Vi beskriver här protokoll för mätning av antikropp-antigenbindningsaffinitet och kinetik med användning av fyra vanligen använda biosensor plattformar.
Etikettfria optiska biosensorer är kraftfulla verktyg i läkemedelsutveckling för karakterisering av biomolekylära interaktioner. I denna studie beskriver vi användningen av fyra rutinmässigt används biosensor plattformar i vårt laboratorium för att utvärdera bindningsaffinitet och kinetiken för tio höga affinitet monoklonala antikroppar (mAb) mot humant proprotein konvertas subtilisin Kexin typ 9 (PCSK9). Medan både Biacore T100 och Proteon XPR36 är härledda från den väletablerade Surface Plasmon Resonance (SPR) teknik, har den tidigare fyra flödesceller förbundna genom konfiguration serieflöde, medan den senare presenterar 36 reaktions fläckar i parallellt genom en improviserad 6 x 6 korsvis konfiguration mikrofluidisk kanal. IBIS MX96 arbetar också baserad på SPR-sensorteknologi, med en ytterligare avbildning funktion som ger detektering i rumslig orientering. Denna detekteringsteknik kopplat med kontinuerligt flöde Microspotter (CFM) expanderar genomströmningen betydligt genom enabling multiplex array tryckning och detektering av 96 reaktions sporter samtidigt. Däremot är den Oktett RED384 baserat på BioLayer Interferometry (BLI) optisk princip, med fiberoptiska prober egenskap biosensorn för att detektera interferensmönstret ändras vid bindning interaktioner vid spetsytan. Till skillnad från de SPR-baserade plattformar, förlitar BLI-systemet inte på kontinuerliga flödes fluidik; Istället sensor tips samla avläsningar medan de är nedsänkta i analytlösningar av en 384-brunnar under orbital agitation.
Var och en av dessa biosensor plattformar har sina egna fördelar och nackdelar. För att tillhandahålla en direkt jämförelse av dessa instrument förmåga att tillhandahålla kvalitets kinetiska data, de beskrivna protokollen illustrerar experiment som använder samma analysformatet och samma högkvalitativa reagens för att karakterisera antikropps-antigen kinetik som passar den enkla 1: 1 molekylär interaktion modell .
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Vår head-to-head jämförelse studie visar att varje biosensor plattform har sina egna styrkor och svagheter. Även om bindningsprofilerna för antikropparna är liknande genom visuell jämförelse (figurerna 3 – 6), och rangordningen av de förvärvade kinetiska hastighetskonstanter är mycket konsekvent över de instrument (Figur 7), visar våra resultat att SPR-baserade instrument med kontinuerliga flödes fluidik) är bättre på att lösa hög affinitetsinteraktioner med långsamma dissociationshastigheter. Uppåt Avvikelsen under dissociationsfasen observeras i datauppsättningar (t.ex. mAb 2, mAb 5, och mAb 9, fig 5) som genereras av BLI fluidik-free instrumentet. Detta fynd kan hänföras till stor del på provavdunstning över tiden i mikroplattan, som är en primär begränsning av systemet. Med denna inneboende begränsning, är den experimentella tid också begränsad till mindre än 12 h; experimenten därför programmerad med shÖrter gånger (500 associering och 30 min dissociation) jämfört med de för de andra plattformar (10 min förening och 45 min dissociation). Men förkorta den experimentella tiden inte verkade för att mildra effekterna av avdunstning på datakvalitet / konsistens, eftersom hastighetskonstanterna som genereras av BLI baserat instrument visar mindre linjäritet som ett resultat av variationer i några av off-priser (Figur 8C ). Förutom provavdunstning, kan skillnader i infångnings reagens som används har också bidragit till skillnaderna i de erhållna resultaten. Medan protein A / G användes i alla tre fluidlogikbaserade SPR plattformar, var AHC sensorer som används i icke-fluidics BLI plattform. Eftersom protein A / G är sannolikt har en svagare affinitet för mAb än tänker AHC, en antikroppsbaserad biosensorytan, off-hastigheter av mAb-antigenkomplexet från protein A / G-ytor kan artificiellt visas snabbare än de erhållen från AHC ytan. Denna möjlighet stöds by de experimentella data som visar att de off-hastighetsvärdena genererade av BLI plattformen var genomgående lägre än de som erhölls från de andra instrumenten (Figur 7, röd linje). Ändå har BLI plattform olika fördelar jämfört med andra plattformar. Till exempel, är det mycket flexibelt med avseende på sensor val och analys konfiguration på grund av de olika förbelagda sensorer för omedelbar användning. I våra experiment, användningen av AHC sensorerna eliminerat behovet av ligand immobilisering steg, vilket minskar förberedelsetiden. Vidare kräver BLI plattformen mycket mindre underhåll jämfört med de andra fluidik SPR plattformar, som funktionen komplicerade slangar och värde omkopplingskonfigurationer. Den här funktionen är en fördel för försök med råa prover som kan orsaka igensättning och föroreningsfrågor.
Eftersom efterfrågan på effektiva, snabba och korrekt identifiering av terapeutiska kandidater ökar behovet av biosensor genomströmning ökar också. Bland de fyra biosensor plattformar, genomströmningen från biosensorn i stånd att 96-ligand array utskrift är den högsta, följt av biosensorn kopplad till ett kors och tvärs 36-ligand-format och den BLI-baserad biosensor med 16-kanals simultan avläsning, vilket i slutändan öka antalet interaktioner uppmätta i en enda bindningscykel till 96, 36 och 16, respektive. Dessa genomloppskapacitet är betydligt högre än den för den traditionella SPR plattform, som är begränsad genom att ha endast fyra flödesceller förbundna med en enda seriell flöde. Eftersom våra experiment involverade en relativt litet prov uppsättning av 10 mAb bedömda vid multipla yt densiteter med långa dissociation tider, de instrumentella genomströmningar spelade en måttlig roll vid bestämning av effektiviteten av experimenten. Det fanns inga signifikanta skillnader i de experimentella tider de tre hög genomströmning plattformar och i samtliga fall experimenten avslutades på en dag. Å andra sidan, krävs den traditionella serieflödes SPR experiment 3 dagar att slutföra, trots walk-away automatisering av datainsamling efter installationen. I andra studier som involverar ett stort antal prover (dvs. i de hundratals eller tusentals), för av-hastighet ranking / kinetisk screening eller epitop binning ändamål, blir genomflödet en kritisk faktor.
Även genomströmningen i IBIS MX96 är storleksordningar högre än för de andra biosensorer och är därför ett optimalt val för dessa ändamål, har några brister. I synnerhet, arrayen tryckning genom CFM visar stor yta inkonsekvenser (figur 1) och reducerades uppgifter reproducerbarhet (Figur 8D och 8E). För noggranna kinetiska mätningar, är mängden av liganden på biosensorytan en kritisk parameter som måste regleras för att säkerställa att de bindande svaren inte störs av sekundära faktorer, såsommassöverföring eller steriskt hinder. För Biacore T100 och Proteon XPR36 ades de optimala R L nivåer bestäms baserat på standarden beräkning av uppsättningen R max värden som beskrivs i artikeln forskning 17. Å andra sidan, för de Oktett RED384 och IBIS MX96 plattformar ades mAb infångningsnivåer uppnås empiriskt med användning av en serie av 2-faldigt serieutspädda antikroppar vid konstant gånger. Bristen på kunskap eller kontroll av infångningssteget resulterade i en hög densitet yta och höga bindningssvarssignaler (Figur 2) som kan ha äventyras riktigheten av de kinetiska hastighetskonstanter. Vidare separation av skrivaren från SPR detektorn presenterar också en utmaning när de utför multipla bindningscykelmätningar involverar regenereringar. Det enda sättet att utföra ett flertal behandlingscykler kinetik installationen var genom direkt aminkoppling av de mAb, i motsats till fånga genom mAb Fc av den immobiliserade protein A / Gyta i de andra tre biosensor plattformar. Som ett resultat erhölls ett ytterligare regenererings scouting experiment erfordras för att bestämma de optimala regenereringsbetingelser. Resultatet av denna inställning var kopplad till en ~ 90% lägre observerade ytaktivitet jämfört med Fc-infångningsmetod (fig 9), förutom en längre experimentell tid. Att exekvera Fc infångningsmetoden, var ett alternativ med enkel cykel kinetiska synsätt. Detta tillvägagångssätt involverar sekventiell injektion av analyt vid ökande koncentrationer utan regenerering mellan varje injektion (figur 2). Detta mycket bekvämt, men mindre tillämpas allmänt tillvägagångssätt inte bara förkortas den experimentella tid och reducerad reagensförbrukning, men också producerade kinetiska hastighetskonstanter mycket liknande de från de andra biosensorer (Figur 7). Därför att tillämpa detta enkelcykel kinetik tillvägagångssätt övervinner den inneboende konfiguration begränsning av instrumentet och presenterar enmöjlighet för att erhålla hög upplösning kinetiska hastighetskonstanter i en hög genomströmning sätt.
Trots genomströmningen är en viktig begränsning i Biacore T100, våra resultat visar kollektivt att det genererade de mest konsekventa data med högsta kvalitet. Detta följdes av den Proteon XPR36, som har ~ 10-faldigt högre genomströmning. Deras förmåga att generera hög kvalitet data blir en fördel när karakterisera hög affinitet antikropp-antigeninteraktioner som kan vara tekniskt utmanande när instrumentens detektionsgränser uppnås. Medan de systematiska begränsningar i instrumentering av den Oktett RED384 hindra korrekt mätning av dissociation hastighetskonstanter (dvs. klarar att känsligheten för att lösa tillräcklig signal förfall för långsam off-rates), både Biacore T100 och Proteon XPR36 kan ge känsliga och tillförlitliga detektion för differentiering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Noah Ditto och Adam Miles för tekniskt stöd på IBIS MX96.
Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
Octet RED384 System | FortéBio | ||
Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |