उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी काइनेटिक्स का निर्धारण चार Biosensor प्लेटफार्मों का उपयोग
Summary
हम यहाँ का वर्णन बंधन आकर्षण और चार आमतौर पर इस्तेमाल किया बायोसेंसर प्लेटफार्मों का उपयोग गतिकी एंटीबॉडी प्रतिजन की माप के लिए प्रोटोकॉल।
Abstract
लेबल से मुक्त ऑप्टिकल biosensors biomolecular बातचीत के लक्षण वर्णन के लिए दवाओं की खोज में शक्तिशाली उपकरण हैं। इस अध्ययन में, हम अपने प्रयोगशाला बंधन आकर्षण और दस उच्च आत्मीयता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) मानव proprotein convertase subtilisin केक्सिन प्रकार 9 के खिलाफ (PCSK9) की गतिकी का मूल्यांकन करने में चार नियमित तौर पर इस्तेमाल बायोसेंसर प्लेटफार्मों के उपयोग का वर्णन। दोनों Biacore T100 और ProteOn XPR36 अच्छी तरह से स्थापित सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) तकनीक से प्राप्त कर रहे हैं, पूर्व चार प्रवाह धारावाहिक प्रवाह विन्यास से जुड़े हुए कोशिकाओं, एक तात्कालिक 6 x 6 crisscross के माध्यम से समानांतर में जबकि बाद प्रस्तुत 36 प्रतिक्रिया स्पॉट है microfluidic चैनल विन्यास। एक प्रकार की पक्षी MX96 भी एक अतिरिक्त इमेजिंग विशेषता यह है कि स्थानिक उन्मुखीकरण में पता लगाने प्रदान करता है के साथ एसपीआर सेंसर प्रौद्योगिकी के आधार पर चल रही है,। यह पता लगाने की तकनीक सतत प्रवाह Microspotter (CFM) के साथ मिलकर ई से काफी प्रवाह क्षमता का विस्तारएक साथ मल्टीप्लेक्स सरणी मुद्रण और 96 प्रतिक्रिया खेल का पता लगाने के nabling। इसके विपरीत, ओकटेट RED384 BioLayer इंटरफेरोमेट्री (BLI) ऑप्टिकल सिद्धांत, फाइबर ऑप्टिक जांच बायोसेंसर हस्तक्षेप पैटर्न का पता लगाने के रूप में अभिनय के साथ पर आधारित है टिप सतह पर बातचीत बंधन पर बदल जाता है। एसपीआर आधारित प्लेटफार्मों के विपरीत, BLI प्रणाली सतत प्रवाह fluidics पर निर्भर नहीं करता; बजाय, सेंसर सुझावों रीडिंग इकट्ठा जब वे कक्षीय आंदोलन के दौरान एक 384 अच्छी तरह से microplate के analyte समाधान में डूब जाता है।
इन बायोसेंसर प्लेटफार्मों से प्रत्येक की अपनी फायदे और नुकसान हैं। 1 आणविक बातचीत मॉडल: इन उपकरणों की गुणवत्ता गतिज डेटा प्रदान करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगों है कि एक ही परख प्रारूप और एक ही उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों का उपयोग एंटीबॉडी प्रतिजन गतिकी कि सरल 1 फिट चिह्नित करने के लिए उदाहरण देकर स्पष्ट करना क्षमता का एक प्रत्यक्ष तुलना प्रदान करने के लिए ।
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे सिर-से-शीर्ष तुलना अध्ययन से पता चलता है कि प्रत्येक बायोसेंसर मंच अपनी अपनी शक्तियों और कमजोरियों है। हालांकि एंटीबॉडी के बंधन प्रोफाइल दृश्य तुलना द्वारा समान (आंकड़े 3 – 6) हैं, और हासिल कर ली गतिज दर स्थिरांक की रैंक आदेश वाद्यों में अत्यधिक संगत कर रहे हैं (चित्रा 7), हमारे परिणाम है कि एसपीआर आधारित के साथ उपकरणों को दिखाने सतत प्रवाह fluidics) धीमी गति से पृथक्करण दर के साथ उच्च आत्मीयता बातचीत को हल करने में बेहतर हैं। पृथक्करण चरण के दौरान ऊपर की ओर बहाव डेटासेट में मनाया जाता है (जैसे, mAb 2, mAb 5, और mAb 9; चित्रा 5) BLI fluidics मुक्त साधन द्वारा उत्पन्न। यह निष्कर्ष microplate, जो प्रणाली का एक प्राथमिक सीमा है में समय के साथ नमूना वाष्पीकरण के बड़े हिस्से में जिम्मेदार ठहराया जा सकता। इस निहित सीमा के साथ, प्रयोगात्मक समय भी कम से कम 12 घंटे तक ही सीमित है; प्रयोगों इसलिए श के साथ प्रोग्राम किया गयाorter बार (500 रों संघ और 30 मिनट के पृथक्करण) (10 मिनट संघ और 45 मिनट के पृथक्करण) अन्य प्लेटफार्मों के उन लोगों की तुलना में। हालांकि, प्रयोगात्मक समय छोटा करने डेटा की गुणवत्ता / स्थिरता पर वाष्पीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए प्रकट नहीं किया था, के रूप में दर BLI आधारित साधन द्वारा उत्पन्न स्थिरांक (बंद दरों में से कुछ में उतार-चढ़ाव का एक परिणाम चित्रा 8C के रूप में कम linearity दिखाने )। नमूना वाष्पीकरण के अलावा, कब्जा इस्तेमाल किया अभिकर्मकों में मतभेद भी प्राप्त परिणामों में मतभेद के योगदान हो सकता है। प्रोटीन A / G तीनों fluidics आधारित एसपीआर प्लेटफार्मों में इस्तेमाल किया गया था, वहीं AHC सेंसर गैर fluidics BLI मंच में इस्तेमाल किया गया। के बाद से प्रोटीन A / G Mabs के लिए एक कमजोर आत्मीयता से करता AHC, एंटीबॉडी आधारित बायोसेंसर सतह से प्रोटीन A / G सतहों mAb प्रतिजन परिसर के बाहर की दरों कृत्रिम रूप से उन लोगों की तुलना में तेजी से प्रकट हो सकता है की संभावना है AHC सतह से प्राप्त की। इस संभावना ख समर्थित हैy प्रयोगात्मक दिखा रहा है कि ऑफ दर BLI मंच द्वारा उत्पन्न मूल्यों अन्य उपकरणों (चित्रा 7, लाल रेखा) से प्राप्त उन लोगों की तुलना में लगातार कम थे डेटा। फिर भी, BLI मंच अन्य प्लेटफार्मों से अधिक विभिन्न फायदे हैं। उदाहरण के लिए, यह तत्काल उपयोग के लिए विभिन्न पूर्व लेपित सेंसर की वजह से सेंसर चुनाव और परख विन्यास के संबंध में अत्यधिक लचीला है। हमारे प्रयोगों में, AHC सेंसर के उपयोग ligand स्थिरीकरण चरणों की आवश्यकता को समाप्त, तैयारी के समय को कम करने। इसके अलावा, BLI मंच अन्य fluidics एसपीआर प्लेटफार्मों, जो जटिल ट्यूबिंग और मूल्य स्विच विन्यास की सुविधा की तुलना में बहुत कम रखरखाव की आवश्यकता है। यह सुविधा कच्चे तेल के नमूने है कि जाम और प्रदूषण समस्याएं हो सकती हैं से जुड़े प्रयोगों के लिए एक फायदा है।
चिकित्सकीय उम्मीदवारों बढ़ जाती है की, कुशल तेजी से, और सटीक पहचान के लिए मांग, द्वि के लिए जरूरत के रूप मेंosensor प्रवाह क्षमता भी बढ़ रहा है। चार बायोसेंसर प्लेटफार्मों के बीच, बायोसेंसर 96 ligand सरणी मुद्रण करने में सक्षम से प्रवाह उच्चतम, बायोसेंसर एक crisscrossing 36-ligand प्रारूप और 16 चैनल एक साथ पाठ्यांकन BLI आधारित बायोसेंसर के लिए युग्मित है, जो अंततः वृद्धि के बाद है 96, 36 और 16 में क्रमश: के लिए एक एकल बाध्यकारी चक्र में मापा जाता इंटरैक्शन की संख्या। ये throughput क्षमताओं पारंपरिक एसपीआर मंच है, जो केवल चार प्रवाह एक भी धारावाहिक प्रवाह से जुड़े हुए कोशिकाओं होने से सीमित है की तुलना में काफी अधिक है। के बाद से हमारे प्रयोगों 10 में लंबे समय के पृथक्करण समय के साथ कई सतह घनत्व का मूल्यांकन Mabs की एक अपेक्षाकृत छोटी नमूना सेट शामिल, वाद्य throughputs प्रयोगों की दक्षता का निर्धारण करने में एक उदारवादी भूमिका निभाई है। वहाँ तीन उच्च throughput प्लेटफार्मों की प्रयोगात्मक समय में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे, और सभी मामलों में प्रयोगों एक दिन में पूरा किया गया। दूसरी ओर, पारंपरिक धारावाहिक प्रवाह एसपीआर प्रयोगों 3 दिन पूरा करने के लिए, सेटअप के बाद डाटा अधिग्रहण का चलना दूर स्वचालन के बावजूद की आवश्यकता है। अन्य अध्ययनों कि, (सैकड़ों या हजारों में यानी) नमूने की एक बड़ी संख्या को शामिल ऑफ दर रैंकिंग / गतिज स्क्रीनिंग या एपीटोप binning प्रयोजनों के लिए में, प्रवाह क्षमता एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है।
हालांकि एक प्रकार की पक्षी MX96 में प्रवाह क्षमता परिमाण अन्य biosensors के तुलना में अधिक है और इसलिए इन उद्देश्यों के लिए एक इष्टतम पसंद है, यह कुछ कमियों है। विशेष रूप से, CFM द्वारा सरणी मुद्रण बड़ी सतह विसंगतियों (चित्रा 1) और कम डेटा reproducibility (चित्रा 8D और 8E) दिखाता है। सटीक गतिज माप के लिए, बायोसेंसर सतह पर ligand की राशि एक महत्वपूर्ण पैरामीटर सुनिश्चित करना है कि बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं जैसे माध्यमिक कारकों से परेशान नहीं कर रहे हैं नियंत्रित किया जा करने की जरूरत हैबड़े पैमाने पर स्थानांतरण या steric बाधा। Biacore T100 और ProteOn XPR36 के लिए, इष्टतम आर एल स्तरों सेट आर अधिकतम मूल्यों के मानक गणना अनुसंधान लेख 17 में वर्णित के रूप के आधार पर निर्धारित किया गया है। दूसरी ओर, ओकटेट RED384 और एक प्रकार की पक्षी MX96 प्लेटफार्मों के लिए, mAb कब्जा स्तरों अनुभव निरंतर समय पर 2-गुना क्रमानुसार पतला एंटीबॉडी की एक श्रृंखला का उपयोग कर प्राप्त कर ली किया गया। ज्ञान या कब्जा कदम के नियंत्रण की कमी एक उच्च घनत्व सतह और उच्च बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेत (चित्रा 2) कि गतिज दर स्थिरांक की सटीकता के साथ छेड़छाड़ की हो सकता है में हुई। इसके अलावा, एसपीआर डिटेक्टर से प्रिंटर की जुदाई भी जब कई बाध्यकारी चक्र regenerations शामिल माप का आयोजन एक चुनौती प्रस्तुत करता है। बहु चक्र गतिकी सेटअप प्रदर्शन करने के लिए एक ही रास्ता Mabs के प्रत्यक्ष अमाइन युग्मन, के रूप में स्थिर प्रोटीन ए / जी द्वारा mAb एफसी के माध्यम से कब्जा करने के लिए विरोध के माध्यम से थाअन्य तीन बायोसेंसर प्लेटफार्मों में सतह। नतीजतन, एक अतिरिक्त उत्थान स्काउटिंग प्रयोग इष्टतम उत्थान की स्थिति निर्धारित करने के लिए आवश्यक था। इस स्थापना के परिणाम एफसी पर कब्जा विधि (चित्रा 9), एक लंबे समय तक प्रयोगात्मक समय के साथ-साथ की तुलना में एक ~ 90% कम मनाया सतह गतिविधि से जुड़ा हुआ था। एफसी पर कब्जा विधि पर अमल करने के लिए, एक वैकल्पिक एकल चक्र गतिज दृष्टिकोण अपनाया गया था। यह दृष्टिकोण प्रत्येक इंजेक्शन (चित्रा 2) के बीच उत्थान के बिना सांद्रता बढ़ाने के analyte की अनुक्रमिक इंजेक्शन शामिल है। यह बेहद सुविधाजनक, लेकिन कम सामान्यतः लागू किया दृष्टिकोण न केवल प्रयोगात्मक समय छोटा और अभिकर्मक की खपत कम हो, लेकिन यह भी अत्यधिक अन्य biosensors (चित्रा 7) से उन लोगों के समान गतिज दर स्थिरांक का उत्पादन किया। इसलिए, इस एकल चक्र गतिकी दृष्टिकोण को लागू साधन के निहित विन्यास सीमा पर काबू पा और एक प्रस्तुत करता हैएक उच्च throughput ढंग से उच्च संकल्प गतिज दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए अवसर।
throughput Biacore T100 में एक प्रमुख सीमा होने के बावजूद, हमारे परिणाम सामूहिक रूप से पता चलता है कि यह उच्चतम गुणवत्ता के साथ सबसे सुसंगत डेटा उत्पन्न। यह ProteOn XPR36, जो है ~ 10 गुना अधिक प्रवाह के बाद किया गया। अपने उच्च गुणवत्ता डेटा उत्पन्न करने की क्षमता जब उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत है कि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इन प्रपत्रों की पता लगाने सीमा पार कर रहे हैं की विशेषता एक फायदा हो जाता है। ओकटेट RED384 के उपकरण में व्यवस्थित सीमाओं पृथक्करण दर स्थिरांक की सही माप में बाधा जबकि (यानी, संवेदनशीलता की कमी धीमी ऑफ दरों के लिए पर्याप्त संकेत क्षय को हल करने), दोनों Biacore T100 और ProteOn XPR36 संवेदनशील और विश्वसनीय प्रदान कर सकते हैं भेदभाव के लिए पता लगाने।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों की पक्षी MX96 पर तकनीकी सहायता के लिए नूह डिट्टो और एडम मिलेस धन्यवाद।
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
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