Figur 1A).
- Tillsätt 500 μl medium med 100 μM natriumarsenit till brunnarna B1 och B2. Tillsätt 500 μl medium med 50 μM natriumarsenit till brunnar B3 och B4.
- Tillsätt 500 μl medium med 150 μM vinorelbin till brunnar C1 och C2. Tillsätt 500 μl medium med 125 μM vinorelbin till brunnar C3 och C4.
- 30 minuter före fixering, behandla brunnarna i kolumn 2 med 5 | il cykloheximid (1 mg / ml lager) och brunnarna i kolonn 4 med 2 | il puromycin (1,25 mg / ml lager). Rag försiktigt plattan för att blanda innan du placerar plattan i 37 ° C inkubatorn.
3. Cellfixering och immunfluorescens
Nt "> OBS! Före experimentet, se till att metanolen kyls till -20 ° C. Gör buffertar, inklusive fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 5% normal hästserum (NHS) i PBS och 4% paraformaldehyd (PFA ) I PBS.- Kassera mediet och tvätta brunnarna som innehåller täckglas med PBS. Beroende på vilka droger som används kan det vara viktigt att kassera mediet som innehåller droger på rätt sätt. Kontakta det lokala miljöskyddskontoret för specifika instruktioner. För att tvätta effektivt, fyll en pressflaska med PBS, skära av spetsen för att tillåta ett mjukt flöde i stället för en tät ström och använd detta för att tillsätta PBS till varje brunn efter aspirering av den ursprungliga PBS.
- Fixera cellerna med ~ 250 μl 4% PFA i 15 minuter vid RT under försiktig omröring. Hölj helt över täcklocket med PFA; 250 μL bör vara tillräcklig, men om inte, lägg till mer. Undvik alltid pipettering direkt på täckglasen, eftersom vissa celler (eller spänningsbehandlingar av celler) kan ändra påfogningen och tHan tvingas från pipettering kan lossna cellerna.
- Ta bort PFA och kassera ordentligt. Kontakta lokala miljöbyrå för detaljer om hur man kasserar paraformaldehyd på rätt sätt.
- Tillsätt ~ 250 μL metanol (-20 ° C) och inkubera i 5 min vid rumstemperatur under försiktig rockning; Detta permeabiliserar och flattar cellerna.
- Ta bort och kassera metanolen och blockera cellerna genom att applicera ~ 250 μL 5% NHS i 1 h vid RTO / N vid 4 ° C. Kontakta det lokala miljöskyddskontoret för detaljer om hur man ska kassera metanol på ett korrekt sätt.
- För primära antikroppar späda antikropparna i 5% NHS.
OBS! Användningen av flera SG-markörer är nyckeln till att bekräfta huruvida de observerade granulatema är bona fide SG. Antalet SG-markörer som kan användas beror på de filter som finns i mikroskopet. Om standard gröna, röda och fjärrfilter finns tillgängliga, använd G3BP1, eIF4G och eIF3b vid en 1/250 utspädning. - Tvätta brunnarna 3x med PBS och inkubera varje tvätt under 5 minuter.
- För sekundära antikroppar, späd alla sekundära antikroppar (1/250 utspädning) och Hoechst-färgämne (1/1000 spädning) i 5% NHS.
- För detta experiment tillsätt 12 μl av var och en av följande: Cy2-Mouse, Cy3-kanin och Cy5-get (en 1/250 utspädning av varje ) Och tillsätt 3 μL Hoechst färgämne.
- Inkubera täckglasen med sekundära antikroppar i 1 timme vid RT. Under detta och följande steg skyddar du proverna från ljus genom att täcka plattan med en låda eller genom att placera folie över toppen av vävnadsodlingsskålen.
- Tvätta viLls tre gånger med PBS i 5 min vardera.
- Montera täckglasen på märkta glasskivor med monteringsmedium. Värm monteringsmediet i ett 37 ° C värmeblock under 10 minuter; Detta minskar viskositeten och gör det lättare att pipettera. Med en snitt P200-tipp, pipettera 25 μL monteringsmedium per täckglas på en glasskiva; 4-8 täckglas kan passa på en glasskiva, förutsatt att mikroskopsteget tillåter detta. Överför täckglaset från brunnen till gliden genom att använda fina tangar, var noga med att sätta ner cellsidan på monteringsmediet. Använd en ren P200-spets genom att trycka på täckglaset nedåt.
- När alla täckglas har monterats, använd vikta labbvävnader för att städa upp överskott av monteringsmedium genom att pressa labbvävnaden väldigt fast på glidbanan. Använd en pressflaska innehållande H 2 O för att spola av det överskridande monteringsmediet och upprepa sedan blottningen med vikta labbvävnader för att avlägsna vattnet.
4. Fluorescens i läget </ Em> Hybridisering (FISH)
- Placera och behandla cellerna med hjälp av steg 1 och 2.1-4 som en guide; Det är bara nödvändigt att plåta cellerna i kolumn 1, eftersom endast 3 täckglas behövs i följande experiment.
- Se till att alla buffertar är beredda ( dvs 4% PFA i PBS, 70% etanol i vatten, 2x saltlösning-natrium-citrat (SSC) och 5% NHS), att metanolen kyls ner till -20 ° C och att Hybridiseringsugnen värms upp till lämplig temperatur.
- Utför steg 3.1-3.3 för att tvätta och fixa cellerna.
- Permeabilisera celler genom att tillsätta -20 ° C metanol under 10 minuter.
- Ta av metanolen och inkubera täckglasen i 70% etanol. Placera plattan vid 4 ° C över natten. Tät plattan med parafilm för att förhindra förångning.
- Följande dag, avlägsna etanolen och rehydrera cellerna genom att tillsätta 500 | il 2x SSC. Inkuber täckglasen i 5 minuter med försiktig omröring vid RT.
- Ta bort 2x SSC och lägg till 500Μl 2X SSC. Inkubera i 5 minuter under försiktig omröring.
- Placera en del parafilm platt på botten av hybridiseringsugnen. Pipettera 25 μl hybridiseringsbuffert på parafilmen för varje täckglas. Ta bort täckglaset från 24-brunnsskålen (vid den här tiden är täckglasen uppåt) och placera täckglaset nedåt på hybridiseringsbufferten. Gör detta vid 42 ° C eller valfritt vid 65 ° C i 15 minuter.
OBS! Att slutföra detta steg vid 65 ° C kommer att denaturera cellulära RNA; Detta kan förbättra signalen om polyA maskeras genom interaktioner med proteiner. - Späd biotin-Oligo (dT) sonden (100 ng / μl) i hybridiseringsbuffert till en koncentration av 2 ng / μl; 25 μL per täckglas är tillräcklig.
- För varje täckglas, pipett 25 μl hybridiseringsbuffert innehållande Biotin-Oligo (dT) på parafilmen. Plocka upp täckglaset med pincett och rör försiktigt kanten på täckglaset på ett labbväv för att ta bort överskottHybridiseringsbuffert. Överför täckglaset till hybridiseringsbufferten med Biotin-Oligo (dT); Kom ihåg att hålla cellsidan nere.
- Placera täckglasen i en hybridiseringslåda för att begränsa förångningen. Inkubera täckglas med Biotin-Oligo (dT) i hybridiseringsbuffert under 60 minuter vid 42 ° C.
- Placera 2x SSC i hybridiseringsugnen så att den kan jämviktas till 42 ° C.
- Tillsätt ~ 500 μL uppvärmd 2x SSC till brunnarna i 24-brunnsskålen och använd tång för att överföra täckglasen till brunnen. Inkubera i 10 min.
- Upprepa ovanstående tvättsteg två gånger vid 42 ° C och sedan två gånger vid RT.
- Kompletta steg 3.5-3.10, se till att använda en streptavidin fluorokrom för att detektera Biotin-Oligo (dT) istället för en konventionell antikropp.
5. Ribopuromycyleringsanalys för att bedöma översättningsstatus
- Placera U2OS-celler på täckglas, som anges i steg 1, men endast platta en täckglas per skick (i dettaFall, 3 täckglas: obehandlad, 100 μM natriumarsenit och 150 μM vinorelbin) ( Figur 1 A).
- Stressceller som använder protokollet i steg 2, slutför steg 2.1-2.4.
- 5 min före fixering, tillsätt 2 μl puromycin (stam: 1,25 mg / ml, späd 2 μL i 500 μl för att erhålla en slutlig puromycinkoncentration av 5 μg / ml) och 2,9 μl emetin (stam: 20 μg / ml; tillsätt 2,9 μl till samma lösning som redan innehåller puromycinet) till varje brunn innehållande 0,5 ml.
- Kompletta steg 3.1-3.10 som angivits ovan, med användning av en anti-puromycinantikropp (1/1000 utspädning) för att detektera puromycin. Använd helst två andra SG-markörer i de återstående kanalerna.
- När du kvantifierar puromycinsignalen, ta alla bilder med samma exponering. Välj den här exponeringen genom att använda det ljusaste (ostressade) provet och ta en bild så ljus som möjligt utan mättnad.
OBS: Intensiteten hos anti-puromycinfluorescenssignalen representerarEnts kontinuerlig översättning, som puromycinsubstitut för en aminosyra, inkorporeras i det nascenta proteinet och verkställer prematur terminering av proteinet.
6. Bildförvärv och analys
- Kvantifierande stresskorn
- För att kvantifiera SG: er, skaffa 3 - 5 bilder totalt> 100 celler per prov med 40X-objektiv. Alternativt, skaffa bilder med andra mål, men se till att> 100 celler räknas per täckglas och att förstoringen är tillräckligt stor för att tydligt visualisera granulerna. Gör detta genom att dela täckglaset i fem ungefär lika stora områden och välj ett fält från varje region slumpmässigt ( Figur 1B ); Bilder av samma fält bör innehålla alla kanaler för att bedöma kolokalisering av markörer.
- När alla bilder har förvärvats, slå samman kanalerna. Vissa kameraprogramvaror gör det automatiskt, medan andra kräver manuell sammanslagning. Detta kan göras medImageJ genom att öppna alla bilder och sedan välja [Bild | Färg | Merge Channels].
- Manuellt räkna totalt antal celler genom att räkna antalet kärnor, med hjälp av Hoechst som kärnmarkör. Räkna manuellt antalet celler som innehåller mer än två SGS per cell.
OBS! Om du exempelvis använder en sammanslagd trekanalsbild som visar G3BP1 (grön), eIF4G (röd) och Hoechst (blå), räknar du kärnorna (eller antalet celler) med den blå kanalen. Tala sedan SG-positiva celler som de med två eller flera gula foci per cell. Granulerna kommer att verka gula, som gröna från G3BP1 och röda från eIF4G verkar gul om de är kolokaliserade. - Bestäm procentsatsen av celler som är SG-positiva genom att kombinera data från de 3-5 oberoende regionerna och beräkna sedan:
Antal SG-positiva / antal kärnor) * 100 = procent av SG-positiva celler
- Bedömning av kolokalisering genom linjeskanningsanalys - manuell metod
- ÖppenImageJ. Ladda ner det gratis från ()
- Öppna ROI-hanteraren: [Analysera | Verktyg | ROI-chef ...].
- Öppna den sammanslagna bilden i ImageJ: [File | Öppen].
- Använd linjverktyget i ImageJ-verktygsfältet, lägg till en rad som går igenom en SG, var noga med att inkludera före och efter SG. Lägg till den här raden i ROI-hanteraren genom att klicka på [Lägg till] i fönstret ROI-hantering.
- Dela den sammanslagna bilden i separata kanaler för att bedöma lokaliseringen av varje markör till granulen: [Bild | Färg | Split Channel]; Detta kommer att dela upp den sammanslagna bilden i tre svartvita bilder.
- Se till att linjen är vald i den svartvita bilden. Linjen väljs om den visas i bilden. Om inte, klicka på raden i panelen i fönstret ROI-hantering. Detta markerar linjen i blått i fönstret ROI-hanterare och gör linjen synlig på den svartvita bilden. Om linjen fortfarande inte visas, var noga med att "visa allt" är chEcked i ROI-chefen och klicka sedan på raden i bilden.
- Analysera linjens intensitet: [Analysera | Plot Profile]; Detta kommer att föra upp "Plot Profile" -fönstret, som visar intensiteten på signalen över linjen.
- I fönstret "Plottprofil" klickar du på [Lista], vilket ger ett fönster som innehåller de rada data från grafen. Kopiera alla data i det här fönstret och klistra in det i en kalkylarkfil. För att göra detta, välj alla data i fönstret: [Redigera | Välj alla]. Kopiera datumet: [Redigera | Kopiera]. Öppna en kalkylarkfil och klistra in data: [Redigera | Klistra].
- Kompletta steg 6.2.6 - 6.2.8 för varje kanal separat. Var noga med att hålla koll på den kanal som utvärderas.
- I ett kalkylblad genererar du en raddiagram över resultaten. Markera kolumnerna som innehåller data genom att trycka på [kontroll] och klicka på brevet längst upp i varje kolumn. Välj sedan linjediagram: [Infoga | Linjediagram].
- Upprepa denna analys för multIple stressgranuler över flera oberoende experiment.
- Bedömning av kolokalisering genom linjeskanningsanalys - ImageJ-plugin
- Hämta och installera RGB-profilverktyget från ImageJ-webbplatsen (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); När korrekt installerat ska en röd, grön och blå (RGB) -linjad ikon visas i verktygsfältet.
- Öppna bilden ( t ex Tiff, JPG) i ImageJ: [File | Öppen].
- Klicka på RGB-ikonen som finns i ImageJ-verktygsfältet.
- Klicka och dra för att lägga till en rad som sträcker sig genom en SG, se till att inkludera intilliggande regioner. En bild av histogrammet kommer att visas i ett popup-fönster.
- Spara data som en bild: [Fil | Spara som | TIFF]. Alternativt exporterar du och sedan data i ett annat grafprogram med hjälp av steg 6.2.8 ovanifrån.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stressinducerad foci är inte nödvändigtvis SGs. SGs klassificeras som cytoplasmatiska foci som innehåller mRNA, translationinitieringsfaktorer och RNA-bindande proteiner och är i jämvikt med aktiv översättning. Ovanstående protokoll kan användas som en mall för att karakterisera huruvida en given stress inducerar bona fide SG.
SG-koalokaliserar med andra kända SG-markörer, innefattande både proteiner och mRNA. SA och VRB inducerar cytoplasmatiska foci som innehåller G3BP1, eIF4G och eIF3b ( Figur 2A ). Kolokaliseringen av dessa markörer bekräftas med hjälp av linjescananalys och enkanalsbilder med ökad förstoring ( Figur 2A ). Dessa foci innehåller dessutom Mrna, såsom indikeras av polyA FISH, och oligo (dT) -signalen kolokaliserar med G3BP1-immunfluorescenssignalen ( Figur 2B ). Det är kritiskt att visa att polyA-FISHSignal överlappar med en känd SG-markör, eftersom en stress kan främja flera typer av foci.
SG: er inträffar under ett translationshämmat tillstånd. Både VRB och SA främjar ett translationellt förtryckt tillstånd, som experimentellt bedömts med ribopuromycylering ( Figur 3 ). Bona fide SG är i dynamisk jämvikt med aktivt översatt polysomer. SA- och VRB-inducerad SGs löses med CHX, som fäller polysomer på mRNA, vilket därigenom stoppar polysomdisplayen och förhindrar SGs ( Figur 4A, 4B ). Omvänt induceras mer SA och VRB SGs efter behandling med puro, eftersom puro främjar polysom-demontering, vilket gynnar SG-bildning ( Figur 4A, 4C ).
Sammanfattningsvis inducerar VRB, som med den positiva kontrollen SA, bona fide SG som: (1) kolokaliserar med kända SG-markörer, (2) innefattar både protein och mRNA ( Figu Re 2), (3) finns i celler där översättning är undertryckt ( Figur 3 ) och (4) är i dynamisk jämvikt med aktiv översättning ( Figur 4A-4C ).
Figur 1: Experimentella diagram. ( A ) Fröceller på täckglas som tidigare placerats i en brunn med 24 brunnar, som angivits. Behandla raderna A och B i 60 minuter med SA eller VRB med användning av koncentrationen i μM enligt vad som anges. Efter 60 min tillsätt CHX (slutkoncentration: 20 μg / ml för kolonn 2) eller puro (20 | ig / ml puromycin för kolonn 4) till det läkemedelsinnehållande mediet. Fortsätt inkubation under ytterligare 30 minuter före fixering och färgning. ( B ) Diagram över en täckglas, vilket indikerar de fält som ska avbildas för räkning. Skyddsklämman är uppdelad i fem ungefär lika stora områden; En bild tas i varje region."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: SA och VRB inducerar cytoplasmatiska foci som innehåller SG Markers anPoly (A) mRNA. ( A ) U2OS-celler immunostainerade för G3BP1 (grön), eIF3b (röd) och eIF4G (blå). Celler behandlades med 100 | iM SA eller 150 ^ M VRB under 60 minuter eller behandlades inte (kontroll). Zoomområdena förstoras (2X) och visas som separata kanaler i svartvitt (nedan). Grafen anger linjeskanningsanalysen av en region (vit linje) granulat och visar graden av överlappning eller kolokalisering. Skalan visar 10 μm. ( B ) PolyA-FISH kopplad med immunostaining detekterar polyA-mRNA med en oligo (dT) 40 sond (röd), G3BP1 (grön) detekteras med användning av ett anti-G3BP-antikropp och kärn-DNA detekteras med användning av Hoechst-färgämne (blå). Zoomade regioner (2X), enkanalsbilder och linjeskanningsanalysen visar kolokalisering. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: SA och VRB Behandling OrsakTranslation Repression. Immunofluorescensen hos U2OS-celler pulsmärkt med puromycin i 5 minuter efter de angivna behandlingarna. Puromycin (grön), eIF3b (röd) och nukleär DNA färgad med Hoechst (blå). Cellerna behandlades med 100 | iM SA eller 150 | iM VRB under 60 minuter eller inte behandlade (kontroll). Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se ett större versJon av denna figur.
Figur 4: SA och VRB inducerar cytoplasmiska foci som befinner sig i dynamisk jämvikt med polysomer. ( A ) Allmänt schema som beskriver polysom / SG-förhållandet. ( BC ) U2OS-celler färgade för G3BP1 (grön), eIF3b (röd) och kärn-DNA med användning av Hoechst (blå). Celler behandlades med 100 | iM SA eller 150 ^ M VRB under 60 minuter eller behandlades inte före tillsats av ( B ) CHX (cykloheximid, 20 | ig / ml), ( C ) puro (Puromycin, 10 | ig / ml ) Eller inget additiv under ytterligare 30 min inkubation. Siffrorna motsvarar procentandelen celler med SG i ett representativt experiment. Skala bar = 25 μm, i (BC). Vänligen klicka här för att se en störreVersion av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som framgår av immunohistologiska studier i flera sjukdomar leder kronisk stress till bildandet av olika intracellulära foci. Till exempel kännetecknas de flesta neurodegenerativa sjukdomar av intracellulära aggregat av olösliga proteiner. Närvaron av SG-associerade proteiner i sådana aggregat är ofta grunden för att dra slutsatsen att sådana foci är SG. En liknande slutsats dras också när SG-markör-positiva cytoplasmatiska foci observeras i celler som behandlas med nya spänningsstimuli. Detta protokoll ger ett enkelt arbetsflöde för att identifiera bona fide SG.
Flera kriterier måste uppfyllas för att förmodade SG: er ska bekräftas som sådana, inklusive karakterisering av både komposition och dynamik. Först är SG: er cytoplasmatiska foci som innehåller translationellt stalled mRNPs. Således är det första tillvägagångssättet att karakterisera deras komposition med användning av två mikroskopibaserade tekniker, nämligen polyA-FISH och IF. FISH är en tillförlitlig metod för visuell användningIze mRNA som colocalize med SGs. En oligo (dT) 40 sond används för att detektera polyadenylerade mRNA som packar in i SG under stressbetingelser. Eftersom oligo (dT) inte detekterar deadenylerade mRNA, som är kärnkomponenter i behandlingsorgan (PBs), är närvaron av en stark oligo (dT) -signal i cytoplasmatiska foci en första indikation (men inte tillräckligt för definition) att dessa foci är SGS. Det andra testet är att demonstrera kolokalisering av en poly (A) -signal med andra SG-markörer ( t.ex. G3BP1) ( Figur 2A ). Detta görs genom att utföra IF mot SG-markörproteiner. SG-markörerna eIF3b, eIF4G och G3BP1 används rutinmässigt eftersom eIF3b och eIF4G är translationsinitieringsfaktorer som är kända för att vara komponenter av 48S * -komplex och G3BP1 krävs för SG-bildning ( Figur 2B ). Det är viktigt att betona att mer än en SG-markör krävs, eftersom olika spänningar rekryterar olika SG-associerade faktorer till SG, och vissa spänningar kan cAuse protein aggregering som kan misstas för SG-bildning.
För det andra bildas SG: er på grund av translationsinhibering. Medan inhiberingen av translation kan detekteras med olika tillvägagångssätt ( t ex genom traditionell [35S] Met-chase-märkning) föredras ribopuromycylering, eftersom den detekterar pågående proteinöversättning i behandlade celler. Denna teknik är också kompatibel med standard immunofluorescens mot SG-markörer, vilket möjliggör samtidig övervakning av SG och graden av translationsinhibering i individuella celler. Såsom ses i figur 3 , främjar SA och VRB båda SG-bildning till olika grader. Medan SA orsakar SG i nästan 100% av cellerna, främjar VRB SG-bildning i cirka 75% av cellerna. Möjligheten att främja SG: s korrelerar med graden av translationinhibering: medan obehandlade celler har en hög basal nivå av översättning, SA hämmar translation helt, men VRB bara paHämmar translationen ( Figur 3 ).
För det tredje är SG: er dynamiska och står i jämvikt med översättningen av polysomer. Behandling av celler med cykloheximid före stress eller samtidigt med stress förhindrar polysomdisponering och SG-bildning. SG-polysomejämvikten är dubbelriktad, eftersom stressade celler som uppvisar SG kan behandlas med cykloheximid för att upprätthålla SG-demontering genom att fånga mRNA i polysomer eller monosomer när de startas produktivt. En viktig kontroll är att använda puromycin, vilket hämmar töjningen genom att främja för tidig uppsägning, vilket ökar mängden icke-polysomala mRNP som är tillgängliga för SG-bildning. Dramatiska förändringar i SGs observeras när SA- eller VRB-behandling kombineras med CHX eller purobehandling ( Figur 4 ). Således är bedömning av huruvida förmodade SGs är upplösta vid cykloheximidbehandling men förstärkta eller opåverkade av puromycin en nyckel experimentell parameter för användning i SG identifierkatjon. Den emetinstyrda SG-demonteringen i mycket små, icke-vidhäftande, primära humana benmärgs-CD34 + -celler visades framgångsrikt genom behandling av cellerna i suspension före cytospinning 32 .
Natriumarsenit används i stor utsträckning för att utlösa SG genom inducering av eIF2-a-fosforylering 33 , men den bör noggrant titreras , eftersom den riktar sig mot många proteiner och aktiverar ett antal signaleringsvägar 34 , 35 . Olika cellinjer uppvisar varierande grader av känslighet för natriumarsenit. U2OS är relativt känsliga (100 uM), medan COS7, MEFs och HeLa kräver 200 / xM. DU-145 6 , primära normala humana benmärg CD34 + -celler 32 , humana lymfoblaster 36 , muskortikala nervceller 37 och Huh7-celler 31 kräver 500-1000 uM.
Det experimentella arbetsflödet som beskrivs här tillåter detektering av SG i olika celler och under olika spänningar. Den stora fördelen med detta arbetsflöde är att det är enkelt och möjliggör otvetydig detektering av bona fide SG, såväl som för samtidig undersökning av cellulär translation i stressbehandlade celler. Detta protokoll använder U2OS-celler, men det kan ändras för olika cellinjer eller till och med för primära celler. En nyligen och omfattande lista över celler som används för stressgranulära studier är granskning 11 . Antalet celler bör anpassas för att uppnå 80% konfluens på dagen för läkemedelsbehandling. Koncentrationen och varaktigheten av läkemedelsbehandling bör också anpassas, eftersom cellerna svarar annorlunda. Dessutom, medan det här protokollet är inställt för ett 24-brunnsformat, kan det justeras till vilken storlek som helst, där täckglas (av vilken storlek som helst) kan ligga platt under plätering och drogbehandlingnt. Cellinjer som stabilt uttrycker SG / PB-markörer har använts i hög genomströmning, siRNA-baserade skärmar 33 och levande cellbildnings 38 . Bildbaserad screening användes med användning av HeLa-celler färgade för den endogena SG-markör-PABP för att detektera kemiska föreningar som blockerar SG-sammansättning 39 . Det förväntas att detta arbetsflöde kommer att vara användbart vid framtida studier och applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna av Ivanov och Anderson labs för deras användbara diskussion och feedback på detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institute of Health [GM111700 och CA168872 till PA, NS094918 till PI], National Science Center i Polen [bevilja UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 till WS]. WS erkänner också ministeriet för vetenskap och högre utbildning i Polen (Mobility Plus Program) och den polskamerikanska Fulbright-kommissionen för deras ekonomiska stöd till sin forskning i USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U-2 OS | ATCC | ATCC®HTB-96™ | Commonly written "U2OS" Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin Prewarm prior drug(s) dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442-500ml | Used to supplement media |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | Used to supplement media |
| penicilline streptomycine | Sigma | P0781-100ml | Used to supplement media |
| 24-well plate | Costar | 3524 | |
| lab tissues (kimwipes) | KIMTECH SCIENCE | 34120 | |
| Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-545-82 | Autoclaved before use Keep sterile in the tissue culture hood |
| Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) | Sigma | S7400-100G | Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock |
| Vinorelbine (VRB) | TSZ CHEM | RS055 | Dissolve in water to 10 mM |
| Puromycin | Sigma | P9620 | Used to assess translation level (ribopuromycylation) -Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Emetine dihydrochloride hydrate | Sigma | E2375 | Used in combination with puromycin to assess general translation level Used to assess SG connection with active translation -Dilute in water to 10 mg/mL |
| Cycloheximide (CHX) | Sigma | C4859 | Used to assess SG connection with active translation Dilute in water to 10 mg/mL |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza / VWR | 95042-486 | Wash buffer for immunofluorescence |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma | P6148-500G | Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved Aliquots can be stored at -20 °C for several months Hazardous, use ventilation Discard in special waste |
| Methanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | Prechill to -20 °C before use Discard in special waste |
| Normal Horse Serum (NHS) | Thermo Fisher Scientific | 31874 | Dilute to 5% in PBS Add sodium azide for storage at 4 °C Blocking solution for immunofluorescence |
| Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | Dilute to 70% with water |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) | Santa Cruz | sc-81940 | Store at 4 °C 1/100 dilution |
| rabbit anti eIF4G antibody (H-300) | Santa Cruz | sc-11373 | Store at 4 °C 1/250 dilution |
| goat anti eIF3η (N-20) antibody | Santa Cruz | sc-16377 | eIF3η is also known as eIF3b Store at 4 °C 1/250 dilution |
| mouse anti puromycin 12D10 antibody | Millipore | MABE343 | Store at 4 °C 1/1,000 dilution |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 715-225-150 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C 1/250 dilution |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-165-152 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/2,500 dilution |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 705-175-147 | Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C 1/250 dilution |
| Hoechst 33258 solution | Sigma | 94403-1ML | Incubate with secondary antibodies Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light -Store at 4 °C |
| Cy3 Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-084 | Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C 1/250 dilution |
| oligo-(dT)40x probe biotinilated | Integrated DNA Technologies (IDT) | / | Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use Custom order |
| hybridation box | / | / | Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use |
| 20x SSC buffer | Thermo fisher Ambion | AM9763 | Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated) Store at RT Wash buffer for FISH |
| PerfectHybPlus Hybridization Buffer | Sigma | H7033-50ml | Block and probe incubation buffer for FISH |
| slide mounting media | home made | / | Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C |
| Parafilm "M" | Sigma | P7793-1EA | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | P-8136-250G | Reagent to make vinol |
| Glycerol | Sigma | G5516-100ML | Reagent to make vinol |
| sodium azide | Fisher Scientific | S2002-5G | Preservative agent for blocking solution and vinol Make a 20% dilution in water |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
- Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
- Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).
- Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
- Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
- Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
- Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
- Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).
- Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
- Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
- Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
- Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
- Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
- Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
- Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
- Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
- David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
- Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
- Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
- Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
- Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
- Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
- Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).
- McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
- Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
- Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
- Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).
