قمنا بتطوير تقنية جديدة في المجهر الإلكتروني، "فلاش والتجميد" التي تمكن من تصور ديناميات الغشاء مع مللي القرار الزماني. هذا الأسلوب يجمع بين التحفيز علم البصريات الوراثي للخلايا العصبية مع ارتفاع ضغط التجمد. هنا، علينا أن نظهر للإجراءات ووصف البروتوكولات في التفاصيل.
خلايا باستمرار تغيير بنية الغشاء وتوزيع البروتين، ولكن من الصعب للغاية تصور هذه الأحداث في القرار الزماني والمكاني بناء على أمر من مللي ونانومتر، على التوالي. لقد قمنا بتطوير تقنية وقت حل المجهر الإلكتروني، "فلاش وتجميد،" أن يدفع الأحداث الخلوية مع علم البصريات الوراثي ويتصور ديناميات غشاء الناجم عن تجميد الخلايا في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز. وللتدليل على هذه التقنية، عبرنا عن channelrhodopsin، قناة الموجبة حساسة للضوء، في الخلايا العصبية الماوس الحصين. ومضة من الضوء يحفز نشاط الخلايا العصبية ويؤدي الافراج عن العصبي من المحطات متشابك من خلال اندماج الحويصلات متشابك. ويقترن التحفيز علم البصريات الوراثي للخلايا العصبية مع الضغط العالي تجميد لمتابعة التغيرات المورفولوجية أثناء انتقال متشابك. باستخدام أداة التجاري، ألقينا القبض على اندماج الحويصلات متشابك وانتعاش synaptic غشاء الحويصلة. لتصور تسلسل الأحداث، تم إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات وتحليلها بصورة عمياء، منذ أن يتبع تغيرات شكلية في خلايا مختلفة على مر الزمن. ومع ذلك، ومضة وتجميد يسمح التصور من ديناميات غشاء في الميكروسكوب الإلكتروني مع مللي القرار الزماني.
تصور الغشاء والبروتين ديناميكية داخل الخلية هو خطوة رئيسية نحو فهم بيولوجيا الخلايا لعمليات معينة. يمكن التقاط الأحداث الاتجار الديناميكي باستخدام ضوء أو مضان المجهر. ومع ذلك، فإن السياق التحت خلوية مفقود إلى حد كبير في مثل هذه الصور لأن الهياكل التحت خلوية لا يمكن تماما "رسمت" من الأصباغ أو تحقيقات الفلورسنت وحل مكانيا وطيفيا 1 و 2. من ناحية أخرى، في حين المجهر الإلكتروني يمكن أن ترسم العمارة التحت خلوية في التفاصيل الرائعة، فإنه لا يمكن التقاط ديناميات الخلوية، وذلك لأن العينات يجب أن تكون ثابتة قبل التصوير. وبالتالي، فمن عادة لا يكفي لفهم تماما ديناميات الخلوية باستخدام واحد فقط تصوير الطريقة.
للتغلب على القيود المفروضة على الضوء والمجهر الإلكتروني، فقد تم تطوير تقنيات المجهر المترابطة. متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني(CLEM) يتصور ديناميكية داخل الخلايا باستخدام المجهر الضوئي والبنى التحت خلوية الأساسية مع المجهر الإلكتروني. في CLEM، وخلايا تعمل في مختلف العمليات، مثل الانقسام السيتوبلازمي والإلتقام 3، 4، 5، 6، ويعيش تصوير ومن ثم معالجتها لالمجهر الإلكتروني. وعلى الرغم من CLEM يلتقط بعض جوانب الديناميات داخل الخلايا، وهناك أربعة عوامل تحد من جدوى هذا النهج. أولا، هو القرار الزماني محدودة بسبب سرعة يمكن يجمد الخلايا، والتي تأخذ عادة ق – دقيقة بسبب انتشار بطيء ورد فعل مثبتات 7. آخر الثانية، لوحظ العمارة التحت خلوية الفعلي 8؛ وبالتالي، فإن التغيرات المورفولوجية الحيوية لا يمكن الحصول عليها باستخدام هذا النهج. ثالثا، الميكروسكوب مضان والإلكترون لا يمكن محاذاة على وجه التحديد بسبب ش الأنسجةrinkage الناجمة عن الجفاف خلال إعداد العينات للفحص المجهري الإلكترون 9 و 10. رابعا، أحداث مثل الانقسام السيتوبلازمي والإلتقام لا تجري في نفس الوقت في كل خلية 5، 11، وبالتالي، لا بد من التعرف على خلية معينة التي تعمل في هذا الحدث من عدد كبير من الخلايا. هذه العملية غالبا ما تكون شاقة. وبالتالي، من الضروري طريقة جديدة للحث على أحداث معينة في كل خلية وللقبض على ديناميات الخلوية الناجم عن ذلك تجميد السريع للخلايا في نقطة زمنية محددة.
مؤخرا، تم تطوير العديد من الأدوات للحث على وجه الخصوص ديناميات الخلوية باستخدام الضوء (علم البصريات الوراثي). Channelrhodopsin هو، قناة الموجبة غير انتقائية حساسة للضوء معزولة عن كلاميدوموناس reinhardtii 12 و 13. عندما يتم التعبير عن channelrhodopsin في neuronaالأغشية لتر، ومضة قصيرة من الضوء يدفع تدفق أيونات الصوديوم إلى الخلايا العصبية ويؤدي هذا العمل المحتملين 14 و 15. ثم ينتشر إمكانات العمل في محطات متشابك، حيث تلتحم الحويصلات المشبكية خلال أجزاء من الثانية 16، 17، 18 لذلك، channelrhodopsin يدفع نشاط الخلايا العصبية. لمتابعة الديناميات الغشاء في محطات متشابك، يجب أن يجمد الخلايا العصبية عند نقاط زمنية محددة بعد التحفيز مع مللي الدقة.
لالتقاط ديناميات غشاء بعد حمل نشاط الخلايا العصبية، ونحن إلى جانب التحفيز خفيفة مع ارتفاع ضغط تجميد 17 و 18 و 19. الضغط العالي تجميد يسمح لتجميد شبه لحظية من الخلايا مع انخفاض الجليد تشكيل الكريستال 20. بلورات الثلج كاليفورنيان تمزق الأغشية وتعطيل العمارة التحت خلوية 21. من خلال تغيير فترات زمنية بين التحفيز والتجميد، تم القبض على الاتجار غشاء داخل محطات متشابك بعد تحريض من إمكانات العمل.
هنا، علينا أن نظهر الإجراءات التجريبية باستخدام تجاريا الفريزر الضغط العالي أن الأزواج تحكم مللي الزمنية من التحفيز خفيفة مع ارتفاع ضغط التجمد. وخلافا لغيرها من الصكوك التي تتطلب جهاز خارجي للسيطرة على التحفيز خفيفة والتجميد، تم دمج التحفيز الضوء بالكامل في هذا النظام، ويمكن تطبيقها مع مللي الدقة 19. وتنطوي هذه العملية متعددة الخطوات. 1) الخلايا العصبية ماوس الحصين يتم تربيتها على الأقراص الياقوت والمصابة مع الفيروسة البطيئة تحمل ناقلات التعبير عن channelrhodopsin 18. 2) يتم تحفيز الخلايا العصبية وجمدت عند نقاط زمنية محددة بعد التحفيز. 3) الماء المزجج هو البديلد مع المذيبات العضوية، في حين أن الدهون والبروتينات عبر ربط بواسطة مثبتات للحفاظ على بنية الخلايا. 4) مخترقة العينات وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. 5) يتم جمعها أقسام سامسونج باستخدام مشراح مستدق. 6) يتم تصوير مقاطع رقيقة على المجهر الإلكتروني النافذ. 7) يتم تنفيذها الحصول على الصور وتحليلها بصورة عمياء فيما يتعلق بالنقاط الوقت أو المورثات. يمكن تحديد ديناميات الخلوية من خلال إعادة بناء الصور وقت حل 17 و 18. إعداد نموذج (الخطوات 2-5 أعلاه) يتطلب الأسبوع، ولكن تحليل الصور اللاحقة يتطلب أشهر إلى سنة.
نهج "فلاش وتجميد" يتصور ديناميات غشاء عن طريق حفز حدث الخلوي معين مع علم البصريات الوراثي وتجميد الخلايا في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز 19. في هذه المظاهرة، كنا channelrhodopsin، قناة الموجبة الحساسة للضوء، لتحفيز الخلايا العصبية واستولت على الانصهار والانتعاش من الحويصلات المشبكية في محطات متشابك. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي 22، 23، وكلها متوافقة مع فلاش والتجميد. على سبيل المثال، والاتجار عضية يمكن أن يتسبب استخدام heterodimerization الناجم عن ضوء cryptochrome وCIB1 24. وبالمثل، وتكوين الدهون في غشاء البلازما يمكن تغييرها من قبل النبات الناجم خفيفة من فوسفاتاز فسفوإينوزيتيد إلى غشاء البلازما 25. وعلاوة على ذلك، ومركبات صغيرة حساسة للضوء مثل الفصل آزوبنزينالتشكل أنج اعتمادا على موجات الإضاءة. هذا التغيير متعلق بتكوين يمكن استخدامها لتنشيط قنوات بوابات يجند أو لتغيير تركيبة الدهون في غشاء 26 و 27. ويمكن أيضا أن المركبات قفص أن تستخدم للحث على النشاط الخلوي. ومع ذلك، فإن LED المستخدمة في الإعداد الحالي قد لا تنتج ما يكفي من الطاقة لuncaging. وبالتالي، تحسينات أخرى للنظام ضرورية على الأرجح. ومع ذلك، فإن تطبيق هذه الأدوات خفيفة activatable هي الأحداث الخلوية مرنة كثير يمكن أن يتسبب التي كتبها ومضة من الضوء. "فلاش وتجميد" يمكن التقاط ديناميات غشاء الناتجة عن ذلك.
هناك نوعان من القيود الرئيسية على طريقة "الفلاش والتجميد". أولا، أنه يلتقط "لقطات" من حدث معين من خلايا مختلفة. وبعبارة أخرى، فإنه ليس من الممكن لمتابعة الديناميات الغشاء في خلية واحدة على مدى فترة من الزمن. وهكذا، لإعادة بناء أي الخلوية حتىر، لا بد من اكتساب وتحليل عدد كبير من الصور من كل عينة وفي كل نقطة زمنية. وعلاوة على ذلك، في الخلايا العصبية، وهو عدد أكبر من الصور ضروري، لأن اندماج الحويصلات متشابك يستغرق سوى الأماكن في 20-30٪ من نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية الماوس الحصين 18، 28. تحليل مثل هذه بيانات كبيرة تتطلب كميات هائلة من الوقت. في المستقبل، واقتناء الصور وتحليلها تحتاج إلى آلية لجعل نهج أكثر كفاءة 29 و 30.
وفرض القيد الثاني وفقا لطبيعة تقنية تجميد الضغط العالي. عندما تجميد الخلايا، تعيد ترتيب المياه الخلوي لتشكيل بلورات الثلج إذا كان معدل تجميد أقل من 100 K / ق 21. ويمكن لهذه بلورات الثلج اختراق أغشية أو تركز الأملاح لتغيير الضغط الاسموزي المحلي، مما أدى إلى تمزق الأغشية. لتجنب بلورات الثلج، المهزومةيتم تطبيق الضغط ح (~ 2000 أجهزة الصراف الآلي) للعينات. ويرجع ذلك إلى تأثير التبريد فائقة، وهو معدل تجميد 100 K / ثانية كافية لمنع المياه من تشكيل بلورات الجليد في هذا الضغط 21. من الناحية النظرية، عينات سميكة مثل 500 ميكرون يمكن تجميد دون بلورات الثلج، ولكن ما يقرب من 200 ميكرون من المرجح الحد العملي، كما تميل أشكال مكعبة من الجليد لتشكيل في الأنسجة السميكة، المساس التشكل. عندما عينات معالجة أكثر سمكا من 5 ميكرون، واستخدام السليم البرد حاصن، مثل BSA، أمر ضروري. ومع ذلك، فإن BSA تغيير الأسمولية من الحل وقد تؤثر على الاستجابة الفسيولوجية للخلايا. لذلك، يطلب من التجارب مراقبة واسعة النطاق للتحقق من صحة استخدام BSA في أنظمة معينة. يمكن أن بلورات الثلج أيضا أن تشكل بعد الضغط العالي تجميد إذا تم إزالة العينات عن طريق الخطأ من حمام النيتروجين السائل. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على العينات في النيتروجين السائل في جميع الأوقات، واستخدام الملقط قبل المبردة لالتلاعب بها.
عند التخطيط التجارب، ينبغي النظر في النقاط الثلاث التالية. أولا، لشدة القصوى من ضوء (خط 460 نانومتر) هو 5،5-8،0 ميغاواط / مم 2. إذا كان هذا كثافة كافية للحث على النشاط يجب التحقق مع التصوير الخلية الحية على المجهر مضان قبل التجارب فلاش والتجميد. ثانيا، يجب إجراء التجارب في درجة حرارة الفسيولوجية. وارتفعت درجة حرارة مرحلة الثلاجة الضغط العالي تصل إلى 37 درجة مئوية لمدة التجارب مع الخلايا العصبية الماوس الحصين 31. وأخيرا، فإن نقطة زمنية يجب اختيارها بعناية لالتقاط ديناميات غشاء. أشارت الدراسات الأولية إلى أن الإلتقام اكتمال بعد 100 مللي ثانية من التحفيز. وهكذا، تم فحص ثلاث نقاط زمنية إضافية (15، 30، و 50 مللي ثانية) أيضا لمتابعة ديناميات غشاء 17 و 18. وكانت هذه النقاط الزمنية اللازمة لتصور الحدث الاتجار الغشاءالصورة أثناء انتقال متشابك. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى عدد من النقاط الزمنية تختلف في كل حدث الخلوية. ولذلك، ينبغي أخذ عينات بضع نقاط من الوقت قبل الشروع في جمع بيانات كبيرة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من جامعة جونز هوبكنز (SW). نشكر مدرسة جونز هوبكنز للمرفق الطب مجهر لدعمها التقني. نشكر إريك يورجنسن وكريستيان روزنموند وأعضاء مختبراتها لتطوير هذه التقنية. نشكر M. وين ديفيس لتصميم الجهاز الأولي. نشكر بول وورزينغر، كفيتا توموفا، وDelgermaa Luvsanjav للحصول على المساعدة الفنية. كما نشكر ناتالي R. هاميلتون وغرانت F كوسيك لقراءة نقدية لها من المخطوطة.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |