Summary
Nous décrivons ici les protocoles pour la mesure de l'affinité de liaison anticorps-antigène et la cinétique en utilisant quatre plates-formes de biocapteurs couramment utilisés.
Abstract
biocapteurs optiques sans étiquette sont des outils puissants dans la découverte de médicaments pour la caractérisation des interactions biomoléculaires. Dans cette étude, nous décrivons l'utilisation de quatre plates-formes de biocapteurs utilisées régulièrement dans notre laboratoire pour évaluer l'affinité de liaison et la cinétique de dix anticorps monoclonaux de haute affinité (mAb) contre la pro-protéine convertase subtilisine humaine kexine type 9 (PCSK9). Bien que les deux Biacore T100 et ProteOn XPR36 sont dérivées de la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) bien établie, le premier a quatre cellules d'écoulement connectés selon la configuration d'écoulement en série, tandis que le second présente 36 taches de réaction en parallèle à travers une improvisée 6 x 6 entrecroisé configuration microfluidique du canal. Le IBIS MX96 exploite également basé sur la technologie de capteur SPR, avec un dispositif d'imagerie supplémentaire qui permet la détection de l'orientation spatiale. Cette technique de détection associée à l'écoulement continu Microspotter (CFM) augmente le débit de manière significative par enabling impression de réseau multiplex et la détection de 96 sports de réaction simultanément. En revanche, le RED384 Octet est basé sur le principe optique biocouche interférométrie (BLI), avec des sondes à fibre optique agissant en tant que biocapteur pour détecter motif d'interférence change sur des interactions de liaison à la surface de pointe. Contrairement aux plates-formes SPR, le système de BLI ne repose pas sur fluidiques de flux continu; à la place, les conseils de capteurs recueillent des lectures alors qu'ils sont plongés dans des solutions d'analyte d'une microplaque 384 puits pendant l'agitation orbitale.
Chacune de ces plates-formes de biocapteurs a ses propres avantages et inconvénients. Pour fournir une comparaison directe de la capacité de ces instruments de fournir des données cinétiques qualité, les protocoles décrits illustrent des expériences qui utilisent le même format d'essai et les mêmes réactifs de haute qualité pour caractériser la cinétique anticorps-antigène qui correspondent à la 1 simple: 1 modèle d'interaction moléculaire .
Protocol
1. Les protéines et anticorps
- Produire et purifier la subtilisine de convertase de proprotéine humain de type kexine 9 (PCSK9) et dix mAbs anti-PCSK9 dérivés de souris comme décrit précédemment 17.
- Évaluer la pureté des produits purifiés en injectant séquentiellement 10 pg de chaque échantillon dans une colonne d' exclusion de taille analytique (SEC) en utilisant un système UPLC 19.
2. Mesures cinétique dans le T100 Biacore
- Instrument et Préparation du réactif
- Equilibrer la puce de capteur CM5 à la température ambiante pendant 15 min.
- Décongeler deux aliquotes de 200 ul de 200 mM de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et de deux portions aliquotes de 200 ul de 50 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS) à la température ambiante.
- Préparer une bouteille de 1 litre de 1 x HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM d'EDTA et 0,005% v / v de polysorbate P20) en cours d'exécution par un tampon diune solution de luth stock HBS-EP 10x + dans l'eau.
- Préparer 1 ml de protéine A / G à 30 ug / ml dans 10 mM d'acétate de sodium (pH 4,5) et 500 ul de chaque échantillon mAb à 0,063 ug / mL dans le tampon de migration HBS-EP. Décongeler une fiole congelée de PCSK9 humaine sur la glace.
- Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur « Outils | Eject Chip », placer la puce du capteur dans la gaine et à proximité. Cliquez sur « Outils | température », entrez « 25 » ° C la température d'analyse et de « 10 » ° C la température du compartiment.
- Immobilisation de surface
- Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur « Fichier | Ouvrir / Assistant Nouveau modèle » et sélectionnez « Immobilisation » de la liste dans le panneau gauche.
- Cliquez sur « Nouveau » pour entrer dans la fenêtre de configuration d'immobilisation. Choisir « CM5 » comme le type de puce et sélectionner la cellule d'écoulement « 1 » par cycle.
- Cochez la case à côté de chaque « cellule d'écoulement Immobilisation 1/2/3/4 » à ActivaTé les options. Sélectionnez « Visez niveau immobilisé » et « Amine » comme la méthode pour toutes les cellules d'écoulement.
- Entrer « 30 pg / mL ProA / G » en tant que ligand, veiller à ce que le niveau cible est fixé à des unités de réponse « 10000 » (RU) pour toutes les cellules d'écoulement.
- Cochez la case « Prime avant run », puis cliquez sur « Suivant ». Sélectionnez « réactif rack 2 », définir l'emplacement des réactifs et pipette dans des flacons d'échantillons individuels en conséquence. Insérez la grille arrière dans l'appareil, puis cliquez sur « Démarrer » et entrez un nom d'expérience pour être enregistré pour démarrer la course.
- Analyte Reliure et les cycles de régénération
- Cliquez sur « Fichier | Ouvrir / Nouvelle méthode », sélectionnez « 20140812 hu anti-PCSK9 se liant à hu IgG PCSK9 » et ouvrir la méthode. Passez en revue les paramètres de la méthode.
- Dans « étapes » dosage, assurez-vous il y a 10 cycles dans lesquels « hu PCSK9 » est le nom avec « échantillon » sélectionné dans « PurpOSE ». Le nombre de répétitions est réglé sur « 1 ».
- Dans "Types de cycle", régler le temps de contact à "220" s pour la capture 1 sur le chemin d'écoulement "2", "110" s pour la capture 2 sur le chemin d'écoulement "3" et "55" s pour la capture 3 sur le chemin d'écoulement "4". Le débit est ul / min « 10 » pour tous les cycles de capture.
- Sélectionnez "Sample 1", cochez la case "solution d'échantillon" comme variable. Régler le temps de contact à "600" s et le temps de dissociation à "2700" s sur le chemin d'écoulement "1, 2, 3, 4". Le débit est réglé sur « 30 » ul / min.
- Sélectionnez "Regeneration 1" enter "pH de Glycine-HCl 1,5" dans le champ de la solution et régler le temps de contact à "20" s sur le chemin d'écoulement "1, 2, 3, 4".
- Dans "Paramètres variables", entrez 2 fois le titrage des concentrations de "100 nM - 6,25 nM" pour le cycle 1 à 3, "50 nM - 3,12 nM" pour le cycle 4 à 8, et "5 nM - 0,323 nM" fou cycle 9-10.
- Dans "Run Setup", choisissez le chemin d'écoulement de détection "2-1, 3-1, 4-1", cliquez sur "Suivant", cochez la case "Prime avant run", puis cliquez sur "Suivant".
- Sélectionnez « échantillon et réactif en rack 1 », définissez l'emplacement des réactifs et pipette dans des flacons d'échantillons individuels en conséquence. Insérez la grille dans l'instrument, puis cliquez sur « Démarrer » et entrez un nom d'expérience pour être enregistré pour démarrer la course.
- Analyse des données en utilisant Biaevaluation
- Cliquez sur « Cinétique / Affinity | Surface liée », choisissez Fc « 2-1 », « 3-1 » ou « 4-1 » séparément et vérifier toutes les courbes affichées dans les différentes concentrations d'analyte, ainsi que le « zéro » ébauche de concentration.
- Cliquez sur « Suivant » pour obtenir l'ébauche de tampon courbes soustraites. Cliquez ensuite sur « Kinetics, » choisir le: modèle « 1 1 Reliure », et cliquez sur « Fit » pour obtenir la cinétique Paramé équipée. TERs
- Pour le montage global de plusieurs surfaces mAb, cliquez sur « Multiple R max » au bas et ajoutez les courbes de liaison des autres Fcs pour la même mAb à la liste.
- Cliquez sur « Suivant » pour obtenir tous les vides tampon des courbes de liaison soustraites. Cliquez ensuite sur « Kinetics, » choisir: modèle « 1 1 Reliure », et choisissez pour chaque R max « adapter locale » dans les paramètres pour obtenir les paramètres cinétiques montés au niveau mondial.
3. Mesures cinétique dans le XPR36 ProteOn
- Instrument et Préparation du réactif
- Equilibrer une puce de capteur de GLM et une bouteille de 2 litres de PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% de Tween-20 et 3 mM d'EDTA) en cours d'exécution tampon à la température ambiante pendant 15 min.
- Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur « Ejecter » puis insérez la puce GLM. Régler la température de la puce à « 25 » ° C et la température d'auto-échantillonneur à « 10 » ° C.Cliquez sur « Glycérol Initialisation » et suivez les instructions pour initialiser la incité puce.
- Cliquez sur « Fichier | Ouvrir » un protocole de préconditionnement de la liste, préparer des solutions dans une plaque de 96 puits. Cliquez ensuite sur « Exécuter », sélectionnez le protocole et cliquez sur « Démarrer ».
- Décongeler une aliquote de 1 ml de 400 mM d'EDC et une portion aliquote de 1 ml de 100 mM de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) à la température ambiante.
- Préparer 2 ml de protéine A / G à 60 ug / ml dans 10 mM d'acétate de sodium (pH 4,5) et 500 ul de chaque échantillon mAb à 0,25 pg / mL, 0,125 pg / mL et 0,063 pg / ml dans le PBS-T tampon courant EDTA. Décongeler une fiole congelée de PCSK9 humaine sur la glace.
- Immobilisation, Analyte Reliure et régénération
- Cliquez sur « Fichier | Nouveau | Nouveau protocole ». Dans « Configuration », entrez le nom d'expérience, sélectionnez puce « GLM », sélectionnez « microplaques » et entrez « 2.2 » le volume mL.
- Sélectionner"Protocoles | Samples", définissent "EDC / sulfo-NHS" comme "activateur" dans les puits H1-H6, "Protein A / G" comme "Ligand" dans G1-G6, "Ethanolamine" comme "désactiveur" dans F1-F6 , "Glycine" comme "Regenerator" dans E1-E6, PBS-T-EDTA "comme étant "vide" dans D1-D6, "échantillon de mAb X" comme "ligand" en C1-C6, et "PCSK9 humain" comme" Analyte dans les puits H1-H6 dans une deuxième plaque à 96 puits.
- Sélectionnez « Steps », double cliquez sur « Immobilisation » dans le « Protocole Editor », les étapes comprennent trois injections horizontales ultérieures d'EDC / Sulfo-NHS, la protéine A / G et 1 M éthanolamine chacun à un débit de « 30 » ul / min et un temps de contact de "300" s.
- Cliquer sur « Régénérer », injecter trois « 18 » -s impulsions de glycine (pH 1,5) à « 100 » uL / min dans les deux directions horizontale et verticale, suivie par deux « 60 » -s impulsions du PBS-T-EDTA à "25" ul / minégalement dans les deux sens.
- Cliquer sur « Ligand », injecter mAb mAb 1 2 dans la direction verticale au moyen d'un débit de « 25 » ul / min et un temps de contact de « 160 » s.
- Cliquer sur « Analyte », injecter cinq concentrations de PCSK9 humaine (100 nM à 6,25 nM à 2 fois des dilutions en série) et un tampon à blanc de plus de 6 canaux horizontaux simultanément, à « 40 » ul / min pour « 600 » s de temps d'association suivie par "2700" s de temps de dissociation.
- Cliquer « Régénérer », injecter deux « 18 » -s impulsions de glycine (pH 1,5) à « 100 » uL / min dans les deux directions horizontale et verticale.
- Répéter les étapes ci-dessus après chaque cycle de liaison pour les mAbs restants.
NOTE: En plus de 100 nM - 6,25 nM série de concentrations de PCSK9 humaine, 25 nM - 1,56 nM et 5 nM - 0,313 série de concentration nM sont utilisés. - Préparer les échantillons et les réactifs dans deux plaques à 96 puits en fonction des positions de réactifdéfini à l'étape 3.2.2, puis cliquez sur l'onglet « Exécuter », sélectionnez le protocole / expérience et cliquez sur « Démarrer ».
- Analyse des données en utilisant ProteOn Gestionnaire
- Cliquez sur « Panneau de type » et sélectionnez « Analyte ». Ensuite, cliquez sur « Protocole Step » et sélectionnez toutes les courbes de liaison dans la liste.
- Cliquez sur « automatique » et cliquez sur « Process | canal de référence | Interspot ». Cliquez ensuite sur "Processus | Référence Double | Ligne | A6".
- Cliquez sur « Créer Dataset » pour enregistrer des ensembles de données individuels pour chaque mAb à trois surfaces pour l'analyse cinétique.
- Cliquez sur « Analyse Dataset », sélectionnez chaque jeu de données mAb et cliquez sur « Analyse | cinétique ». Choisissez le modèle « Langmuir » et « ka / kd simultanée » et cliquez sur « Suivant ».
- Mettez en évidence à la fois la plage en forme d' association et de dissociation, choisissez « Local » R max, et cliquez sur « Suivant » pour effectuer l'ajustement pour obtenirles paramètres cinétiques ajustés.
- Répétez l'étape ci - dessus mais choisissez « groupé » R max pour le montage pour obtenir les valeurs expérimentales R max pour le calcul de l'activité de surface du ligand.
4. Les mesures cinétiques dans l'Octuor RED384
- Réactif et préparation de la plaque d' échantillon
- Préparer 50 ml de 1x KB (Kinetic tampon contenant du PBS pH [7,4], 0,02% de Tween-20, 0,1% d'albumine et 0,05% d'azoture de sodium) en diluant une solution mère 10x dans du PBS.
- Répartir le 1x KB dans une plaque à 96 puits à 200 ul par puits. Hydrate 48 capture anti-humain (AHC) Conseils de biocapteurs dans ces puits individuels pendant au moins 10 min.
- Préparer chaque échantillon mAb à 20 pg / ml, 10 pg / ml et 5 pg / ml dans 1 x KB, ainsi que PCSK9 humaine à 7 concentrations titrés à partir de 100 nM à 1,56 nM à 2 fois des dilutions en série.
- Charger les échantillons mAb dans une microplaque à 384 puits à fond incliné (réféRRED à mesure que la plaque de réactif) et les solutions de PCSK9 humains dans une autre microplaque à 384 puits (appelée la plaque d'échantillon) à 90 pl par puits.
- Série de charge de 1 x KB et de la glycine (pH 1,5) dans les puits des solutions à l'intérieur de la plaque d'échantillon.
REMARQUE: Ces puits 1x KB sont utilisés pour pré-conditionnement de la puce, la stabilisation de base, et la dissociation de l'analyte. La solution de glycine est utilisé pour la régénération.
- Configuration Méthode expérimentale
- Dans le logiciel d'acquisition de données, cliquez sur « Expérience | Assistant Nouvelle Expérience | New Kinetics Expérience | base Kinetics ».
- Dans « Définition de la plaque », suivez les étapes ci-dessous pour définir les types d'échantillons et les positions.
- Sélectionnez les canaux « 16 » et le format « 384 puits ».
- Définir les emplacements d'échantillon et de réactif dans l'affichage de la plaque en maintenant enfoncée la touche Maj tout en cliquant avec le bouton gauche du puits pour mettre en évidence 16 puits à la fois.
- Faites un clic droit sur leles puits contenant les échantillons mAb et sélectionnez « Load » pour signifier l'étape au cours de laquelle les mAbs sont chargés (ou pris) sur les capteurs AHC. Entrez les noms mAb et les concentrations dans le tableau sur le côté droit.
- Un clic droit sur les puits contenant le PCSK9 humain et sélectionner « Sample » pour indiquer l'étape à laquelle les capteurs sont capturés mAb croisement et les interactions de liaison sont mesurées. Entrer les concentrations molaires correspondantes dans la table sur le côté droit.
- Définir les puits contenant 1x KB comme « tampon » ou « neutralisation », et les puits contenant de la glycine en tant que « régénération ».
- Dans « Définition de dosage », suivez les étapes ci-dessous pour définir la configuration expérimentale:
- Cliquez sur « Ajouter » et sélectionnez « base », « régénération », « Equilibrage », « Chargement », « Association », et « Dissociation » étapes à la liste avec des temps de « 30 » s, « 30" , "18" s, "200", "500 s" s, et "1800" s, respectivement. La vitesse d'agitation est "1000 rpm".
- Pour ajouter les étapes à « dosage étapes Liste », cliquez d'abord sur une étape, puis cliquez sur les puits situés soit dans l'échantillon ou la plaque de réactif. Les étapes sont les suivantes:
- Équilibration-régénération: condition préalable les capteurs AHC par trois cycles des creux de "15" à la glycine (pH 1,5), alternant avec des "15" -s creux dans 1x KB.
- Chargement: capturer les échantillons mAb sur les capteurs AHC pour « 200 » s.
- Ligne de base: établir le signal BLI pour « 60 » s avant l'étape d'association.
- Association: tremper les capteurs dans des puits contenant des concentrations variables de PCSK9 humain pour un « 500 » période d'association -s.
- Dissociation: tremper les capteurs liés PCSK9-dans de nouveaux puits de KB 1x pour un « 1800 » période de dissociation -s.
- La régénération: tremper le mAb-PCSK9 bound capteurs dans des puits de glycine (pH 1,5) avec deux « 18 » -s impulsions entre chaque cycle de liaison.
- Dans « revue » Les expériences, faites glisser à travers les étapes et apporter les changements nécessaires en remontant aux onglets précédents.
- Dans « Exécuter expériences », entrez un temps de retard de « 60 » et secouer la plaque d'échantillon en attendant. Régler la température de la plaque à « 25 » ° C et appuyez sur « GO ».
- Analyse des données en utilisant le logiciel d' analyse des données de ForteBio
- Cliquez sur « Sélection des données | Données Loaded | Kinetics | anticorps PCSK9 se liant à PCSK9 23/07/14 »
- Dans « Traitement », traiter les données comme suit:
- Dans l'étape 1: cliquez sur « Sensor Sélection » pour mettre en évidence des capteurs dans H1-H6, faites un clic droit sur eux et cliquez sur « Modifier le type de capteur | Capteur de référence. »
- À l'étape 2, cochez la case « Soustraction » et sélectionnez « Capteurs moyen de référence »; à soustraire chaque échantillon de capteur actif à partir de la moyenne des 6 sondes tampons vides.
- À l'étape 3, cliquez sur « Aligner l'axe Y » et sélectionnez « base » pour aligner toutes les courbes de liaison à l'étape de base avant l'association.
- À l'étape 5, cochez la case « Savitsky-Golay filtrage » pour lisser les courbes de liaison en augmentant le rapport signal-bruit, et cliquez sur « Processus de données! ».
- Dans l'étape 6, cliquez sur « Résultats » transformés pour afficher les courbes de liaison traitées.
- À l'étape 7, passez en revue les quatre panneaux sur le droit d'afficher les courbes de liaison après chaque étape de traitement, et cliquez sur « Enregistrer données traitées ».
- Modèle: « 1 1 » dans « Analyse », cochez la case « Association et Dissociation » et choisissez.
- Mettre en évidence les courbes de liaison pour « Global (full) » adapter et de les regrouper par « couleur ». Utilisez « R max liée » pour effectuer le raccord de groupe sur des capteurs revêtus de la même mAb concentration pour obtenir les valeurs expérimentales R max pour le calcul de l'activité de surface de ligand, et « R max dissocié par le capteur » pour effectuer raccord global sur les capteurs revêtus avec de multiples concentrations de mAb.
- Cliquez sur « Fit » courbes pour obtenir les paramètres cinétiques montés. Enregistrer les résultats à la fin de chaque analyse de montage.
5. Mesures cinétiques dans l'IBIS MX96
- Instrument et Préparation du réactif
- Equilibrer une puce COOH-G à la température ambiante pendant 15 min.
- Préparer une bouteille de 1 litre de tampon de course du système (PBS [pH 7,4], Tween-20 0,01%) et le tampon d'immobilisation (10 mM d'acétate de sodium [pH 5,0], 0,01% de Tween-20).
- Préparer chaque mAb de 20 ug / ml à 0,16 ug / ml par dilutions en série à la fois dans le tampon de migration système 2 fois et l'acétate de sodium (pH 5,0) tampon d'immobilisation.
- Distribuer les échantillons en deux mAb septembrearate des plaques à 96 puits dans lequel chaque mAb occupe 8 puits verticaux dans les concentrations de titrage à 200 ul par puits.
- aliquots dégel de 400 mM d'EDC et 100 mM de sulfo-NHS à la température ambiante.
- Préparer 300 ul de protéine A / G à 50 ug / mL dans le tampon d'immobilisation de l'acétate de sodium (pH 5,0) et on pipette dans un flacon.
- Préparer 200 ul de PCSK9 humain de 100 nM à 0,39 nM par 2 fois des dilutions en série dans le système tampon en cours d'exécution. les dans des flacons séparés Pipeter.
- Cinétique multi-cycles avec puces à anticorps couplé par une amine
- Mélanger la aliquots EDC / NHS-sulfo (400 mM / 100 mM) et distribuer le mélange dans les 48 premiers puits d'une nouvelle plaque de 96 puits à 200 ul par puits.
- Placer la plaque source Acm (dilué dans de l'acétate de sodium [pH 5,0]) en position 2 et la plaque de réactif EDC / NHS-sulfo en position 1 à l'intérieur de l'imprimante.
- Installation de la puce de capteur dans la CFM. Ouvrez le "CFM 2.0" software, puis cliquez sur "Paramètres de charge | 96 Amine couple". La puce à anticorps 10 x 8 est créé comme suit:
- Fournir la EDC / NHS-sulfo dans la moitié supérieure de la plaque de réactif à l'aide du capteur 48 de microcanaux, et les cycles sur la surface de détection de « 5 » min.
- Fournir les échantillons de mAb dans la moitié supérieure de la plaque de source au capteur et le cycle eux à travers les surfaces activées pour min « 10 ».
- Remettre le tampon d'immobilisation à partir d'un tube conique de 50 ml sur la surface de l'anticorps de « 5 » min.
- Répéter les procédures ci-dessus pour les échantillons restants mAb dans la moitié inférieure de la plaque de la source.
- Ancrer la puce de capteur imprimé dans l'instrument. Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur « Fichier | Connexion | Ouvrir mesure | Mesure existante » et sélectionnez « 15/08/2014 ».
- Dans « Général », sélectionnez « G - Premier système » sous « script système complet ». Ensuite, sélectionnez « G - QuEnch » pour désactiver les surfaces mAb en injectant 150 ul 1 M d'éthanolamine.
- Cliquez sur « Camera » pour visualiser les tableaux mAb et régler le contraste si nécessaire. Placez les boîtes carrées rouges pour entourer les taches mAb, et déplacer les boîtes carrées vert aux interspots situés entre les points mAb actifs pour le référencement.
- Dans "l'analyse du cycle", sélectionnez "A - AP Run Standard" sous "IBIS Scripts". Set 1,0 min pour la ligne de base, 10,0 min pour l'association, et 90 étapes de dissociation à 8 ul / la vitesse.
- A l'intérieur des « cycles », injecter PCSK9 humaine une concentration à la fois après cinq injections de tampon. Régénérer les surfaces mAb avec de la glycine pH 2,0 entre chaque cycle de liaison.
- Cinétique du cycle unique avec des puces à anticorps capturé Fc-
- Installer une nouvelle puce de capteur dans la CFM. Répéter les étapes 5.2.3 à 5.2.5 ci-dessus en remplaçant les échantillons mAb avec de la protéine A / G.
- Retirer lepuce de capteur à partir de la MX96 et l'insérer dans l'imprimante de CFM.
- Livrer les mAbs dans la moitié supérieure de la plaque à la surface de détection de la protéine A / G en utilisant 48 des microcanaux, et le cycle entre eux à travers la surface en utilisant un écoulement bidirectionnel pendant 10 min.
- Répétez l'étape ci-dessus pour les échantillons restants mAb dans la moitié inférieure de la plaque.
- Ancrer la puce de capteur imprimé dans l'appareil MX96. Dans le logiciel d'acquisition de données, cliquez sur « Fichier | Connexion | Ouvrir mesure | Mesure existant | Suivant » et sélectionnez « protéine A + G liant kinetic7.30.14 ».
- Cliquez sur « caméra » pour visualiser les tableaux mAb et régler le contraste si nécessaire. Placez les boîtes carrées rouges pour entourer les taches mAb, et déplacer les boîtes carrées vert aux interspots situés entre les points mAb actifs pour le référencement.
- Dans "l'analyse du cycle", sélectionnez "A - AP Run Standard" sous "IBIS Scripts". Set "1,0 min" pour la ligne de base, « 10.0min » pour l'association, et "" étapes de dissociation à "10 8 ul / sec" vitesse.
- A l'intérieur des « cycles », injecter PCSK9 humaine une concentration à la fois après cinq injections de tampon. Aucune régénération est effectuée entre chaque injection d'analyte.
- Analyse des données en utilisant SPRINT et Scrubber
- Dans le sofware SprintX, cliquez sur « Fichier | Ouvrir Triangle Fichier », sélectionnez toutes les injections d'échantillons dans la liste, cochez la case « Enregistrer le fichier SprintX », « étalonnage », et « RLL détermination » avant de cliquer sur « Analyser ».
REMARQUE: Les valeurs RLL correspondent aux niveaux mAb immobilisés / capturés sur la surface du capteur. - Cochez la case « Référencer » et sélectionnez « Local » pour utiliser les points de référence adjacents. Jetez également un « Aligner » sur la première injection, puis cliquez sur « Démarrer Automation. »
- Dans l'onglet série, sélectionnez « Afficher les règles dans la barre d'outils, » les ajusterpour sélectionner une petite région de la ligne de base immédiatement avant la première injection de l'échantillon, et sélectionnez « zéro ».
- Générer un fichier .IBMX pour l'analyse dans le Scrubber en sélectionnant « Exporter vers un fichier IBMX » puis cliquez sur « Démarrer Automation. »
- Lancez dépoussiéreur et charger le fichier .IBMX. Entrez « 100N » comme le « Stock conc » et « 2 » comme le « facteur de dilution ».
- données sur les cultures, supprimez toutes les base avant le début de l'injection, et aligner les courbes de liaison au début de l'association.
NOTE: Pour l'expérience cinétique unique de cycle, ne sont pas alignées les courbes. - Allez à la « Kinetics » onglet, ajustez la règle pour l'heure de fin d'injection, sélectionnez « k d » et en forme, puis « fix k d. » Sélectionnez « k k d » et l' adapter à nouveau.
- Flotteur la colonne k d et ajuster à nouveau pour affiner l'ajustement.
REMARQUE: Pour le montage des courbes de liaison à cycle unique, Cliquez sur « Opte » et décochez « Soustraire », puis sélectionnez « séparée » et flotter la colonne « Commencer Inj » pour adapter les profils d'association à une origine de base théorique. - Passez en revue les paramètres cinétiques montés dans les onglet Résultats.
- Dans le sofware SprintX, cliquez sur « Fichier | Ouvrir Triangle Fichier », sélectionnez toutes les injections d'échantillons dans la liste, cochez la case « Enregistrer le fichier SprintX », « étalonnage », et « RLL détermination » avant de cliquer sur « Analyser ».
Representative Results
La figure 1 montre l'image de la puce à anticorps de la CFM et les niveaux mAb repérés par les deux procédés d'immobilisation, et la figure 2 montre les sensorgrammes de liaison correspondants générés dans le MX96 à partir des mesures cinétiques à cycles multiples cinétique et le cycle unique sur ces réseaux de mAb . Le temps réel de liaison et les courbes cinétiquement ajustées à partir de plusieurs surfaces revêtues d' anticorps générés dans les quatre plateformes de biocapteurs sont représentés sur les figures 3 - 6. La figure 7 montre la comparaison des taux cinétiques finales et les constantes de liaison d'équilibre obtenues à partir de l'analyse globale de ces courbes de liaison. L'association individuelle (K a), de dissociation (K d), et à l' équilibre (K D) les constantes de liaison sont présentés dans le tableau 1. Pour démontrer la variabilité des ensembles de données générés dans le même instrument,
Figure 1. Multiplex Ligand de tableaux couplé Amine (A) et Fc-capturée (B) Anticorps surfaces de l' impression CFM dans le IBIS MX96. Les images des matrices imprimées sont présentées dans les panneaux de gauche, où les zones grises entourées par des carrés rouges indiquent la présence d'anticorps. Les interspots sombres situées entre les points d'anticorps actifs sont utilisés pour la soustraction de référence. Chaque colonne contient un anticorps imprimé aux concentrations de titrage identifiés ci-dessous et à la gauche de l'image. Les quantités des anticorps imprimés quantifiés en calculant la différence en vrac décalages entre les positions actives et de référence sont présentées dans les panneaux de droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Comparaison des temps réel de liaison sensorgrammes de plusieurs cycles (A) et à cycle unique (B) Expériences cinétiques dans l'IBIS MX96. Les injections séquentielles de PCSK9 humain à des concentrations croissantes à travers les 10 x 8 puces à anticorps sont notés ci-dessus de chaque segment de détecteur correspondant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Liaison sensorgrammes des anticorps humains avec Captured Interagir PCSK9 et 1: 1 Modèle Kinetic Fit surimpressions dans le ProteOn XPR36. Les interactions sont évalués sur haut (panneaux supérieurs), médium- (panneaux du milieu) et faible (panneaux inférieurs) surfaces de densité. Les lignes noires lisses superposées représentent la forme cinétique des signaux de réponse de liaison à différentes concentrations de l'homme PCSK9 (lignes colorées) à un modèle 1: 1 d'interaction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Liaison sensorgrammes des anticorps humains avec Captured Interagir PCSK9 et 1: 1 Modèle Kinetic Fit Superpositions dans l'Octuor RED384. Les interactions sont évalués sur haut (panneaux supérieurs), moyen (panneaux du milieu) et faible (panneaux inférieurs) surfaces de densité. Les lignes rouges superposées représentent la forme cinétique des signaux de réponse de liaison à différentes concentrations de PCSK9 humaines (lignes colorées) d'un mélange 1: 1 modèle d'interaction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. La liaison des sensorgrammes couplés Amine (A) et Fc-capturés (B) Interaction avec anticorps humain PCSK9 et 1: 1 modèle cinétique Fit overlays dans le IBIS MX96. Les profils de liaison sont organisées en 10 x 8 panneaux qui suivent le plan de la plaque de matrice sur la figure 1. Les lignes noires représentent les signaux de réponse de liaison enregistrés à différentes concentrations de PCSK9 humains, et les lignes rouges superposées représentent les courbes ajustées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
7" gurer src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Figure 7. Comparaison de l'Association k a (A), de dissociation K d (B), et d' équilibre K D (C) la liaison Constantes générée par les plates - formes Four biocapteur. Les paramètres cinétiques sont dérivées de l' analyse globale des courbes de liaison des figures 3 - 6. Les instruments sont représentés comme suit: Biacore T100 (bleu), ProteOn XPR36 (vert), Octuor RED384 (rouge), IBIS MX96, couplé amine (violet), et IBIS MX96, Fc rattrapées (orange). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8. Comparaison de la cohérence des taux cinétique Constantes sur plusieurs anticorps de surface dans Densités CCFI minerai T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, couplé par une amine (D), et IBIS MX96, Fc-capturée (E). Les paramètres cinétiques k a (sous-panneaux supérieurs), k d (sous-panneaux intermédiaires), et K D (sous-panels du bas) sont dérivées de l' analyse de groupe à une densité de surface de l' anticorps particulier. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9. Activités de liaison de l'anticorps Surfaces et leurs écarts - types (barres d'erreur) dans les plates - formes Quatre biocapteur. Les valeurs sont calculées en utilisant les équations décrites dans les articles de recherche 17.large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| k un | k d | K D | |
| (M -1 s -1) | (s -1) | (nM) | |
| mAb 1 | 11,7 (7,8) x 10 5 | 4,89 (4,18) x 10 -5 | 0,052 (0,05) |
| mAb 2 | 1,53 (0,28) x 10 5 | 1,30 (1,54) x 10 -5 | 0,092 (0,12) |
| mAb 3 | 11,4 (8,3) x 10 5 | 27,6 (11,0) x 10 -5 | 0,333 (0,20) |
| mAb 4 | 3,61 (1,6) x 10 5 | 20,1 (12,3) x 10 -5 | 0,659 (0,54) |
| mAb 5 | 0,59 (0,21) x 10 5 | 3,46 (2,50) x 10 -5 | 0,663 (0,46) |
| mAb 6 | 1,19 (0,78) x 10 5 | 7,21 (3,83) x 10 -5 | 0,894 (0,64) |
| mAb 7 | 1,29 (0,53) x 10 5 | 16,4 (5,63) x 10 -5 | 1,57 (1,02) |
| mAb 8 | 4,02 (2,23) x 10 5 | 22,8 (10,7) x 10 -5 | 0,768 (0,68) |
| mAb 9 | 4,20 (2,13) x 10 5 | 6,67 (4,3) x 10 -5 | 0,197 (0,16) |
| mAb 10 | 1,20 (0,49) x 10 5 | 12,5 (7,64) x 10 -5 | 1,27 (0,80) |
Tableau 1: Taux et cinétique d' équilibre de 10 Constantes liaison des anticorps monoclonaux obtenus par montage global des courbes de liaison de quatre biocapteurs Instruments à 1: 1 Modèle d'interaction.
Discussion
Notre étude comparative en tête-à-tête montre que chaque plate-forme de biocapteur a ses propres forces et faiblesses. Même si les profils de liaison des anticorps sont similaires par comparaison visuelle (figures 3 - 6), et l'ordre de rang des constantes cinétiques acquises sont très cohérentes à travers les instruments (figure 7), nos résultats montrent que les instruments fondés sur SPR avec fluidique à écoulement continu) sont mieux à la résolution des interactions de haute affinité avec les vitesses de dissociation lente. La dérive vers le haut pendant la phase de dissociation est observée dans les groupes de données (par exemple, 2 mAb, mAb 5, et mAb 9; Figure 5) généré par l'instrument libres fluidique-BLI. Cette constatation peut être attribuée en grande partie à l'évaporation de l'échantillon au fil du temps dans la microplaque, ce qui est une première limite du système. Avec cette limitation inhérente, le temps expérimental est également limitée à moins de 12 h; les expériences ont donc été programmées avec shOrter fois (500 de l'association et de dissociation 30 min) par rapport à celles des autres plates-formes (association de 10 min et 45 min de dissociation). Cependant, ce qui réduit le temps expérimental ne semble pas atténuer l'impact de l' évaporation sur la qualité / la cohérence des données, les constantes de vitesse générées par l'instrument à base de BLI montrent moins la linéarité en raison des fluctuations de certains des hors-taux (figure 8C ). En plus de l'évaporation de l'échantillon, les différences dans les réactifs de capture utilisés peuvent aussi avoir contribué aux différences dans les résultats obtenus. Alors que la protéine A / G a été utilisé dans les trois plates-formes à base fluidiques-SPR, capteurs AHC ont été utilisés dans la plate-forme de BLI non-fluidiques. Étant donné que la protéine A / G est susceptible d'avoir une affinité plus faible pour les mAbs que ne l'AHC, une surface de biocapteur à base d'anticorps, les hors-taux du complexe antigène-anticorps monoclonal à partir des surfaces de protéine A / G peut apparaître artificiellement plus rapidement que celles obtenu à partir de la surface AHC. Cette possibilité est prise en charge by les données expérimentales montrent que les valeurs de taux générés par la plate - forme BLI étaient toujours inférieures à celles obtenues à partir des autres instruments (Figure 7, ligne rouge). Néanmoins, la plate-forme de BLI a des avantages sur les autres plates-formes. Par exemple, il est très flexible en ce qui concerne le choix du capteur et la configuration d'essai en raison des différents capteurs pré-enduit pour une utilisation immédiate. Dans nos expériences, l'utilisation des capteurs AHC a éliminé la nécessité pour les étapes d'immobilisation du ligand, ce qui réduit le temps de préparation. En outre, la plate-forme de BLI nécessite beaucoup moins d'entretien par rapport aux autres plates-formes fluidiques de Spr, qui comportent des tubes et des configurations commutateur de valeur complexe. Cette caractéristique est un avantage pour les expériences sur des échantillons bruts qui peuvent causer des problèmes de colmatage et de contamination.
Comme la demande pour l'identification efficace, rapide et précise des candidats thérapeutiques augmente, la nécessité de bile débit de osensor augmente également. Parmi les quatre plateformes de biocapteurs, le débit du biocapteur capable d'imprimer de réseau de 96 ligand est le plus élevé, suivi par le biocapteur couplé à un entrecroisement le format 36-ligand et le biocapteur à base de BLI avec affichage simultané de 16 canaux, ce qui augmente finalement le nombre d'interactions mesurées en un seul cycle de liaison 96, 36 et 16, respectivement. Ces capacités de débit sont nettement supérieure à celle de la plate-forme traditionnelle SPR, qui est limitée par ne comportant que quatre cellules d'écoulement reliées par un seul flux série. Étant donné que nos expériences impliquaient un ensemble d'échantillons relativement faible de 10 anticorps monoclonaux évalués à des densités de surface multiples avec de longs temps de dissociation, les instrumentaux ont joué un débits rôle modéré dans la détermination de l'efficacité des expériences. Il n'y avait pas de différence significative dans les temps expérimentaux des trois plates-formes à haut débit, et dans tous les cas, les expériences ont été réalisées en un jour. D'autre part, les expériences traditionnelles de flux SPR série requis 3 jours pour compléter, en dépit de l'automatisation des rendez-vous loin de l'acquisition de données après l'installation. Dans d' autres études qui impliquent un grand nombre d'échantillons (dans les centaines ou des milliers), à des fins de classement hors taux / dépistage cinétique ou épitope binning, le débit devient un facteur critique.
Bien que le débit de l'hôtel Ibis MX96 est des ordres de grandeur supérieure à celle des autres biocapteurs et est donc un choix optimal à ces fins, il a quelques défauts. En particulier, l'impression de la matrice par le CFM montre de grandes incohérences de surface (figure 1) et de reproductibilité des données réduite (Figure 8D et 8E). Pour les mesures cinétiques précises, la quantité de ligand sur la surface de biocapteur est un paramètre critique qui doit être contrôlé pour faire en sorte que les réponses de liaison ne sont pas perturbés par des facteurs secondaires tels quetransfert de masse ou un encombrement stérique. Pour le T100 Biacore et ProteOn XPR36, les niveaux optimaux de R L ont été déterminées sur la base du calcul standard de série R valeurs max tel que décrit dans l'article de recherche 17. D'autre part, pour les Octet RED384 et les plates-formes IBIS MX96, les niveaux de capture de mAb ont été obtenus de manière empirique en utilisant une série de 2 fois en série d'anticorps dilué à des moments constants. Le manque de connaissance ou de contrôle de l'étape de capture a entraîné une surface à haute densité et haute des signaux de réponse de liaison (figure 2) qui peut avoir compromis l'exactitude des constantes de vitesse cinétique. En outre, la séparation de l'imprimante à partir du détecteur présente également un SPR défi lors de la réalisation de multiples mesures du cycle de liaison impliquant régénérations. La seule façon de procéder à la configuration de la cinétique multi-cycle est par couplage d'aminé directe des mAbs, par opposition à saisir par l'intermédiaire du mAb Fc par la protéine A immobilisée / Gsurface dans les trois autres plateformes de biocapteurs. En conséquence, une expérience supplémentaire de reconnaissance de la régénération a été nécessaire pour déterminer les conditions optimales de régénération. Le résultat de cette configuration est liée à une ~ 90% de l' activité observée surface inférieure par rapport à la méthode de capture Fc (figure 9), en plus d'un temps plus long expérimental. Pour exécuter la méthode de capture Fc, une approche cinétique unique cycle alternatif a été adopté. Cette approche implique l'injection séquentielle de l' analyte à des concentrations croissantes sans régénération entre chaque injection (Figure 2). Cette très pratique, mais approche moins souvent appliquée raccourci non seulement le temps expérimental et réduit la consommation de réactif, mais aussi produit des constantes cinétiques très similaires à celles des autres biocapteurs (figure 7). Par conséquent, l'application de cette approche cinétique unique du cycle surmonte la limitation de configuration inhérente de l'instrument et présente unepossibilité d'obtenir des constantes de vitesse cinétique à haute résolution d'une manière à haut débit.
Malgré le débit étant une limitation majeure dans le Biacore T100, nos résultats montrent collectivement qu'il a généré les données les plus compatibles avec la plus haute qualité. Cela a été suivi par le ProteOn XPR36, qui a ~ 10 fois un débit plus élevé. Leur capacité à générer des données de haute qualité devient un avantage lors de la caractérisation des interactions anticorps-antigène à haute affinité qui peuvent être techniquement difficile lorsque les limites de détection des instruments sont atteints. Bien que les limites systématiques dans l' instrumentation de l'Octuor RED384 empêchent la mesure précise des constantes de vitesse de dissociation (c. -à- deçà de la sensibilité pour résoudre la décomposition du signal suffisant pour lent hors taux), aussi bien le Biacore T100 et ProteOn XPR36 peut fournir sensible et fiable la détection de la différenciation.
Disclosures
frais pour la publication de cette vidéo ont été payés par l'article Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Noah Ditto et Adam Miles d'assistance technique sur le IBIS MX96.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10x | FortéBio | 18-1092 | 10x concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
References
- Cooper, M. A.
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
