Summary
Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di microscopia elettronica, "flash-e-congelamento" che permette la visualizzazione di dinamica della membrana con ms risoluzione temporale. Questa tecnica combina la stimolazione optogenetic di neuroni con alta pressione di congelamento. Qui, dimostriamo le procedure e descrivere i protocolli in dettaglio.
Abstract
Cellule cambiano continuamente la loro architettura membrana e distribuzione della proteina, ma è estremamente difficile da visualizzare questi eventi ad una risoluzione temporale e spaziale dell'ordine di ms e nm, rispettivamente. Abbiamo sviluppato una tecnica risolta nel tempo microscopia elettronica, "flash-e-freeze", che induce eventi cellulari con optogenetics e visualizza le dinamiche della membrana derivanti dal congelamento delle cellule in momenti definiti dopo la stimolazione. Per illustrare questa tecnica, abbiamo espresso channelrhodopsin, un canale cationico fotosensibile, in neuroni ippocampali di topo. Un lampo di luce stimola l'attività neuronale e induce rilascio di neurotrasmettitore dai terminali sinaptici mediante la fusione di vescicole sinaptiche. La stimolazione optogenetic dei neuroni è accoppiato con alta pressione di congelamento per seguire le variazioni morfologiche durante la trasmissione sinaptica. Utilizzando uno strumento commerciale, abbiamo catturato la fusione delle vescicole sinaptiche e il recupero del synaPTIC membrana delle vescicole. Per visualizzare la sequenza di eventi, grandi set di dati sono stati generati ed analizzati alla cieca, in quanto i cambiamenti morfologici sono stati rilevati in diverse cellule nel tempo. Tuttavia, flash-e-freeze consente la visualizzazione delle dinamiche di membrana nel microscopio elettronico con risoluzione temporale ms.
Introduction
Visualizzazione dinamica della membrana e proteine all'interno di una cellula è un passo fondamentale verso la comprensione della biologia cellulare di particolari processi. eventi di traffico dinamico possono essere catturati usando la luce o di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, il contesto subcellulare è in gran parte assente in queste immagini perché le strutture sub-cellulari non possono essere completamente "dipinte" di coloranti o sonde fluorescenti e risolte spazialmente e spettralmente 1, 2. D'altra parte, mentre la microscopia elettronica può delineare architettura subcellulare nei minimi dettagli, non può catturare dinamiche cellulari, poiché i campioni devono essere fissate prima di imaging. Così, non è in genere sufficiente per comprendere completamente dinamiche cellulari utilizzando solo una modalità di imaging.
Per superare le limitazioni di microscopia ottica ed elettronica, sono state sviluppate tecniche di microscopia correlativa. Correlative Luce e Microscopia Elettronica(CLEM) visualizza dinamica intracellulare mediante microscopia ottica e strutture subcellulari sottostanti con microscopia elettronica. In CLEM, cellule impegnate in vari processi, come citochinesi e endocitosi 3, 4, 5, 6, sono live-immagini formate ed poi trasformati per la microscopia elettronica. Sebbene CLEM coglie alcuni aspetti della dinamica intracellulare, ci sono quattro fattori che limitano l'utilità di questo approccio. In primo luogo, la risoluzione temporale è limitata da quanto velocemente le cellule possono essere immobilizzati, che richiede tipicamente s - min dovuto alla diffusione lenta e reazione di fissativi 7. Dopo la seconda, l'architettura subcellulare si osserva facto 8; pertanto, le variazioni morfologiche dinamici non possono essere acquisite utilizzando questo approccio. Terzo, micrografie fluorescenza e elettroni non possono essere allineati con precisione a causa sh tessutirinkage causato dalla disidratazione durante la preparazione dei campioni per la microscopia elettronica 9, 10. In quarto luogo, eventi come cytokinesis e endocitosi non avvengono nello stesso momento in ogni cellula 5, 11, e, quindi, una cella particolare che è impegnata in caso devono essere identificati da una grande popolazione di cellule. Questo processo è spesso laboriosa. Pertanto, un nuovo metodo è necessario per indurre particolari eventi in ogni cellula e per catturare le dinamiche cellulari risultanti dal rapido immobilizzazione di cellule in momenti definiti.
Recentemente, diversi strumenti sono stati sviluppati per indurre particolari dinamiche cellulari che utilizzano la luce (optogenetics). Channelrhodopsin è un canale cationico fotosensibile, non selettivo isolato da Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Quando channelrhodopsin è espresso in neuronal membrane, un breve lampo di luce induce un afflusso di ioni di sodio in neuroni e innesca un potenziale 14, 15 azione. Il potenziale d'azione propaga poi nei terminali sinaptici, dove vescicole sinaptiche fondono in pochi millisecondi 16, 17, 18 Pertanto, channelrhodopsin induce attività neuronale. Per seguire dinamica della membrana a terminali sinaptici, i neuroni devono essere immobilizzati in momenti definiti dopo stimolazione con precisione ms.
Per catturare dinamica della membrana dopo l'induzione dell'attività neuronale, abbiamo accoppiati stimolazione luminosa con alta pressione congelamento 17, 18, 19. -Alta pressione congelamento consente di immobilizzazione quasi istantanea di cellule con formazione di cristalli di ghiaccio ridotta 20. Cristalli di ghiaccio can rottura membrane e perturbare l'architettura subcellulare 21. Variando gli intervalli di tempo tra la stimolazione e il congelamento, traffico di membrana all'interno terminali sinaptici stato catturato dopo l'induzione di un potenziale d'azione.
Qui, dimostriamo procedure sperimentali utilizzando un congelatore ad alta pressione che le coppie commercializzato un ms controllo temporale della stimolazione luminosa con alta pressione di congelamento. A differenza di altri strumenti che richiedono un dispositivo esterno per controllare stimolazione luminosa e il congelamento, stimolazione luminosa è completamente integrato in questo sistema e può essere applicato con precisione ms 19. Questo processo prevede più passaggi. 1) neuroni ippocampali di topo sono coltivate su dischi zaffiro e infettate con lentivirus trasporta un vettore di espressione per channelrhodopsin 18. 2) I neuroni sono stimolati e congelati in momenti definiti dopo la stimolazione. 3) L'acqua è sostituto vetrificatod con un solvente organico, mentre lipidi e proteine sono reticolati con fissativi di conservare l'architettura intracellulare. 4) I campioni sono infiltrate ed inclusi in resina epossidica. 5) Le sezioni ultrasottili sono raccolti utilizzando un ultramicrotomo. 6) Le sezioni sottili vengono esposte su un microscopio elettronico a trasmissione. 7) acquisizione di immagini e l'analisi sono effettuate alla cieca rispetto ai punti temporali o genotipi. Dinamiche cellulari possono essere determinati attraverso la ricostruzione di immagini risolte nel tempo 17, 18. Preparazione del campione (punti 2 - 5 di cui sopra) richiede una settimana, ma la successiva analisi delle immagini richiede mesi a un anno.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le regole ei regolamenti di uso degli animali da parte dei National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso di animali (IACUC) presso la Johns Hopkins School of Medicine.
1. Isolamento e la coltura di topo neuroni dell'ippocampo
- Sezionare cortecce da una giornata postnatale 0 - 2 giorni (P0 - 2) 18 cervello di topo. Isolare i astrociti dalle cortecce.
NOTA: Il cervello di topo è stato isolato dopo la decapitazione. Astrociti servono come strato alimentatore per i neuroni ippocampali. - Trattare le cortecce con 800 ml di 0,05% tripsina-EDTA per 15 minuti a 37 ° C per dissociare astrociti.
- Cultura astrociti in un pallone T-75 con 13 ml di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 0,2% di penicillina-streptomicina per una settimana a 37 ° C e 5% CO 2.
- Posizionare 18 mm pe vetro coprioggetto un acido-lavata e sterilizzatar pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
- Brevemente lavare due rivestite di carbonio dischi zaffiro 6 mm in 70% di etanolo e metterli in cima ad ogni vetrino coprioggetto.
- Preparare la soluzione poli-D-lisina (PDL) miscelando 3 mL di 17 nM acido acetico con 1 ml di collagene coda di ratto e 1 mL di PDL (1 mg / mL). Applicare 200 microlitri di soluzione PDL ai dischi di zaffiro e vetrini per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione PDL e asciugare all'aria. Prima dell'uso, sterilizzare la piastra preparato come fasi 1.4 - 1.6 per 30 min sotto luce ultravioletta.
- Seme astrociti dal punto 1.3 in 2 mL di DMEM ad una densità di 5x10 4 cellule / pozzetto nella piastra preparato come fasi 1.4 - 1.6. Li crescere a 37 ° C e 5% CO 2 per una settimana.
- Aggiungere 20 ml di fluoro-deossiuridina (concentrazione finale: 80 uM) a ciascun pozzetto per almeno alcune ore prima coltura neuroni.
NOTA: Fluoro-deossiuridina ferma divisione astrociti. - Cambiare il medio 1,5 ml di bas neuronalial mezzo (vedere la tabella dei materiali) contenente 1% di L-alanil-L-glutammina (vedere la tabella dei materiali), integratore privo di siero 2% per le cellule neuronali (vedere la tabella dei materiali), e 0,2% di penicillina-streptomicina .
- Preparare la soluzione papaina aggiungendo 20 unità di papaina a 5 mL di soluzione enzimatica (1.65 mM cisteina, 1 mM CaCl 2, e 0,5 mM EDTA in DMEM). Acidificare la soluzione facendo passare gas CO 2 per 20 min. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,22 um.
- Raccolto il cervello da un P0 - 2 del mouse 18. trasferire immediatamente il cervello di soluzione salina Hanks' equilibrato ghiacciata (HBSS). Sezionare i dell'ippocampo sotto uno stereomicroscopio, mantenendo il tessuto immerso in HBSS.
- Posizionare i due ippocampi in 1 mL della soluzione preparata nella fase papaina 1.11. Incubare per 1 ora su un thermomixer a 37 ° C e 750 rpm.
- Sostituire la papaina con 1 ml di soluzione contenente inattivare2,5 mg di inibitore della tripsina e 0,5 mg di albumina per mL di DMEM. Incubare per 5 min a 37 ° C. Aspirare fuori la soluzione inattivazione.
- Aggiungere 200 ml di terreno di base neuronale (vedere la tabella dei materiali) per l'ippocampo isolato. Triturare con una punta della pipetta 200 microlitri per dissociare le cellule. Attendere fino a quando le cellule indissociate si depositano sul fondo. Rimuovere con attenzione il supporto con le cellule dalla parte superiore.
- Ripetere il passaggio 1.15 3x. Pool tutte le cellule dissociate in un nuovo 1,5 ml provetta da centrifuga.
- Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro. Neuroni piastra ad una densità di 6,5 x 10 4 cellule / pozzetto in cima allo strato astrociti preparato in passi 1.1 - 1.10.
- Infettare i neuroni con lentivirus esprimendo channelrhodopsin a DIV 3 (3 d in vitro) 18.
- Eseguire il flash-e-congelamento delle DIV 14, come descritto nei punti 2.1 - 2.5, qui di seguito.
2. Flash-and-Freeze
- Preparazione di fissativo
- Sotto cappa chimica, aggiungere le seguenti sostanze ad un tubo conico per preparare il fissativo: 2,5 mL di glutaraldeide (10% stock in acetone), 0,25 g di tetrossido di osmio, 0,25 mL di acqua e 22,25 mL di acetone anidro.
NOTA: La concentrazione finale di ciascun componente deve essere 1% in acetone. Glutaraldeide viene aggiunta per preservare le strutture proteiche durante freeze-sostituzione. ATTENZIONE: La tossicità acuta del tetrossido di osmio è alto. L'esposizione ai vapori può danneggiare la cornea dell'occhio. Esso deve essere manipolato solo in una cappa chimica certificata. - Aliquotare 1 ml di fissativo in fiale criogeniche numerate (2 mL). Mantenere il fissativo congelato in azoto liquido fino al momento dell'uso.
NOTA: tetrossido Osmio e glutaraldeide cross-reagire con il precipitato; così, una volta mescolato, aliquota immediatamente, cap i tubi, e immergere le cryotubes in azoto liquido per congelare il fissativo. Utilizzare una matita per contare la criofiale geniche, poiché acetone possono lavare marcatori.
- Sotto cappa chimica, aggiungere le seguenti sostanze ad un tubo conico per preparare il fissativo: 2,5 mL di glutaraldeide (10% stock in acetone), 0,25 g di tetrossido di osmio, 0,25 mL di acqua e 22,25 mL di acetone anidro.
- Preparazione di soluzione fisiologica
- Preparare la soluzione salina fisiologica miscelando Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM), e glucosio (10 mM).
NOTA: Questi valori sono concentrazioni finali. Crio-protettori non sono usate per colture monostrato. Tuttavia, una corretta crio-protettivo è richiesto per campioni spessi di 5 um. L'utilizzo del 20% BSA è tipicamente raccomandato. Pasta di lievito ed E. coli OP50 possono essere utilizzati anche come crio-protettori per larve di mosca o C. elegans. - Aggiungere CaCl 2 a 4 mm e MgCl 2 a 1 mm concentrazioni finali.
NOTA: Le concentrazioni di CaCl 2 e MgCl 2 variano a seconda esperimenti. Per garantire la cattura di intermedi esocitosi, 4 mM di calcio viene utilizzato per queste particolari esperimenti per aumentare la probabilità di rilascio di vescicole 18. - Controlla ilosmolarità utilizzando un osmometer. Assicurarsi che è di 300 ± 5 mOsm.
- Aggiungere AMPA antagonista del recettore (NBQX) ad una concentrazione finale di 3 um e antagonista del recettore GABA (bicucullina) ad una concentrazione finale di 30 uM.
NOTA: antagonisti dei recettori del neurotrasmettitore vengono aggiunti al fine di evitare l'attività di rete ricorrente a seguito di stimolazione neuronale 18. - Scaldare la soluzione salina fisiologica a 37 ° C per l'uso.
- Preparare la soluzione salina fisiologica miscelando Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM), e glucosio (10 mM).
- Preparazione del Specialized alta pressione freezer e Unità Automated Fermo Sostituzione
- Prima alta pressione congelamento, raffreddare un'unità sostituzione congelamento automatizzato a -90 ° C per il riempimento del serbatoio con azoto liquido.
- Raffreddare acetone in una tazzina a -90 ° C, collocandolo all'interno della camera campione.
- Riempire il dewar di azoto liquido e dewar conservazione del congelatore ad alta pressione (vedere la tabella dei materiali) con liquido nitrogen.
- Impostare il protocollo di stimolazione luce utilizzando il monitor touch screen.
- Assegnare un nome al programma cliccando su "Modifica" accanto a "Nome del programma" nella finestra di stimolazione luminosa. Un'altra finestra pop-up.
- Impostare un programma digitando "15.000 ms" in "fase buia", "100 ms" nel "periodo", "10 ms" in "pulse" e "1" a "numero di periodi" per un singolo stimolo di 10 Signorina. Congelare le cellule 90 ms dopo (Figura 1C).
NOTA: La "fase buia" permette alle cellule di recuperare da esposizione alla luce durante il caricamento del campione. "Periodo" definisce la frequenza di stimolazione. Ad esempio, se lo stimolo deve essere applicata a 20 Hz, questa colonna deve essere impostata a 50 ms. "Pulse" definisce la durata dello stimolo luce. Infine, il "numero di periodi" definisce il numero totale di stimoli applicati. Per la creazione di una stimolazione ad alta frequenza, vedere
- Per una "nessuna stimolazione" comando a "15 s" in "fase di buio," "0 ms" nel "periodo", "1 ms" in "polso" e "0" a "numero di periodi" alla luce finestra di impostazione stimolazione, come descritto al punto 2.3.4.
NOTA: per impostazione predefinita, il "Pulse" deve essere di almeno 1 ms. - Sulla schermata principale, assicurarsi che la casella per la stimolazione luminosa sia selezionata.
- Impostare il protocollo di archiviazione facendo clic su "Specimen Storage" sulla schermata principale. Clicca su "Modifica". Nella seguente finestra, usare "+" o "-" per selezionare "2" per memorizzare 2 dischi in ciascun canale (3 canali in totale). Check "ha permesso di stoccaggio LN2."
- Esempio Caricamento e congelamento in alta pressione Congelatore
NOTA: tutta l'assemblea del campione e caricamento passaggi sono fatti sotto uno stereomicroscopio con una gamma 7.5-60X ingrandimento. A TWEEZER è usato in fasi 2.4.1 - 2.4.4 per manipolare i campioni. Esperimenti devono essere effettuate a temperatura fisiologica.- Collocare un disco di zaffiro, cellule rivolta verso l'alto, nel pozzo del nero, piastra intermedia (Figura 1B).
- Posizionare un anello distanziatore 100 micron sopra il disco di zaffiro (Figura 1B).
- Inserire un disco di zaffiro bianco sopra l'anello distanziatore (Figura 1B) dopo immersione un lato del disco nella soluzione salina pre-riscaldato dal punto 2.2. Assicurarsi che nessun bolle d'aria intrappolate tra i due dischi di zaffiro.
- Posizionare un altro anello distanziatore 100 um e un anello distanziatore 400 um (Figura 1B). Rimuovere il liquido usando carta da filtro.
- Posizionare il gruppo dal punto 2.4.3 tra i due semicilindri trasparenti (Figura 1A). Chiudere il coperchio rosso in alto per avviare il processo di congelamento.
NOTA: Il protocollo prestabilito viene eseguito automaticamente una volta che il coperchio è chiuso. Il campione rimane nello stesso orientamento nella camera di congelamento, e un lampo di luce viene applicato dalla parte superiore del complesso campione. Il coperchio rosso scatta di nuovo automaticamente una volta che il processo di congelamento è completato. - Conservare il campione in dewar di stoccaggio.
NOTA: Dopo il congelamento, il campione viene fatto cadere automaticamente in un dewar di stoccaggio riempito di azoto liquido e memorizzate fino al procedimento. Dewar di stoccaggio ha tre camere, e ciascuna camera può contenere fino a 3 campioni al massimo. Tipicamente, due campioni sono congelati nelle stesse condizioni di stimolazione, e il congelatore ad alta pressione è programmato per memorizzare sia nella stessa camera. - Ripetere i punti 2.4.1 - 2.4.6 per ogni campione.
- Passare al punto 2.5 una volta che tutte le camere sono piene.
NOTA: Il dispositivo è stato impostato per memorizzare fino a 6 campioni nel dewar di memorizzazione alla volta. Pertanto, dopo ogni 6 th campione, passo 2.5 deve essere eseguita. Una volta scaricato, ripetere i punti 2.4.1 - 2.4.6.
- Esempio di raccolta e il trasferimento a un'unità automatizzato Gelo-sostituzione
- Aprire la porta del dewar di stoccaggio, che si trova sotto il tavolo del congelatore ad alta pressione. Rimuovere il dewar di stoccaggio e posizionarlo sul banco.
- Con le mani, rimuovere la camera campione dal dewar e trasformare in vassoio campioni specializzato riempito con azoto liquido. Sbloccare la manopola per rilasciare la coppa dei campioni.
- Rimuovere il trasparente semicilindri dalla coppa campione con una pinzetta dopo preraffreddamento le punte delle pinzette con azoto liquido (-196 ° C ~). Trasferire accuratamente mezzo, nero piatto ad una tazzina contenente azoto liquido.
NOTA: Le punte delle pinzette devono essere preraffreddati alla temperatura dell'azoto liquido. Il campione deve essere tenuto sotto azoto liquido in ogni momento per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio.
3. Fermo Sostituzione in Automated Gelo-sostituzione dell'unità
- Con una pinzetta pre-raffreddata (punte a ~ -196 ° C), trasferire rapidamente la piastra centrale dal punto 2.5.3 al acetone pre-raffreddata (-90 ° C).
- Separare il disco di zaffiro dalla piastra centrale agitando delicatamente o toccando.
NOTA: A volte, può essere difficile separare il disco di zaffiro dalla piastra centrale. In una tale situazione, lasciare la piastra intermedia in acetone preraffreddato (-90 ° C) per alcuni minuti. picchiettando leggermente con le pinzette aiuta anche a dissociare lo zaffiro dalla piastra centrale. - Posizionare una fiala criogenico contenente fissativi (passo 2.1) all'interno di una camera del campione dell'unità sostituzione. Trasferire il disco di zaffiro alla fiala criogenico e mettere un tappo sul flacone.
- Impostare il programma di sostituzione congelamento come segue: (i) -90 ° C per 5 - 30 h, (ii) -90 - -20 ° C in 14 ore (5 ° C / h), (iii) -20 ° C per 12 h, e (iv) -20 ° C - 20 ° C in 4 ore (10 ° C / h).
NOTA: Il durazione del primo passaggio a -90 ° C potrebbe essere variata. La durata totale della sostituzione congelamento è impostata in modo tale che il programma termina la mattina (~ 1,5 d postexperiment) intorno alle 8 in modo che le fasi successive possono essere eseguite durante il giorno.
4. L'infiltrazione e plastica Embedding con resina epossidica
- Una volta che il programma termina, utilizzare le mani guantate per trasferire le fiale criogeniche contenenti i dischi di zaffiro dalla camera esemplare di unità sostituzione di una cappa chimica.
- Usando una pipetta, aggiungere acetone (temperatura ambiente) per ogni fiala criogenico e lavare ogni disco zaffiro 4 - 6x per 1 - 2 ore.
- Opzionalmente, incubare i campioni a 0,1% acetato di uranile per 1 ora se è necessario contrasto in più. Lavare 4 - 6x con acetone oltre 1 - 2 ore.
NOTA: ATTENZIONE: V'è il rischio associato all'esposizione interna dopo l'inalazione di acetato di uranile, che provoca irritazione del tratto respiratorio superiore. Alta esposizione può damagcellule del sangue e. Lavora con acetato di uranile deve essere effettuato sotto di ventilazione. Si consiglia abbigliamento protettivo. - Preparare liquido mezzo resina epossidica pesando 6,2 g di glicerolo poliglicidil etere, 4,4 g di bisfenolo-A resina epossidica, e 12,2 g di anidride succinica dodecenile (DDSA). Mescolare accuratamente e aggiungere 800 ml di benzil dimetilammina (BDMA) durante la miscelazione. De-gas per 10 min.
- Preparare 30, 70, e 90% di resina epossidica in acetone dalla resina epossidica 100% preparato al punto 4.4.
- Aggiungere resina epossidica 30% alle fiale criogeniche contenenti dischi zaffiro e incubare per 2 - 3 ore a temperatura ambiente in un agitatore orbitale a 120 rpm.
- Sostituire la resina epossidica 30% di resina epossidica 70% pipettando e incubare per 3 - 4 ore a temperatura ambiente in un agitatore orbitale.
- Usando pinzette, trasferire ogni disco zaffiro, cellule-side-up, al tappo di una capsula incorporamento. Aggiungere resina epossidica 90% al tappo. Incubare O / N a 4 ° C.
- Il giorno dopo, a rendere fresco medio resina epossidica, come al punto 4.4.
- Trasferire ciascun disco zaffiro, cellule rivolta verso l'alto, al tappo di una capsula incorporamento. Riempire il tappo con appena preparato resina epossidica 100%. Cambiare alla resina epossidica fresco 100% ogni 2 ore, ripetendo tre volte.
- Mettere i campioni in un forno a 60 ° per 48 ore per polimerizzare.
5. I campioni di montaggio
- Posizionare il campione capovolta sul stereomicroscopio in modo che il disco di zaffiro si trova nella parte superiore del blocco di resina. Rimuovere il sottile strato di resina epossidica dall'alto grattando con una lama di rasoio.
- Utilizzando una lama di rasoio, tagliare una linea superficiale lungo il bordo del disco di zaffiro; questa linea aiuta a separare il disco di zaffiro dalla resina epossidica nel passaggio 5.3.
- Separare il disco di zaffiro dalla resina epossidica immergendolo in azoto liquido per circa 10 s.
NOTA: Le cellule rimarranno nella resina epossidica. - Dopo aver rimosso il disco di zaffiro, utilizzare un ambito dissezione per trovare una zona con cellule (ingrandimento 4-10X). Taglio intorno alla regione di interesse (~ 2 x 2 mm) usando una lama di rasoio (a doppio taglio). Per mantenere il campione in posizione, eseguire questa fase, mentre il campione viene registrato alla superficie del microscopio.
- Montare il piccolo pezzo di plastica (~ 2 x 2 x 5 mm) contenente le cellule utilizzando colla contenente etilcianoacrilato su un blocco vuoto cilindrico in resina epossidica. Incubare il blocco a 60 ° C per 1 h.
6. sezionamento
- Utilizzare un ultramicrotomo alla sezione del campione.
- Tagliare la superficie del campione plastica-embedded con un coltello vetro ad una velocità di 3 mm / s ed uno spessore di 200 nm / sezione. Tagliare 4 - 5 sezioni dalla superficie dove si trovano le astrociti.
- Passare ad una lama di diamante e la sezione ad una velocità di 0,8 mm / s ed uno spessore di 40 nm / sezione. Tagliare 20 - 25 sezioni.
- Raccogliere nastri di sezioni di griglie di rame singolo slot rivestiti 0,7% polivinilacetato (vedila tabella dei materiali).
7. Imaging Utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
- Prima TEM immagini, macchiare la sezione con 2,5% acetato di uranile in metanolo per 5 min.
- Lavare il 15x griglia in metanolo al 50%. Poi, lavare in ultrapura 15x acqua, con ogni lavaggio della durata di 30 s.
- Brevemente aria secca la sezione e posizionare la griglia in un supporto esemplare di TEM.
- Immagine a 93,000X ingrandimento.
- Acquisire le immagini.
NOTA: Imaging è in genere fatto cieco ai punti di tempo o genotipi, e tipicamente ~ 200 immagini vengono raccolte / punto di tempo.
Analisi 8. Immagine
- Analizzare le immagini utilizzando un software (ad esempio, ImageJ) con una macro personalizzata (Watanabe, Davis, e Jorgensen, inedito).
NOTA: L'x / y coordinate sono registrati dalle vescicole, la membrana plasmatica, la membrana zona attiva, e tutti gli altri organelli legata alla membrana a sinapsi. Il fil di testoes contenenti le informazioni vengono esportati in un altro software (ad esempio, Matlab). I dati sono ulteriormente analizzati utilizzando programmi personalizzati.
Representative Results
Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo eseguito "flash e rigelo" esperimenti di topo neuroni dell'ippocampo esprime channelrhodopsin. Questi neuroni sono stati congelati sia 15 ms o 100 ms dopo l'insorgenza di luce. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'esocitosi e endocitosi delle vescicole sinaptiche avvengono nei terminali sinaptici ai 15 ms e 100 ms punti temporali, rispettivamente 18. Questi eventi sono stati catturati con successo al momento opportuno (Figura 2), suggerendo che gli esperimenti di appassimento e rigelo possono essere eseguite con successo nel congelatore ad alta pressione specializzata prescelto (vedere la tabella dei materiali).
Figura 1. Esempio di caricamento e programmazione in alta pressione congelatore. A) Esempio di tabella di carico di un alto pcongelatore ressure. La piastra intermedia, mostrato nel riquadro di dettaglio strutturale, viene collocato in un supporto per il campione CLEM carico. Uno dei semicilindri è posto nella parte inferiore della tabella caricamento del campione, e l'altro è collegato con una clip al coperchio superiore. Una volta caricato il campione, la piastra centrale è spinta in avanti al semicilindro inferiore ed il coperchio è chiuso per iniziare il congelamento. B) assemblaggio campione. Il disco di zaffiro contenente neuroni è collocato nel pozzetto della piastra centrale, con la cellula rivolta verso l'alto. Un anello 100 um è posizionato direttamente sopra il disco di zaffiro all'interno del pozzo. Quindi, un disco zaffiro vuoto immersa in soluzione salina fisiologica viene posizionato con la soluzione rivolto verso il basso. Le bolle d'aria devono essere evitati. Infine, un anello 100 um e un anello 400 um sono comodamente posizionati sopra. Qualsiasi liquido supplementare viene rimosso con carta da filtro. C) Una sezione trasversale di una capsula incorporamento con il disco di zaffiro sommerso in resina epossidica. il Sappassumere disco è collocato nella parte inferiore della capsula, con la cella rivolta verso l'alto e coperto con resina epossidica per l'infiltrazione e l'incorporamento. D) Programmazione del congelatore ad alta pressione per una singola, 10 ms stimolo. I campioni sono congelati 90 ms dopo l'impulso luminoso. E) Programmazione del congelatore ad alta pressione per 10 stimoli a 20 Hz. I campioni sono congelati 5 ms dopo l'ultimo impulso di luce. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Visualizzazione Esocitosi e endocitosi in topo neuroni dell'ippocampo. neuroni dell'ippocampo sono stimolati una volta congelati negli orari indicati. Microscopio elettronico mostrano l'esocitosi di un vescicole sinaptiche A) e endocitosi ultraveloce
Discussion
L'approccio "flash-e-freeze" visualizza dinamica delle membrane inducendo un particolare evento cellulari con optogenetics e congelando cellule in momenti definiti dopo stimolazione 19. In questa dimostrazione, abbiamo utilizzato channelrhodopsin, un canale cationico fotosensibile, per stimolare i neuroni e catturato la fusione e il recupero delle vescicole sinaptiche ai terminali sinaptici. Negli ultimi anni, molti strumenti optogenetic sono stati sviluppati 22, 23, che sono tutti compatibili con flash e rigelo. Ad esempio, il traffico organello può essere indotta utilizzando heterodimerization indotta dalla luce di cryptochrome e CIB1 24. Analogamente, la composizione lipidica della membrana plasmatica può essere alterata dalla traslocazione indotta dalla luce di fosfatasi fosfoinositide alla membrana plasmatica 25. Inoltre, piccole, composti sensibili alla luce come azobenzene chconformazione ange seconda delle lunghezze d'onda di illuminazione. Questo cambiamento conformazionale può essere utilizzato per attivare canali ligando-dipendenti o per modificare la composizione dei lipidi nella membrana 26, 27. composti in gabbia può essere utilizzato anche per indurre l'attività cellulare. Tuttavia, il LED utilizzato nella configurazione attuale non può produrre energia sufficiente per uncaging; quindi, ulteriori ottimizzazioni del sistema sono probabilmente necessarie. Tuttavia, le applicazioni di questi strumenti luce attivabili sono eventi cellulari flessibili-molti possono essere indotti da un lampo di luce. "Flash-e-freeze" in grado di catturare le dinamiche della membrana che ne derivano.
Ci sono due principali limitazioni al metodo "flash-e-freeze". In primo luogo, si coglie "istantanee" di un evento particolare da cellule diverse. In altre parole, non è possibile seguire la dinamica della membrana in una cella per un periodo di tempo. Così, per la ricostruzione di qualsiasi cellulare, anchet, si deve acquisire ed analizzare un gran numero di immagini da ciascun campione e ciascun punto temporale. Inoltre, nei neuroni, un numero ancora maggiore di immagini è necessario poiché la fusione delle vescicole sinaptiche richiede solo indirizzi 20 - 30% delle sinapsi in neuroni ippocampali di topo 18, 28. L'analisi di un insieme di dati di grandi dimensioni quali richiede enormi quantità di tempo. In futuro, l'acquisizione e l'analisi delle immagini devono essere automatizzati per rendere l'approccio più efficiente 29, 30.
La seconda limitazione è imposta dalla natura della tecnica di congelamento ad alta pressione. Quando le cellule congelare, acqua cellulare riorganizza per formare cristalli di ghiaccio se il tasso di congelamento è inferiore a 100 K / s 21. Questi cristalli di ghiaccio possono penetrare le membrane o concentrato soluti per alterare la pressione osmotica locale, con conseguente rottura delle membrane. Per evitare di cristalli di ghiaccio, HIGpressione h (~ 2.000 atm) è applicato ai modelli. Per effetto super-raffreddamento, è sufficiente per impedire all'acqua di formazione di cristalli di ghiaccio a questa pressione 21 una velocità di congelamento di 100 K / s. In teoria, provini spessi come 500 micron possono essere congelati senza cristalli di ghiaccio, ma approssimativamente 200 um è probabilmente il limite pratico, come forme cubica di ghiaccio tendono a formare nel tessuto spesso, compromettendo morfologia. Nell'elaborazione di campioni maggiore di 5 um, l'uso di un adeguato crio-protettivo, come BSA, è necessario. Tuttavia, BSA cambierà l'osmolarità della soluzione e può influenzare la risposta fisiologica di cellule. Pertanto, molti esperimenti di controllo sono tenuti a convalidare l'uso di BSA in sistemi particolari. cristalli di ghiaccio possono anche formare dopo alta pressione congelamento se i campioni vengono rimossi accidentalmente dal bagno di azoto liquido. Pertanto, è fondamentale per mantenere i campioni in azoto liquido in ogni momento e di utilizzare forcipe pre-raffreddati amanipolarli.
Quando si pianifica esperimenti, i seguenti tre punti devono essere considerati. In primo luogo, l'intensità massima della luce (la linea 460 nm) è di 5,5 - 8,0 mW / mm 2. Se questa intensità è sufficiente per indurre l'attività deve essere verificata con il live-cell imaging su un microscopio a fluorescenza prima di esperimenti Flash e rigelo. In secondo luogo, gli esperimenti devono essere eseguiti a temperatura fisiologica. La fase del congelatore ad alta pressione viene riscaldato fino a 37 ° C per gli esperimenti con neuroni ippocampali di topo 31. Infine, i punti di tempo devono essere scelti con attenzione per cogliere le dinamiche della membrana. Gli studi iniziali hanno indicato che l'endocitosi è completa dopo 100 ms di stimolazione. Così, tre punti di tempo addizionali (15, 30, e 50 ms) sono stati anche esaminati per seguire la dinamica della membrana 17, 18. Questi punti di tempo sono state necessarie per visualizzare evento traffico di membranas durante la trasmissione sinaptica. Tuttavia, il requisito per il numero di punti temporali sono diverse in ciascun evento cellulare. Pertanto, alcuni punti di tempo dovrebbero essere campionati prima di iniziare la grande collezione di dati.
Disclosures
Pubblicazione Open Access di questo articolo è stato sponsorizzato da Leica Mikrosysteme GmbH.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Johns Hopkins University (SO). Ringraziamo la Johns Hopkins School of Medicine Microscopio Fondo per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Erik Jorgensen e Christian Rosenmund e dei membri delle loro laboratori per lo sviluppo della tecnica. Ringraziamo M. Wayne Davis per la progettazione del dispositivo iniziale. Ringraziamo Paul Wurzinger, Cveta Tomova e Delgermaa Luvsanjav per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche Natalie R. Hamilton e Grant F. Kusick per la loro lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
- Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
- Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
- Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
- Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
- Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
- van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
- Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
- Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
- Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
