Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी काइनेटिक्स का निर्धारण चार Biosensor प्लेटफार्मों का उपयोग

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55659
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

Summary

हम यहाँ का वर्णन बंधन आकर्षण और चार आमतौर पर इस्तेमाल किया बायोसेंसर प्लेटफार्मों का उपयोग गतिकी एंटीबॉडी प्रतिजन की माप के लिए प्रोटोकॉल।

Abstract

लेबल से मुक्त ऑप्टिकल biosensors biomolecular बातचीत के लक्षण वर्णन के लिए दवाओं की खोज में शक्तिशाली उपकरण हैं। इस अध्ययन में, हम अपने प्रयोगशाला बंधन आकर्षण और दस उच्च आत्मीयता मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) मानव proprotein convertase subtilisin केक्सिन प्रकार 9 के खिलाफ (PCSK9) की गतिकी का मूल्यांकन करने में चार नियमित तौर पर इस्तेमाल बायोसेंसर प्लेटफार्मों के उपयोग का वर्णन। दोनों Biacore T100 और ProteOn XPR36 अच्छी तरह से स्थापित सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) तकनीक से प्राप्त कर रहे हैं, पूर्व चार प्रवाह धारावाहिक प्रवाह विन्यास से जुड़े हुए कोशिकाओं, एक तात्कालिक 6 x 6 crisscross के माध्यम से समानांतर में जबकि बाद प्रस्तुत 36 प्रतिक्रिया स्पॉट है microfluidic चैनल विन्यास। एक प्रकार की पक्षी MX96 भी एक अतिरिक्त इमेजिंग विशेषता यह है कि स्थानिक उन्मुखीकरण में पता लगाने प्रदान करता है के साथ एसपीआर सेंसर प्रौद्योगिकी के आधार पर चल रही है,। यह पता लगाने की तकनीक सतत प्रवाह Microspotter (CFM) के साथ मिलकर ई से काफी प्रवाह क्षमता का विस्तारएक साथ मल्टीप्लेक्स सरणी मुद्रण और 96 प्रतिक्रिया खेल का पता लगाने के nabling। इसके विपरीत, ओकटेट RED384 BioLayer इंटरफेरोमेट्री (BLI) ऑप्टिकल सिद्धांत, फाइबर ऑप्टिक जांच बायोसेंसर हस्तक्षेप पैटर्न का पता लगाने के रूप में अभिनय के साथ पर आधारित है टिप सतह पर बातचीत बंधन पर बदल जाता है। एसपीआर आधारित प्लेटफार्मों के विपरीत, BLI प्रणाली सतत प्रवाह fluidics पर निर्भर नहीं करता; बजाय, सेंसर सुझावों रीडिंग इकट्ठा जब वे कक्षीय आंदोलन के दौरान एक 384 अच्छी तरह से microplate के analyte समाधान में डूब जाता है।

इन बायोसेंसर प्लेटफार्मों से प्रत्येक की अपनी फायदे और नुकसान हैं। 1 आणविक बातचीत मॉडल: इन उपकरणों की गुणवत्ता गतिज डेटा प्रदान करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगों है कि एक ही परख प्रारूप और एक ही उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मकों का उपयोग एंटीबॉडी प्रतिजन गतिकी कि सरल 1 फिट चिह्नित करने के लिए उदाहरण देकर स्पष्ट करना क्षमता का एक प्रत्यक्ष तुलना प्रदान करने के लिए ।

Protocol

1. प्रोटीन और एंटीबॉडी

  1. निर्माण और मानव proprotein convertase subtilisin केक्सिन प्रकार 9 (PCSK9) और दस माउस व्युत्पन्न विरोधी PCSK9 MABS को शुद्ध रूप में पहले से 17 का वर्णन किया।
  2. क्रमिक रूप से एक विश्लेषणात्मक आकार अपवर्जन (एसईसी) स्तंभ एक UPLC प्रणाली 19 का उपयोग करते हुए प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोग्राम प्रति इंजेक्शन लगाने के द्वारा शुद्ध उत्पादों की शुद्धता का आकलन करें।

2. Biacore T100 में काइनेटिक माप

  1. साधन और अभिकर्मक तैयारी
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर CM5 सेंसर चिप संतुलित करना।
    2. 200 मिमी 1-इथाइल-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) और कमरे के तापमान पर 50 मिमी एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) के दो 200 μL aliquots की दो 200 μL aliquots पिघलना।
    3. 1x एचबीएस-ईपी के एक 1-एल बोतल तैयार (10 मिमी HEPES [पीएच 7.4], 150 मिमी NaCl, 3 मिमी EDTA, और 0.005% v / v polysorbate P20) di द्वारा बफर चलपानी में 10 गुणा एचबीएस-ईपी + शेयर समाधान वीणा करना।
    4. 0.063 माइक्रोग्राम से कम 10 मिमी सोडियम एसीटेट (पीएच 4.5) और 500 प्रत्येक mAb नमूने की μL में 30 माइक्रोग्राम / एमएल में प्रोटीन ए / जी के 1 एमएल तैयार / एचबीएस-ईपी चल बफर में एमएल। बर्फ पर मानव PCSK9 की एक जमे हुए शीशी पिघलना।
    5. नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "उपकरण | निकालें चिप", म्यान और करीब में सेंसर चिप जगह। "उपकरण | तापमान सेट" पर क्लिक करें, "25" में प्रवेश ° विश्लेषण तापमान के रूप में सी और "10" ° डिब्बे तापमान के रूप में सी।
  2. सतह स्थिरीकरण
    1. "| ओपन / नई जादूगर टेम्पलेट फ़ाइल" और बाईं ओर के पैनल में सूची से "स्थिरीकरण" का चयन करें नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें।
    2. स्थिरीकरण सेटअप विंडो में प्रवेश करने के लिए "नया" पर क्लिक करें। चिप प्रकार के रूप में "CM5" चुनें और चुनें "1" चक्र के अनुसार प्रवाह सेल।
    3. अगले प्रत्येक "स्थिर प्रवाह सेल 1/2/3/4" एक्टिवा को करने के लिए बॉक्स को चेक करेंविकल्प ते। का चयन करें और "अमीन" सभी प्रवाह कोशिकाओं के लिए विधि को "स्थिर स्तर का लक्ष्य रखें"।
    4. "30 माइक्रोग्राम / मल प्रोआ / जी", ligand के रूप में दर्ज करें सुनिश्चित करें कि लक्ष्य स्तर पर सेट है प्रवाह कोशिकाओं के सभी के लिए "10000" प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू)।
    5. "दिखाए जाने से पहले प्रधानमंत्री" की जाँच करें, और "अगला" क्लिक करें। का चयन करें "अभिकर्मक रैक 2", अभिकर्मकों और पिपेट व्यक्तिगत नमूना शीशियों में तदनुसार के लिए स्थान निर्धारित करते हैं। रैक साधन में वापस डालें, फिर क्लिक करें "प्रारंभ" और रन शुरू करने के लिए बचाया जा एक प्रयोग नाम दर्ज करें।
  3. Analyte बाध्यकारी और पुनर्जनन साइकिल
    1. क्लिक करें "फाइल | खुला / नई विधि", चुनें "20140812 hu विरोधी PCSK9 IgGs hu PCSK9 के लिए बाध्य" और विधि खोलें। विधि में पैरामीटर की समीक्षा करें।
    2. "परख चरण", यह सुनिश्चित 10 चक्र जो "हू PCSK9" में "Purp में चयनित" नमूना "के साथ नाम है देखते हैंose 1 ""। दोहराने संख्या पर सेट है "।
    3. "साइकिल प्रकार", संपर्क समय निर्धारित करने की प्रवाह पथ से अधिक पर कब्जा 1 के लिए "220" एस "2", "110" प्रवाह पथ से अधिक प्रवाह पथ से अधिक पर कब्जा 2 के लिए रों "3", और कब्जा 3 के लिए "55" एस में "4"। प्रवाह की दर "10" μL / कब्जा चक्र के सभी के लिए न्यूनतम है।
    4. "नमूना 1" का चयन करें, चर के रूप में जाँच "नमूना समाधान"। संपर्क समय के लिए "600" s और पृथक्करण-समय पर प्रवाह पथ पर "2700" एस "1, 2, 3, 4" सेट करें। प्रवाह की दर "30" μL / मिनट के लिए निर्धारित है।
    5. "पुनर्जनन 1" का चयन करें, समाधान क्षेत्र में "ग्लाइसिन-एचसीएल पीएच 1.5" दर्ज करें और सेट संपर्क समय के प्रवाह पथ पर "20" एस "1, 2, 3, 4"।
    6. "चर सेटिंग" में, पाठ बॉक्स की "100 एनएम - 6.25 एनएम" सांद्रता titrating 2 गुना, साइकिल 1-3 के लिए "50 एम - 3.12 एनएम" साइकिल 4-8 के लिए, और "5 एनएम - 0.323 एनएम" चया साइकिल 9-10।
    7. "सेटअप रन" में, पता लगाने के प्रवाह पथ चुनें "2-1, 3-1, 4-1 से", "अगला" क्लिक "दिखाए जाने से पहले प्रधानमंत्री" की जाँच करें, और "अगला" क्लिक करें।
    8. का चयन करें "नमूना और अभिकर्मक रैक 1", तदनुसार अभिकर्मकों के लिए स्थान और व्यक्तिगत नमूना शीशियों में पिपेट परिभाषित करते हैं। साधन में रैक डालें, फिर क्लिक करें "प्रारंभ" और रन शुरू करने के लिए बचाया जा एक प्रयोग नाम दर्ज करें।
  4. डेटा विश्लेषण BiaEvaluation का उपयोग करना
    1. क्लिक करें "काइनेटिक्स / संबंध | सतह बाध्य", एफसी चुनें "2-1" "3-1", या "4-1" अलग से और साथ ही "शून्य" के रूप में विभिन्न analyte सांद्रता से प्रदर्शित किया घटता के सभी की जाँच एकाग्रता खाली।
    2. बफर खाली प्राप्त करने के लिए घटाया घटता "अगली" पर क्लिक करें। तो फिर क्लिक करें "काइनेटिक्स," चुनें "1: 1 बाइंडिंग" मॉडल, और "फिट" पर क्लिक करें सज्जित गतिज parame प्राप्त करने के लिएमंत्रियों।
    3. कई mAb सतहों के वैश्विक फिटिंग के लिए, तल पर क्लिक करें "एकाधिक आर अधिकतम" और सूची में एक ही mAb के लिए अन्य FCS से बाध्यकारी घटता जोड़ें।
    4. बफर खाली घटाया बंधन घटता के सभी प्राप्त करने के लिए "अगला" क्लिक करें। तो फिर क्लिक करें "काइनेटिक्स," चुनें "1: 1 बाइंडिंग" मॉडल, और "स्थानीय फिट" मानकों में प्रत्येक आर अधिकतम विश्व स्तर पर फिट गतिज मानकों को प्राप्त करने के लिए चुनें।

3. ProteOn XPR36 में काइनेटिक माप

  1. साधन और अभिकर्मक तैयारी
    1. एक GLM सेंसर चिप और पीबीएस टी EDTA के एक 2 एल बोतल (पीबीएस [7.4 पीएच], 0.005% बीच 20, और 3 मिमी EDTA) 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर चल संतुलित करना।
    2. नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "निकालें" और फिर GLM चिप डालें। चिप तापमान को "25" डिग्री सेल्सियस और autosampler तापमान को "10" डिग्री सेल्सियस सेट करें।"ग्लिसरॉल प्रारंभ" पर क्लिक करें और चिप को प्रारंभ करने के लिए प्रेरित निर्देशों का पालन करें।
    3. , सूची में से एक शर्त प्रोटोकॉल एक 96 अच्छी तरह से थाली में समाधान तैयार | "फ़ाइल खोलें" पर क्लिक करें। फिर, "भागो" पर क्लिक करें प्रोटोकॉल का चयन करें और "प्रारंभ" पर क्लिक करें।
    4. 400 मिमी ईडीसी में से एक 1 एमएल विभाज्य और कमरे के तापमान पर 100 मिमी एन hydroxysulfosuccinimide (sulfo-एनएचएस) में से एक 1 एमएल विभाज्य पहले गला लें।
    5. 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल, 0.125 माइक्रोग्राम / एमएल, और 0.063 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस-टी में / एमएल में 10 मिमी सोडियम एसीटेट (पीएच 4.5) और 500 प्रत्येक mAb नमूने की μL में 60 माइक्रोग्राम / एमएल में 2 प्रोटीन ए / जी की एमएल तैयार करें -EDTA चल बफर। बर्फ पर मानव PCSK9 की एक जमे हुए शीशी पिघलना।
  2. स्थिरीकरण, analyte बाध्यकारी और पुनर्जनन
    1. "| नई | नई प्रोटोकॉल फ़ाइल" पर क्लिक करें। "विन्यास", प्रयोग नाम दर्ज करें, "GLM" चिप, चुनें "microplates", और "2.2" एमएल मात्रा।
    2. चुनते हैं"प्रोटोकॉल | नमूने", "ईडीसी / sulfo-एन एच एस" के रूप में "उत्प्रेरक" कुओं में H1-H6, "प्रोटीन A / G" "लिगेंड" G1-G6 में, "Ethanolamine" के रूप में "Deactivator" के रूप में एफ 1-F6 को परिभाषित , "सुधारनेवाला" ई 1-E6, पीबीएस-टी EDTA में "के रूप में" रिक्त "के रूप में ग्लाइसिन" "डी 1-D6 में," ligand "सी 1 सी 6 में, और" मानव PCSK9 "के रूप में" analyte "के रूप में" mAb एक्स नमूना कुओं एक दूसरे 96-अच्छी तरह थाली में H1-H6 में।
    3. "चरण", डबल क्लिक करें "स्थिरीकरण" "प्रोटोकॉल संपादक" में चयन करें, कदम "30" μL का एक प्रवाह दर पर ईडीसी / sulfo-एन एच एस, प्रोटीन ए / जी के तीन बाद क्षैतिज इंजेक्शन, और 1 एम ethanolamine प्रत्येक शामिल / मिनट और "300" s के संपर्क समय।
    4. "से जेनरेट करें", इंजेक्षन तीन "18" पर क्लिक करें "100" μL / दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में मिनट, दो "60" के बाद से ग्लाइसिन (1.5 पीएच) के दालों -s पर पीबीएस टी EDTA के दालों -s "25" μL / मिनटयह भी दोनों दिशाओं में।
    5. , "लिगेंड" पर क्लिक करें "25" μL / मिनट की प्रवाह की दर और "160" s के संपर्क समय का उपयोग कर ऊर्ध्वाधर दिशा में mAb 1 mAb 2 इंजेक्षन।
    6. , "Analyte" पर क्लिक करें मानव PCSK9 के पांच सांद्रता इंजेक्षन संघ समय की "600" s का पालन के लिए और 6 क्षैतिज चैनल एक साथ पर एक खाली बफर, "40" μL / मिनट (में 100 एनएम 6.25 एनएम धारावाहिक dilutions 2 गुना) पृथक्करण समय की "2700" एस द्वारा।
    7. "से जेनरेट करें" पर क्लिक करें इंजेक्षन दो "18" "100" μL / दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर दिशाओं में मिनट में ग्लाइसिन (1.5 पीएच) के दालों -s।
    8. शेष Mabs के लिए प्रत्येक बंधन चक्र के बाद ऊपर के चरणों को दोहराएँ।
      नोट: 100 एनएम के अलावा - 6.25 एनएम मानव PCSK9 एकाग्रता श्रृंखला, 25 एम - 1.56 एनएम और 5 एनएम - 0.313 एनएम एकाग्रता श्रृंखला किया जाता है।
    9. अभिकर्मक पदों के अनुसार दो 96-अच्छी तरह प्लेटों में नमूने और अभिकर्मकों तैयार करेंकदम 3.2.2 में परिभाषित किया गया है, तो "रन" टैब पर क्लिक करें, प्रोटोकॉल / प्रयोग चुना और "प्रारंभ" पर क्लिक करें।
  3. डेटा विश्लेषण ProteOn प्रबंधक का उपयोग
    1. क्लिक करें "पैनल प्रकार" और "analyte"। तो फिर क्लिक करें "प्रोटोकॉल चरण" और सूची में सभी बंधन घटता का चयन करें।
    2. "ऑटो प्रक्रिया" "| चैनल संदर्भ | Interspot प्रक्रिया" क्लिक करें और क्लिक करें। उसके बाद "प्रक्रिया | डबल संदर्भ | पंक्ति | ए 6"।
    3. गतिज विश्लेषण के लिए सभी तीन सतहों पर प्रत्येक mAb के लिए व्यक्तिगत डेटासेट को बचाने के लिए "डेटासेट बनाएँ" पर क्लिक करें।
    4. , क्लिक करें "विश्लेषण डेटासेट" प्रत्येक mAb डाटासेट को उजागर करने और क्लिक करें "विश्लेषण | काइनेटिक"। "Langmuir" मॉडल और "एक साथ ka / केडी" चुनें और "अगला" क्लिक करें।
    5. , दोनों संघ और पृथक्करण फिट श्रृंखला हाइलाइट चुनें "स्थानीय" आर अधिकतम, और "अगला" क्लिक प्राप्त करने के लिए फिट प्रदर्शन करने के लिएफिट गतिज मानकों।
    6. ऊपर चरण दोहराएँ लेकिन ligand सतह गतिविधि की गणना के लिए प्रयोगात्मक आर अधिकतम मान प्राप्त करने के लिए चुन "समूहीकृत" फिटिंग के लिए R अधिकतम।

4. ओकटेट RED384 में काइनेटिक माप

  1. अभिकर्मक और नमूना प्लेट तैयारी
    1. 1x केबी के 50 एमएल (काइनेटिक बफर पीबीएस पीएच [7.4], 0.02% बीच 20, 0.1% एल्बुमिन, और 0.05% सोडियम azide युक्त) पीबीएस में 10 गुणा शेयर समाधान गिराए द्वारा तैयार करें।
    2. अच्छी तरह से प्रति 200 μL में एक 96 अच्छी तरह से थाली में बांटना 1x KB। कम से कम 10 मिनट के लिए इन व्यक्तिगत कुओं में हाइड्रेट 48 विरोधी मानव कब्जा (AHC) बायोसेंसर सुझाव।
    3. में 1.56 एनएम के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल, 10 माइक्रोग्राम / एमएल, और 5 माइक्रोग्राम 1x KB में / एमएल, साथ ही मानव PCSK9 100 एनएम से 7 titrated सांद्रता में से प्रत्येक mAb नमूना तैयार धारावाहिक dilutions 2 गुना।
    4. एक 384 अच्छी तरह से झुका नीचे microplate में mAb नमूने लोड (referred को अभिकर्मक प्लेट) और अच्छी तरह से प्रति 90 μL में एक और 384 अच्छी तरह से microplate (नमूना प्लेट के रूप में) में मानव PCSK9 समाधान के रूप में।
    5. 1x KB का लोड श्रृंखला और ग्लाइसिन (1.5 पीएच) नमूना प्लेट के भीतर कुओं में समाधान।
      नोट: ये 1x KB कुओं चिप शर्त, आधारभूत स्थिरीकरण, और analyte पृथक्करण के लिए उपयोग किया जाता है। ग्लाइसिन समाधान उत्थान के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. प्रायोगिक विधि सेटअप
    1. डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "प्रयोग | न्यू प्रयोग विज़ार्ड | नई काइनेटिक्स प्रयोग | बेसिक काइनेटिक्स"।
    2. "प्लेट परिभाषा" में, नमूना प्रकार और पदों को परिभाषित करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
      1. "16" चैनल और "384 अच्छी तरह से" प्रारूप का चयन करें।
      2. अच्छी तरह से शिफ्ट कुंजी जबकि बाएं क्लिक दबाए रखते हुए एक समय में 16 कुओं को उजागर करने से थाली प्रदर्शन में नमूना और अभिकर्मक स्थानों को परिभाषित करें।
      3. पर राइट क्लिक करेंmAb नमूने और "लोड" का चयन युक्त कुओं कदम है, जिस पर MABS लोड किए गए हैं (या कब्जा कर लिया) AHC सेंसर पर सूचित करने के लिए। सही पक्ष पर तालिका में mAb नाम और सांद्रता दर्ज करें।
      4. राइट मानव PCSK9 युक्त कुओं पर क्लिक करें और "नमूना" का चयन कदम है, जिस पर mAb पर कब्जा कर लिया सेंसर डूबा कर रहे हैं और बाध्यकारी बातचीत मापी जाती हैं इंगित करने के लिए। सही पक्ष पर तालिका में इसी दाढ़ सांद्रता दर्ज करें।
      5. कुओं के रूप में "बफर" या "निराकरण", 1x KB युक्त और "के रूप में पुनर्जनन" ग्लाइसिन युक्त कुओं को परिभाषित करें।
    3. "परख परिभाषा" में, प्रयोगात्मक सेटअप परिभाषित करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें:
      1. क्लिक करें सूची में "जोड़ें" और "आधारभूत", "उत्थान", "संतुलन", "लोड हो रहा है", "संघ", और "हदबंदी" चरण "30" के समय के साथ, "30 "s," 18 "s" 200 "s" 500 ", और" 1800 "s, क्रमशः। शेक गति है" 1000 "आरपीएम।
      2. "परख कदम सूची" करने के लिए कदम जोड़ने के लिए, एक कदम पर पहले क्लिक करें, तो या तो नमूना या अभिकर्मक थाली में स्थित कुओं पर क्लिक करें। चरणों इस प्रकार हैं:
        1. संतुलन-पुनर्जनन: पूर्व शर्त ग्लाइसिन (1.5 पीएच) में "15" -s डुबकी के तीन चक्र से AHC सेंसर, "15" के साथ बारी-बारी से 1x KB में डुबकी -s।
        2. लोड हो रहा है: "200" s के लिए AHC सेंसर पर mAb नमूने पर कब्जा।
        3. आधारभूत: "60" एस के लिए BLI संकेत स्थापित संघ कदम से पहले।
        4. एसोसिएशन: एक "500" -s संघ की अवधि के लिए मानव PCSK9 के अलग सांद्रता वाले कुओं में सेंसर डुबकी।
        5. हदबंदी: एक "1800" -s पृथक्करण अवधि के लिए डुबकी 1x KB के नए कुओं में PCSK9 बाध्य सेंसर।
        6. पुनर्जनन: डुबकी mAb-PCSK9 Bound ग्लाइसिन (1.5 पीएच) दो "18" के साथ की कुओं में सेंसर प्रत्येक बंधन चक्र के बीच दालों -s।
    4. "की समीक्षा प्रयोगों" में, चरणों के माध्यम से स्लाइड और पिछले टैब में वापस जाकर आवश्यकतानुसार परिवर्तन करें।
    5. "रन प्रयोगों" में, एक "60" एस देरी समय दर्ज करें और प्रतीक्षा करते हुए नमूना थाली हिला। थाली तापमान को "25" डिग्री सेल्सियस और प्रेस में सेट करें "जाना।"
  3. डेटा विश्लेषण ForteBio के डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना
    1. क्लिक करें "डेटा चुनाव | भरी हुई डाटा | काइनेटिक्स | PCSK9 एंटीबॉडी PCSK9 7.23.14 के लिए बाध्य"
    2. "संसाधन", इस प्रकार की प्रक्रिया डेटा:
      1. चरण 1 में: H1-H6 में सेंसर उजागर करने के लिए "सेंसर चयन" क्लिक करें, सही उन पर क्लिक करें और क्लिक करें "सेंसर परिवर्तन प्रकार | संदर्भ सेंसर।"
      2. चरण 2 में, "घटाव" की जाँच करें और चुनें "औसत संदर्भ सेंसर"; 6 खाली बफर सेंसर की औसत से प्रत्येक सक्रिय नमूना सेंसर घटाना।
      3. चरण 3 में, "संरेखित वाई अक्ष" क्लिक करें और "आधारभूत" का चयन करें आधारभूत कदम संघ से पहले करने के लिए सभी बंधन घटता संरेखित करने के लिए।
      4. चरण 5 में, "Savitsky-Golay छनन" संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि से बाध्यकारी घटता सम करने के लिए, और क्लिक जाँच "प्रक्रिया डाटा!"।
      5. चरण 6 में, संसाधित बंधन घटता देखने पर क्लिक करें "प्रसंस्कृत परिणाम"।
      6. चरण 7 में, प्रत्येक प्रसंस्करण कदम के बाद बंधन घटता प्रदर्शित सही पर चार पैनल की समीक्षा करें और क्लिक करें "प्रसंस्कृत डेटा सहेजें"।
    3. "विश्लेषण" में, "एसोसिएशन और हदबंदी" जाँच करें और "1: 1" मॉडल।
    4. "ग्लोबल (पूर्ण)" फिट और "रंग" से उन्हें समूह के लिए बाध्यकारी घटता को हाइलाइट करें। का प्रयोग करें "आर अधिकतम जुड़ा हुआ" समूह एक ही मीटर के साथ लेपित सेंसर पर ढाले प्रदर्शन करने के लिएAb एकाग्रता ligand सतह गतिविधि की गणना के लिए प्रयोगात्मक आर अधिकतम मूल्यों, और "आर अधिकतम सेंसर से अनलिंक" प्राप्त करने के लिए कई mAb सांद्रता के साथ लेपित सेंसर पर वैश्विक फिटिंग प्रदर्शन करने के लिए।
    5. फिट गतिकी पैरामीटर प्राप्त करने के लिए "फ़िट वक्र" पर क्लिक करें। प्रत्येक फिटिंग विश्लेषण के अंत में परिणाम की बचत करें।

5. एक प्रकार की पक्षी MX96 में काइनेटिक माप

  1. साधन और अभिकर्मक तैयारी
    1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक COOH-जी चिप संतुलित करना।
    2. प्रणाली चल रहा है बफर (पीबीएस [7.4 पीएच], 0.01% बीच 20) और स्थिरीकरण बफर (10 मिमी सोडियम एसीटेट [5.0 पीएच], 0.01% बीच 20) के एक 1-एल बोतल तैयार करें।
    3. दोनों सिस्टम चल बफर और सोडियम एसीटेट (पीएच 5.0) स्थिरीकरण बफर में 2 गुना धारावाहिक dilutions से 0.16 माइक्रोग्राम / एमएल के लिए 20 माइक्रोग्राम / एमएल से प्रत्येक mAb तैयार करें।
    4. दो सितम्बर में mAb नमूने बांटनाarate 96-अच्छी तरह प्लेटें जिसमें प्रत्येक mAb अच्छी तरह से प्रति 200 μL पर अनुमापन सांद्रता में 8 ऊर्ध्वाधर कुओं पर है।
    5. कमरे के तापमान पर 400 मिमी ईडीसी और 100 मिमी sulfo-एन एच एस के पिघलना aliquots।
    6. 50 माइक्रोग्राम / सोडियम एसीटेट में एमएल (पीएच 5.0) स्थिरीकरण बफर और यह पिपेट एक शीशी में कम से प्रोटीन ए / जी के 300 μL तैयार करें।
    7. 200 μL बफर चल प्रणाली में 2 गुना धारावाहिक dilutions से 0.39 एनएम के लिए 100 एनएम से मानव PCSK9 की तैयार करें। उन्हें अलग शीशियों में पिपेट।
  2. अमाइन युग्मित एंटीबॉडी सरणियों के साथ मल्टी-चक्र गतिकी
    1. ईडीसी / sulfo-एन एच एस (400 मिमी / 100 मिमी) aliquots मिलाएं और अच्छी तरह से प्रति 200 μL में एक नया 96-अच्छी तरह प्लेट के ऊपर 48 कुओं में मिश्रण बांटना।
    2. स्थिति 2 में mAb स्रोत प्लेट (सोडियम एसीटेट में पतला [5.0 पीएच]) और प्रिंटर के भीतर स्थिति 1 में ईडीसी / sulfo-एन एच एस अभिकर्मक थाली रखें।
    3. CFM में सेंसर चिप स्थापित करें। "CFM 2.0" softwar खोलेंई, उसके बाद "लोड सेटिंग | 96 अमीन युगल"। 10 x 8 एंटीबॉडी सरणी इस प्रकार बनाई गई है:
      1. 48 microchannels का उपयोग कर संवेदक को अभिकर्मक प्लेट के ऊपर छमाही में ईडीसी / sulfo-एन एच एस उद्धार, और "5" मिनट के लिए सेंसर की सतह पर उन्हें चक्र।
      2. "10" मिनट के लिए सेंसर और उन्हें चक्र भर में सक्रिय सतहों स्रोत प्लेट के ऊपर छमाही में mAb नमूने वितरित करें।
      3. "5" मिनट के लिए एंटीबॉडी सतह पर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब से स्थिरीकरण बफर वितरित करें।
      4. स्रोत थाली के निचले आधे भाग में शेष mAb नमूनों के लिए उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. साधन में मुद्रित सेंसर चिप डालें। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "फाइल | कनेक्ट | ओपन मापन | मौजूदा मापन" और "2014-08-15" का चयन करें।
    5. के तहत "पूर्ण प्रणाली स्क्रिप्ट" - में "सामान्य", "सिस्टम प्रधानमंत्री जी" का चयन करें। तब चुनें "जी - Quencज "150 μL इंजेक्शन 1 एम ethanolamine द्वारा mAb सतहों निष्क्रिय करने के लिए।
    6. mAb सरणियों कल्पना और यदि आवश्यक हो इसके विपरीत समायोजित करने के लिए "कैमरा" पर क्लिक करें। लाल चौक बक्से स्थिति mAb धब्बे के चारों ओर, और संदर्भित करने के लिए सक्रिय mAb स्पॉट के बीच स्थित interspots को हरे वर्ग बक्से ले जाएँ।
    7. के तहत "एक प्रकार की पक्षी स्क्रिप्ट" - "एपी स्टैंडर्ड भागो एक" "विश्लेषण चक्र" में, का चयन करें। आधारभूत के लिए 1.0 मिनट, संघ के लिए 10.0 मिनट, और 8 μL / s गति से पृथक्करण के लिए 90 चरणों सेट करें।
    8. अंदर "साइकिल", मानव PCSK9 एक समय पाँच बफर इंजेक्शन निम्नलिखित में एक एकाग्रता इंजेक्षन। से जेनरेट करें ग्लाइसिन पीएच 2.0 प्रत्येक बंधन चक्र के बीच के साथ mAb सतहों।
  3. एफसी पर कब्जा कर लिया एंटीबॉडी सरणियों के साथ एकल चक्र गतिकी
    1. CFM में एक नया सेंसर चिप स्थापित करें। चरण दोहराएं 5.2.3 प्रोटीन ए / जी के साथ mAb नमूने की जगह ऊपर 5.2.5 करने के लिए।
    2. हटाएMX96 से सेंसर चिप और यह CFM प्रिंटर में वापस डालें।
    3. प्रोटीन ए / जी सेंसर सतह 48 microchannels उपयोग करने के लिए प्लेट के ऊपर छमाही में MABS उद्धार, और सतह 10 मिनट के लिए द्विदिश प्रवाह का उपयोग भर में उन्हें चक्र।
    4. थाली के निचले आधे भाग में शेष mAb नमूनों के लिए ऊपर चरण को दोहराएँ।
    5. MX96 साधन में मुद्रित सेंसर चिप डालें। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "फाइल | कनेक्ट | ओपन मापन | मौजूदा मापन | अगला" और "प्रोटीन ए + जी बाध्यकारी kinetic7.30.14"।
    6. mAb सरणियों कल्पना और यदि आवश्यक हो इसके विपरीत समायोजित करने के लिए "कैमरा" पर क्लिक करें। लाल चौक बक्से स्थिति mAb धब्बे के चारों ओर, और संदर्भित करने के लिए सक्रिय mAb स्पॉट के बीच स्थित interspots को हरे वर्ग बक्से ले जाएँ।
    7. के तहत "एक प्रकार की पक्षी स्क्रिप्ट" - "एपी स्टैंडर्ड भागो एक" "विश्लेषण चक्र" में, का चयन करें। आधारभूत के लिए "1.0 मिनट" सेट, "10.0मिनट "संघ के लिए, और" 8 μL / सेकंड "गति 10" पर पृथक्करण के लिए कदम "।
    8. अंदर "साइकिल", मानव PCSK9 एक समय पाँच बफर इंजेक्शन निम्नलिखित में एक एकाग्रता इंजेक्षन। कोई उत्थान प्रत्येक analyte इंजेक्शन के बीच किया जाता है।
  4. डेटा विश्लेषण स्प्रिंट और स्क्रबर का उपयोग करना
    1. , | "ओपन त्रिभुज फ़ाइल फ़ाइल" सूची में सभी नमूना इंजेक्शन चयन करें, और विश्लेषण "क्लिक करने से पहले" "सहेजें SprintX फ़ाइल," "कैलिब्रेशन", और "RLL दृढ़ संकल्प की जाँच" SprintX सॉफ़्टवेयर में, क्लिक करें।
      नोट: RLL मूल्यों सेंसर सतह पर स्थिर / पर कब्जा कर लिया mAb स्तरों को देखें।
    2. चेक "संदर्भित" और आसन्न संदर्भ धब्बे उपयोग करने के लिए चयन "स्थानीय"। यह भी जांच पहले इंजेक्शन पर "संरेखित करें" और फिर क्लिक करें "आरंभ स्वचालन।"
    3. सीरियल टैब में, "शासकों दिखाएँ उपकरण पट्टी में," का चयन करें उन्हें समायोजितआधारभूत तुरंत पहला नमूना इंजेक्शन से पहले का एक छोटा सा क्षेत्र का चयन करने, और चुनें "शून्य।"
    4. "निर्यात फ़ाइल ibmx करने के लिए" का चयन करके और उसके बाद से स्क्रबर में विश्लेषण के लिए एक .IBMX फ़ाइल जनरेट करें "आरंभ स्वचालन।"
    5. स्क्रबर लॉन्च और .IBMX फ़ाइल लोड। "स्टॉक सान्द्र" के रूप में "100n" और "2" "कमजोर पड़ने कारक" के रूप में दर्ज करें।
    6. फसल डेटा, सभी आधारभूत इंजेक्शन के शुरू होने से पहले हटा दें, और संघ के शुरू में बंधन घटता संरेखित करें।
      ध्यान दें: एकल चक्र गतिकी प्रयोग के लिए, घटता संरेखित नहीं करते।
    7. , "काइनेटिक्स" टैब पर जाएँ इंजेक्शन अंत समय के लिए शासक को समायोजित करें, "कश्मीर घ" और फिट, फिर "ठीक कश्मीर घ।" "एक कश्मीर घ k" और इसे फिर से फिट का चयन करें।
    8. कश्मीर d स्तंभ फ्लोट और फिर से फिट आगे फिट परिष्कृत करने के लिए।
      नोट: एकल चक्र बंधन घटता की फिटिंग के लिए, "जिसमें" क्लिक करें और का चयन रद्द "घटाएँ," फिर "अलग" और "शुरू इंज" कॉलम नाव संघ प्रोफाइल वापस एक सैद्धांतिक आधार रेखा मूल करने के लिए फिट करने के लिए।
    9. परिणाम टैब में लगाया गतिकी मानकों की समीक्षा करें।

Representative Results

चित्रा 1 दो स्थिरीकरण तरीकों से CFM और देखा mAb स्तर से एंटीबॉडी सरणी छवि दिखाता है, और चित्र 2 इन mAb सरणियों पर गतिज बहु चक्र से MX96 में उत्पन्न इसी बंधन sensorgrams और एकल चक्र गतिज माप से पता चलता । 6 - वास्तविक समय बंधन और कई एंटीबॉडी में लिपटे चार बायोसेंसर प्लेटफार्मों में उत्पन्न सतहों से kinetically फिट घटता आंकड़े 3 में दिखाया जाता है। चित्रा 7 अंतिम गतिज दरों और संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक इन बाध्यकारी घटता के वैश्विक विश्लेषण से प्राप्त की तुलना से पता चलता। व्यक्तिगत संघ (क k), पृथक्करण (कश्मीर घ), और संतुलन (कश्मीर डी) बाध्यकारी स्थिरांक तालिका 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं। एक ही उपकरण के भीतर उत्पन्न डेटासेट की परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करने के लिए, कश्मीर एक, कश्मीर घ, और कश्मीर डी के भूखंडों से पता चलता है, और चित्रा 9 आगे बायोसेंसर प्लेटफार्मों पर mAb सतहों की गणना बंधन गतिविधियों तुलना करती है।

आकृति 1
चित्र 1 मल्टीप्लेक्स लिगेंड के अमीन युग्मित (ए) और एक प्रकार की पक्षी MX96 में एफसी पर कब्जा कर लिया (बी) CFM मुद्रण से एंटीबॉडी सतह सरणी। मुद्रित सरणियों के छवियाँ बाईं पैनल, जहां लाल वर्गों से घिरा ग्रे क्षेत्रों एंटीबॉडी की उपस्थिति का संकेत में दिखाया जाता है। गहरे रंग की सक्रिय एंटीबॉडी स्पॉट के बीच स्थित interspots संदर्भ घटाव के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक स्तंभ एंटीबॉडी नीचे और छवि के बाईं ओर पहचान अनुमापन सांद्रता में मुद्रित होता है। मुद्रित एंटीबॉडी की मात्रा di की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारितसक्रिय और संदर्भ स्थानों के बीच थोक पाली में fference सही पैनल में दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वास्तविक समय बहु चक्र (ए) से Sensorgrams बाध्यकारी और एकल-चक्र (बी) एक प्रकार की पक्षी MX96 में काइनेटिक प्रयोगों की तुलना। 10 x 8 एंटीबॉडी सरणियों भर में सांद्रता बढ़ाने के मानव PCSK9 के अनुक्रमिक इंजेक्शन प्रत्येक इसी sensorgram खंड ऊपर उल्लेख किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
(ऊपर पैनल), मध्यम (मध्य पैनल), और कम (नीचे पैनल) घनत्व सतहों पर मूल्यांकन किया जाता है। 1 बातचीत मॉडल: आच्छादित चिकनी काली लाइनें एक 1 करने के लिए विभिन्न मानव PCSK9 सांद्रता (रंग लाइनों) पर बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेतों की गतिज फिट प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. बाइंडिंग मानव PCSK9 और 1 के साथ बातचीत कब्जा कर लिया एंटीबॉडी की Sensorgrams: 1 काइनेटिक मॉडल फ़िट ProteOn XPR36 में ओवरले। बातचीत उच्च (ऊपर पैनल), मेडी से अधिक मूल्यांकन किया जाता हैउम- (मध्य पैनल), और कम (नीचे पैनल) घनत्व सतहों। 1 बातचीत मॉडल: आच्छादित चिकनी काली लाइनें एक 1 करने के लिए विभिन्न मानव PCSK9 सांद्रता (रंग लाइनों) पर बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेतों की गतिज फिट प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. बाइंडिंग मानव PCSK9 और 1 के साथ बातचीत कब्जा कर लिया एंटीबॉडी की Sensorgrams: 1 काइनेटिक मॉडल फ़िट ओकटेट RED384 में ओवरले। बातचीत उच्च (ऊपर पैनल), मध्यम (मध्य पैनल), और कम (नीचे पैनल) घनत्व सतहों पर मूल्यांकन किया जाता है। आच्छादित लाल लाइनों एक 1 करने के लिए विभिन्न मानव PCSK9 सांद्रता (रंग लाइनों) पर बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेतों की गतिज फिट प्रतिनिधित्व करते हैं: 1 बातचीत मॉडल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. बाइंडिंग अमीन युग्मित (ए) और एफसी पर कब्जा कर लिया (बी) एंटीबॉडी मानव PCSK9 और 1 के साथ बातचीत की Sensorgrams: 1 काइनेटिक मॉडल फ़िट एक प्रकार की पक्षी MX96 में ओवरले। बाध्यकारी प्रोफाइल 10 x 8 पैनलों कि चित्र 1 में सरणी थाली मानचित्र का पालन के रूप में आयोजित किया जाता है। काले लाइनों विभिन्न मानव PCSK9 सांद्रता में दर्ज की गई बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और आच्छादित लाल लाइनों फिट घटता प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 7 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 55,659 / 55659fig7.jpg "/>
चित्रा 7. एसोसिएशन की तुलना k एक (ए), हदबंदी कश्मीर घ (बी), और संतुलन कश्मीर डी (सी) चार Biosensor प्लेटफार्म द्वारा उत्पन्न बाध्यकारी स्थिरांक। 6 - गतिज मापदंडों आंकड़े 3 में बंधन घटता के वैश्विक विश्लेषण से हुआ है। , Ibis MX96, अमाइन युग्मित (बैंगनी), और एक प्रकार की पक्षी MX96, एफसी पर कब्जा कर लिया (नारंगी) Biacore T100 (नीला), ProteOn XPR36 (हरा), ओकटेट RED384 (लाल): इस प्रकार के साधन प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्रा 8. Biac में एकाधिक एंटीबॉडी सतह घनत्व अधिक काइनेटिक दर स्थिरांक की संगति की तुलना अयस्क T100 (ए), ProteOn XPR36 (बी), ओकटेट RED384 (सी), Ibis MX96, अमाइन युग्मित (डी), और एक प्रकार की पक्षी MX96, एफसी पर कब्जा कर लिया (ई)। गतिज मापदंडों k एक (ऊपर उप पैनल), कश्मीर घ (मध्य उप पैनल), और कश्मीर डी (नीचे उप पैनल) अलग-अलग एंटीबॉडी सतह घनत्व पर समूह विश्लेषण से हुआ है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 9
चित्रा चार Biosensor प्लेटफार्म में एंटीबॉडी सतह और उनके मानक विचलन (त्रुटि सलाखों) की 9. बाध्यकारी क्रियाएँ। मूल्यों अनुसंधान लेख 17 में वर्णित समीकरण का प्रयोग कर गणना कर रहे हैं।large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

k एक कश्मीर घ कश्मीर डी
(एम -1 एस -1) (रों -1) (एनएम)
mAb 1 11.7 (7.8) x 10 5 4.89 (4.18) x 10 -5 0.052 (0.05)
mAb 2 1.53 (0.28) x 10 5 1.30 (1.54) x 10 -5 0.092 (0.12)
mAb 3 11.4 (8.3) x 10 5 27.6 (11.0) x 10 -5 0.333 (0.20)
mAb 4 3.61 (1.6) x 10 5 20.1 (12.3) x 10 -5 0.659 (0.54)
mAb 5 0.59 (0.21) x 10 5 3.46 (2.50) x 10 -5 0.663 (0.46)
mAb 6 1.19 (0.78) x 10 5 7.21 (3.83) x 10 -5 0.894 (0.64)
mAb 7 1.29 (0.53) x 10 5 16.4 (5.63) x 10 -5 1.57 (1.02)
mAb 8 4.02 (2.23) x 10 5 22.8 (10.7) x 10 -5 0.768 (0.68)
mAb 9 4.20 (2.13) x 10 5 6.67 (4.3) x 10 -5 0.197 (0.16)
mAb 10 1.20 (0.49) x 10 5 12.5 (7.64) x 10 -5 1.27 (0.80)

तालिका 1: 1 इंटरैक्शन मॉडल: काइनेटिक दरें और संतुलन 10 1 के लिए चार Biosensor उपकरण से बाध्यकारी वक्र वैश्विक फिटिंग द्वारा प्राप्त Mabs के स्थिरांक बाइंडिंग।

Discussion

हमारे सिर-से-शीर्ष तुलना अध्ययन से पता चलता है कि प्रत्येक बायोसेंसर मंच अपनी अपनी शक्तियों और कमजोरियों है। हालांकि एंटीबॉडी के बंधन प्रोफाइल दृश्य तुलना द्वारा समान (आंकड़े 3 - 6) हैं, और हासिल कर ली गतिज दर स्थिरांक की रैंक आदेश वाद्यों में अत्यधिक संगत कर रहे हैं (चित्रा 7), हमारे परिणाम है कि एसपीआर आधारित के साथ उपकरणों को दिखाने सतत प्रवाह fluidics) धीमी गति से पृथक्करण दर के साथ उच्च आत्मीयता बातचीत को हल करने में बेहतर हैं। पृथक्करण चरण के दौरान ऊपर की ओर बहाव डेटासेट में मनाया जाता है (जैसे, mAb 2, mAb 5, और mAb 9; चित्रा 5) BLI fluidics मुक्त साधन द्वारा उत्पन्न। यह निष्कर्ष microplate, जो प्रणाली का एक प्राथमिक सीमा है में समय के साथ नमूना वाष्पीकरण के बड़े हिस्से में जिम्मेदार ठहराया जा सकता। इस निहित सीमा के साथ, प्रयोगात्मक समय भी कम से कम 12 घंटे तक ही सीमित है; प्रयोगों इसलिए श के साथ प्रोग्राम किया गयाorter बार (500 रों संघ और 30 मिनट के पृथक्करण) (10 मिनट संघ और 45 मिनट के पृथक्करण) अन्य प्लेटफार्मों के उन लोगों की तुलना में। हालांकि, प्रयोगात्मक समय छोटा करने डेटा की गुणवत्ता / स्थिरता पर वाष्पीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए प्रकट नहीं किया था, के रूप में दर BLI आधारित साधन द्वारा उत्पन्न स्थिरांक (बंद दरों में से कुछ में उतार-चढ़ाव का एक परिणाम चित्रा 8C के रूप में कम linearity दिखाने )। नमूना वाष्पीकरण के अलावा, कब्जा इस्तेमाल किया अभिकर्मकों में मतभेद भी प्राप्त परिणामों में मतभेद के योगदान हो सकता है। प्रोटीन A / G तीनों fluidics आधारित एसपीआर प्लेटफार्मों में इस्तेमाल किया गया था, वहीं AHC सेंसर गैर fluidics BLI मंच में इस्तेमाल किया गया। के बाद से प्रोटीन A / G Mabs के लिए एक कमजोर आत्मीयता से करता AHC, एंटीबॉडी आधारित बायोसेंसर सतह से प्रोटीन A / G सतहों mAb प्रतिजन परिसर के बाहर की दरों कृत्रिम रूप से उन लोगों की तुलना में तेजी से प्रकट हो सकता है की संभावना है AHC सतह से प्राप्त की। इस संभावना ख समर्थित हैy प्रयोगात्मक दिखा रहा है कि ऑफ दर BLI मंच द्वारा उत्पन्न मूल्यों अन्य उपकरणों (चित्रा 7, लाल रेखा) से प्राप्त उन लोगों की तुलना में लगातार कम थे डेटा। फिर भी, BLI मंच अन्य प्लेटफार्मों से अधिक विभिन्न फायदे हैं। उदाहरण के लिए, यह तत्काल उपयोग के लिए विभिन्न पूर्व लेपित सेंसर की वजह से सेंसर चुनाव और परख विन्यास के संबंध में अत्यधिक लचीला है। हमारे प्रयोगों में, AHC सेंसर के उपयोग ligand स्थिरीकरण चरणों की आवश्यकता को समाप्त, तैयारी के समय को कम करने। इसके अलावा, BLI मंच अन्य fluidics एसपीआर प्लेटफार्मों, जो जटिल ट्यूबिंग और मूल्य स्विच विन्यास की सुविधा की तुलना में बहुत कम रखरखाव की आवश्यकता है। यह सुविधा कच्चे तेल के नमूने है कि जाम और प्रदूषण समस्याएं हो सकती हैं से जुड़े प्रयोगों के लिए एक फायदा है।

चिकित्सकीय उम्मीदवारों बढ़ जाती है की, कुशल तेजी से, और सटीक पहचान के लिए मांग, द्वि के लिए जरूरत के रूप मेंosensor प्रवाह क्षमता भी बढ़ रहा है। चार बायोसेंसर प्लेटफार्मों के बीच, बायोसेंसर 96 ligand सरणी मुद्रण करने में सक्षम से प्रवाह उच्चतम, बायोसेंसर एक crisscrossing 36-ligand प्रारूप और 16 चैनल एक साथ पाठ्यांकन BLI आधारित बायोसेंसर के लिए युग्मित है, जो अंततः वृद्धि के बाद है 96, 36 और 16 में क्रमश: के लिए एक एकल बाध्यकारी चक्र में मापा जाता इंटरैक्शन की संख्या। ये throughput क्षमताओं पारंपरिक एसपीआर मंच है, जो केवल चार प्रवाह एक भी धारावाहिक प्रवाह से जुड़े हुए कोशिकाओं होने से सीमित है की तुलना में काफी अधिक है। के बाद से हमारे प्रयोगों 10 में लंबे समय के पृथक्करण समय के साथ कई सतह घनत्व का मूल्यांकन Mabs की एक अपेक्षाकृत छोटी नमूना सेट शामिल, वाद्य throughputs प्रयोगों की दक्षता का निर्धारण करने में एक उदारवादी भूमिका निभाई है। वहाँ तीन उच्च throughput प्लेटफार्मों की प्रयोगात्मक समय में कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे, और सभी मामलों में प्रयोगों एक दिन में पूरा किया गया। दूसरी ओर, पारंपरिक धारावाहिक प्रवाह एसपीआर प्रयोगों 3 दिन पूरा करने के लिए, सेटअप के बाद डाटा अधिग्रहण का चलना दूर स्वचालन के बावजूद की आवश्यकता है। अन्य अध्ययनों कि, (सैकड़ों या हजारों में यानी) नमूने की एक बड़ी संख्या को शामिल ऑफ दर रैंकिंग / गतिज स्क्रीनिंग या एपीटोप binning प्रयोजनों के लिए में, प्रवाह क्षमता एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है।

हालांकि एक प्रकार की पक्षी MX96 में प्रवाह क्षमता परिमाण अन्य biosensors के तुलना में अधिक है और इसलिए इन उद्देश्यों के लिए एक इष्टतम पसंद है, यह कुछ कमियों है। विशेष रूप से, CFM द्वारा सरणी मुद्रण बड़ी सतह विसंगतियों (चित्रा 1) और कम डेटा reproducibility (चित्रा 8D और 8E) दिखाता है। सटीक गतिज माप के लिए, बायोसेंसर सतह पर ligand की राशि एक महत्वपूर्ण पैरामीटर सुनिश्चित करना है कि बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं जैसे माध्यमिक कारकों से परेशान नहीं कर रहे हैं नियंत्रित किया जा करने की जरूरत हैबड़े पैमाने पर स्थानांतरण या steric बाधा। Biacore T100 और ProteOn XPR36 के लिए, इष्टतम आर एल स्तरों सेट आर अधिकतम मूल्यों के मानक गणना अनुसंधान लेख 17 में वर्णित के रूप के आधार पर निर्धारित किया गया है। दूसरी ओर, ओकटेट RED384 और एक प्रकार की पक्षी MX96 प्लेटफार्मों के लिए, mAb कब्जा स्तरों अनुभव निरंतर समय पर 2-गुना क्रमानुसार पतला एंटीबॉडी की एक श्रृंखला का उपयोग कर प्राप्त कर ली किया गया। ज्ञान या कब्जा कदम के नियंत्रण की कमी एक उच्च घनत्व सतह और उच्च बाध्यकारी प्रतिक्रिया संकेत (चित्रा 2) कि गतिज दर स्थिरांक की सटीकता के साथ छेड़छाड़ की हो सकता है में हुई। इसके अलावा, एसपीआर डिटेक्टर से प्रिंटर की जुदाई भी जब कई बाध्यकारी चक्र regenerations शामिल माप का आयोजन एक चुनौती प्रस्तुत करता है। बहु चक्र गतिकी सेटअप प्रदर्शन करने के लिए एक ही रास्ता Mabs के प्रत्यक्ष अमाइन युग्मन, के रूप में स्थिर प्रोटीन ए / जी द्वारा mAb एफसी के माध्यम से कब्जा करने के लिए विरोध के माध्यम से थाअन्य तीन बायोसेंसर प्लेटफार्मों में सतह। नतीजतन, एक अतिरिक्त उत्थान स्काउटिंग प्रयोग इष्टतम उत्थान की स्थिति निर्धारित करने के लिए आवश्यक था। इस स्थापना के परिणाम एफसी पर कब्जा विधि (चित्रा 9), एक लंबे समय तक प्रयोगात्मक समय के साथ-साथ की तुलना में एक ~ 90% कम मनाया सतह गतिविधि से जुड़ा हुआ था। एफसी पर कब्जा विधि पर अमल करने के लिए, एक वैकल्पिक एकल चक्र गतिज दृष्टिकोण अपनाया गया था। यह दृष्टिकोण प्रत्येक इंजेक्शन (चित्रा 2) के बीच उत्थान के बिना सांद्रता बढ़ाने के analyte की अनुक्रमिक इंजेक्शन शामिल है। यह बेहद सुविधाजनक, लेकिन कम सामान्यतः लागू किया दृष्टिकोण न केवल प्रयोगात्मक समय छोटा और अभिकर्मक की खपत कम हो, लेकिन यह भी अत्यधिक अन्य biosensors (चित्रा 7) से उन लोगों के समान गतिज दर स्थिरांक का उत्पादन किया। इसलिए, इस एकल चक्र गतिकी दृष्टिकोण को लागू साधन के निहित विन्यास सीमा पर काबू पा और एक प्रस्तुत करता हैएक उच्च throughput ढंग से उच्च संकल्प गतिज दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए अवसर।

throughput Biacore T100 में एक प्रमुख सीमा होने के बावजूद, हमारे परिणाम सामूहिक रूप से पता चलता है कि यह उच्चतम गुणवत्ता के साथ सबसे सुसंगत डेटा उत्पन्न। यह ProteOn XPR36, जो है ~ 10 गुना अधिक प्रवाह के बाद किया गया। अपने उच्च गुणवत्ता डेटा उत्पन्न करने की क्षमता जब उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत है कि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इन प्रपत्रों की पता लगाने सीमा पार कर रहे हैं की विशेषता एक फायदा हो जाता है। ओकटेट RED384 के उपकरण में व्यवस्थित सीमाओं पृथक्करण दर स्थिरांक की सही माप में बाधा जबकि (यानी, संवेदनशीलता की कमी धीमी ऑफ दरों के लिए पर्याप्त संकेत क्षय को हल करने), दोनों Biacore T100 और ProteOn XPR36 संवेदनशील और विश्वसनीय प्रदान कर सकते हैं भेदभाव के लिए पता लगाने।

Disclosures

इस वीडियो को-लेख के प्रकाशन फीस बोहरिंगर Ingelheim फार्मास्यूटिकल्स द्वारा भुगतान किया गया।

Acknowledgments

लेखकों की पक्षी MX96 पर तकनीकी सहायता के लिए नूह डिट्टो और एडम मिलेस धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T100 System GE Healthcare 28975001 The T100 system has been upgraded to T200
CM5 Sensor Chip  GE Healthcare BR100012
BIAevaluation  GE Healthcare Version 4.1
Biacore T100 Control Software GE Healthcare The T100 control software has been upgraded to T200
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 
HBS-EP+ Buffer 10× GE Healthcare BR100669 Concentrated stock solution 
Plastic Vials, o.d. 7 mm GE Healthcare BR100212 
Rubber Caps, type 3 GE Healthcare BR100502
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm GE Healthcare BR100214 
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System Bio-Rad 1760100
ProteOn Manager Software  Bio-Rad 1760200 Version 3.1.0.6
GLM Sensor Chip Bio-Rad 1765012
Amine Coupling Kit Bio-Rad 1762410 It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl 
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers Bio-Rad 1762210 It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution 
2 L PBS/Tween/EDTA buffer Bio-Rad 1762730 It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA 
Octet RED384 System FortéBio
Data Analysis Software FortéBio Version 9.0.0.4
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors FortéBio 18-5060 One tray of 96 biosensors 
384-Well Tilted-Bottom Plate  FortéBio 18-5080
Biosensor Dispenser FortéBio 18-5016
Kinetics Buffer 10x FortéBio 18-1092 10x concentration. Contains ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi System Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer Wasatch Microfluidics Version 2.0
SensEye COOH-G chip Wasatch Microfluidics 1-09-04-004
Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.19.3.17
SPRint Data Analysis Software Wasatch Microfluidics Version 6.15.2.1
Scrubber 2 BioLogic Software Version 2
Pierce Recombinant Protein A/G ThermoFisher Scientific 21186

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Tags

जैव रसायन अंक 122 ऑप्टिकल biosensors एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत बंधन गतिकी दवाओं की खोज सतह plasmon अनुनाद BioLayer इंटरफेरोमेट्री
उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी काइनेटिक्स का निर्धारण चार Biosensor प्लेटफार्मों का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D., Singh, A., Wu, H.,… More

Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659, doi:10.3791/55659 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter