Summary
우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포는 끊임없이 막 구조와 단백질의 분포를 변경할 수 있지만, 각각 MS와 나노 미터 정도의 시간적, 공간적 해상도에서 이러한 이벤트를 시각화하기가 매우 어렵다. 우리는 optogenetics와 세포 이벤트를 유도하고 자극 후 정의 된 시간 지점에서 세포를 동결 결과 막 역학을 시각화 시간이 해결 전자 현미경 기술, "플래시와 동결"을 개발했습니다. 이 기술을 보여주기 위해, 우리는 마우스 해마 신경 세포에서 channelrhodopsin, 빛에 민감한 양이온 채널을 표현했다. 빛의 플래시 신경 활성을 자극하여 시냅스 소포의 융합으로 시냅스 말단으로부터의 신경 전달 물질 방출을 유도한다. 신경의 자극은 optogenetic 시냅스 전달 동안 형태 학적 변화를 따라 고압 동결에 연결되어있다. 상용 장비를 사용하여, 우리는 시냅스 소포의 융합과 SYNA의 회복을 캡처PTIC 소포 막. 일련의 이벤트를 시각화하기 위해 큰 데이터 세트를 생성하고, 형태 변화가 시간이 지남에 따라 다른 셀들 되었기 때문에, 무턱대고 분석. 그럼에도 불구하고, 플래시 및 동결은 MS 시간적 해상도를 가진 전자 현미경 사진에서 막 역학의 시각화 할 수 있습니다.
Introduction
세포 내 세포막 단백질 역학을 가시화하는 특정 프로세스의 세포 생물학을 이해 향해 중요한 단계이다. 동적 인신 매매 이벤트는 빛 또는 형광 현미경을 사용하여 캡처 할 수 있습니다. 세포 내 구조가 완전히 염료 또는 형광 물질로 "그린"과 공간 분해 및 스펙트럼 1,2 될 수 있기 때문에, 세포 내 환경은 주로 이러한 이미지에 누락. 전자 현미경은 정교한 세부에서 세포 내 구조를 묘사 할 수있는 동안 표본 이미징하기 전에 고정해야하기 때문에 다른 한편으로, 그것은 세포 역학를 캡처 할 수 없습니다. 따라서, 완전히 하나의 영상 기법을 이용하여 세포의 역학을 이해하기 일반적으로는 충분하지 않습니다.
빛과 전자 현미경의 한계를 극복하기 위해, 상호 현미경 기술이 개발되었다. 상호 빛과 전자 현미경(클레멘 타인)은 광학 현미경 및 전자 현미경으로 세포 내 기본 구조를 사용하여 세포 내 역학을 가시화. 클레멘 타인, 이러한 세포질과 엔도 시토 시스 3, 4, 5, 6 등의 각종 공정에 종사 세포 라이브 묘화 후 전자 현미경 처리된다. 클레멘 타인은 세포 내 역학의 특정 측면을 캡처하지만,이 방법의 유용성을 제한하는 네 가지 요소가있다. 분 때문에 느린 확산 고정 제 (7)의 반응 - 우선, 시간 해상도는 일반적으로 세포의 소요되며, 고정화하는 속도에 의해 제한된다. 둘째, 세포 내 구조가 관찰 후 사실상 8; 따라서, 동적 형태 변화는이 방법을 사용하여 캡처 될 수 없다. 셋째, 형광 현미경 및 전자 정확하게 조직 SH 때문에 정렬 될 수 없다의 전자 현미경 (9), (10)에 대한 샘플 준비하는 동안 탈수로 인한 rinkage. 넷째, 세포질 분열 및 세포 내 이입과 같은 이벤트는 모든 세포 5, 11에 동시에 발생하지 않으며, 따라서, 이벤트에 종사하는 특정 셀은 세포의 많은 인구에서 식별되어야합니다. 이 과정은 종종 힘든이다. 따라서, 새로운 방법은 모든 세포에서 특정 이벤트를 유도하고 정의 된 시간 지점에서 세포의 급속한 고정하여 그 결과 세포의 역 동성을 포착하는 것이 필요하다.
최근, 여러 도구 등 (optogenetics)를 사용하여 특정 세포 역학을 유도하기 위해 개발되었다. Channelrhodopsin 13, 12 인 Chlamydomonas reinhardtii에서 분리 감광성, 비 선택적 양이온 채널이다. channelrhodopsin은 뉴로 표현하면L 막은 광의 짧은 플래시 뉴런에 나트륨 이온의 유입을 유도 14 15 잠재적 액션을 트리거한다. 활동 전위는 시냅스 소포가 18 따라서 channelrhodopsin 신경 세포 활성을 유도하고, 16 밀리 초 (17) 내의 퓨즈 시냅스 말단으로 전파. 시냅스 터미널에서 막 역학을 수행하기 위해 뉴런은 MS의 정밀도로 자극 한 후 정의 된 시점에 고정해야합니다.
신경 세포 활성을 유도 한 후 막 역학을 캡처하기 위해 고압 17, 18, 19 냉동 빛 자극 결합. 고압 동결 감소 된 얼음 결정의 형성 (20)과 세포의 거의 순간적인 고정을 허용한다. 아이스 크리스탈 캘리포니아N 막을 파열 세포 내 구조 (21)를 방해. 자극 동결 사이의 시간 간격을 변화시킴으로써 시냅스 말단 내의 막 피킹은 활동 전위의 유도 다음 포획 하였다.
여기서, 우리는 커플 고압 동결 광 자극의 시간적 제어 단말 상용화 고압 냉동기를 이용하여 실험 절차를 보여준다. 광 자극 동결을 제어하는 외부 장치를 필요로하는 다른 기기와는 달리, 광 자극은 충분히이 시스템에 통합되고, MS 정밀도 (19)에 적용될 수있다. 이 과정은 여러 단계를 포함한다. 1) 마우스 해마 뉴런 사파이어 디스크 배양 및 렌티 바이러스가 channelrhodopsin 18 발현 벡터를 운반 감염이다. 2) 뉴런은 자극과 자극 후 정의 된 시간 지점에서 동결된다. 3) 유리화 물 대용품유기 용제 (D), 지질 및 단백질 동안 세포 내 구조를 유지하기 위해 고정 제에 의해 돌파 연계. 4) 샘플을 함침 및 에폭시 수지에 포함된다. 5) 매우 얇은 부분은을 Ultramicrotome을 사용하여 수집된다. 6) 얇은 절편을 투과형 전자 현미경 상에 결상된다. 7) 화상 획득 및 분석 시점 또는 유전자형에 대하여 맹목적 행한다. 셀룰러 역학 시분 이미지 (17), (18)의 재구성을 통해 결정될 수있다. 일주일이 필요하지만, 이후의 이미지 분석은 년 개월을 필요로 - 샘플 준비 (위 5 2 단계를).
Protocol
실험의 모든 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의한 규칙과 동물 사용의 규정에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 존스 홉킨스 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
1. 분리 및 문화 마우스 해마 신경 세포의
- 출생 후의 일 0 피질을 해부 - 2 일 (P0 - 2) 마우스의 뇌 (18). 피질에서 성상 세포를 분리합니다.
참고 : 마우스의 뇌가 잘린 후 분리 하였다. 성상은 해마 신경 세포에 대한 급전 층으로서 작용한다. - 아스트로 사이트를 해리 37 ° C에서 15 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA 800 μL와 피질 치료.
- 배양 10 % 우 태아 혈청 (FBS) 및 0.2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 주일, 37 ℃에서 5 % CO 2를 함유하는 DMEM 중 13 mL를 갖는 T-75 플라스크에서 아스트로.
- 하나 개의 산 세척 소독 18mm 유리 커버 슬립의 장소 PE12- 웰 플레이트의 웰 R.
- 간단히 70 % 에탄올로 두 6mm 탄소 코팅 된 사파이어 디스크를 세척하고 각 유리 커버 슬립 위에 배치합니다.
- 래트 꼬리 콜라겐 1 ㎖ 및 PDL 1 ㎖ (1 ㎎ / ㎖)을 17 nM의 아세트산 3 ㎖를 혼합하여 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 준비한다. RT에서 5 분 동안 사파이어 디스크 및 커버 글라스에 PDL 용액 200 μL를 적용한다.
- PDL 솔루션 및 건조 공기를 제거합니다. 자외선 하에서 30 분 동안 1.6 - 사용 단계에서 제조 된 1.4 플레이트를 멸균에 앞서.
- 1.6 - 1.4에서 제조 단계로 플레이트 / 웰로 5 × 104 세포의 밀도로 DMEM 2 ㎖로 13 단계에서 아스트로 종자. 일주일 동안 CO 2를 37 ° C에서 그들을 성장 5 %.
- 신경 세포를 배양하기 전에 최소한 몇 시간 동안 각 웰 (80 μM 최종 농도) 플루오로 데 옥시 우리 딘 20 μL를 추가한다.
참고 : 플루오로 데 옥시 우리 딘이 성상 세포 분열을 중지합니다. - 신경 BAS의 1.5 mL의 매체를 변경1 %의 L- 알라 닐 -L- 글루타민 (물질의 표를 참조), 신경 세포를 2 %의 혈청 보충제 (물질의 표를 참조), 0.2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 함유하는 알 매체 (재료의 도표 참조) .
- 효소 용액 5 ㎖ (1.65 mM의 시스테인, 1mM의 CaCl2를 한 DMEM 0.5 mM의 EDTA) 파파인 20 개 단위 첨가하여 파파인 용액을 준비한다. 20 분 동안 CO2 가스를 전달하여 상기 용액을 산성화. 0.22 μm의 필터로 멸균 필터.
- 2 마우스 18 - P0에서 뇌를 수확. 즉시 얼음처럼 차가운 Hanks' 균형 소금 솔루션 (HBSS)으로 뇌를 전송합니다. HBSS에 빠져들 조직을 유지, 실체 현미경 하에서 해마를 해부하다.
- 1.11 단계에서 제조 된 파파인 액 1ml에 두 해마를 놓는다. 37 ° C와 750 rpm에서 써모 1 시간 동안 품어.
- 함유하는 용액을 비활성화 1 mL로 파파인 바꾸기트립신 억제제 2.5 mg의 DMEM 1 ㎖ 당 0.5 mg의 알부민. 37 ° C에서 5 분 동안 인큐베이션. 제균 솔루션 대기음.
- 분리 된 해마 신경 기초 배지 (재료의 도표 참조) 200 μL를 추가한다. 세포 해리 200 μL 피펫 팁을 사용 씹다. 해리되지 않은 세포는 바닥에 정착 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 상단에서 세포와 매체를 제거합니다.
- 단계를 반복 1.15 배. 수영장 새로운 1.5 mL의 원심 분리기 튜브의 모든 해리 세포.
- 혈구를 사용하여 세포의 수를 계산합니다. 플레이트 6.5 × 104 세포의 밀도로 뉴런 / 웰의 단계 1.1에서 제조 한 성상 세포 층의 상부 - 1.10.
- 렌티 바이러스는 DIV 3 (시험 관내 3 d) 18 channelrhodopsin 발현과 신경 감염.
- 단계 2.1에 기재된 바와 같이, 14 DIV 플래시 및 동결을 수행 - 2.5 이하.
2. 플래시D 동결
- 정착액의 제조
- 글루 타르 알데히드 2.5 ㎖ (아세톤 10 % 주), 산화 오스뮴 0.25 g, 물 0.25 ㎖, 무수 아세톤 22.25 용액 : 화학 후드, 정착액을 제조 원뿔형 튜브에 다음 성분을 추가한다.
주 : 각 성분의 최종 농도는 아세톤에 1 %이어야한다. 글루 타르 알데히드는 동결 대체하는 동안 단백질 구조를 유지하기 위해 추가됩니다. 주의 : 사 산화 오스뮴의 급성 독성이 높다. 증기에 노출되면 눈의 각막을 손상시킬 수 있습니다. 이 작업은 공인 된 화학 후드에서 처리되어야합니다. - 극저온 나누어 번째 바이알 (2 mL)에 고정 제 1 ㎖. 사용할 때까지 액체 질소에 냉동 정착액을 유지합니다.
참고 : 오스뮴 테트 록 사이드 글루 타르 알데하이드 교차 반응 및 침전; 따라서, 일단 튜브 캡과 정착액 동결 액체 질소에서 cryotubes 잠수함 즉시, 분취 액을 혼합 하였다. 크라이 번호를하기 위해 연필을 사용하여제닉 유리 병은 이후 아세톤 마커를 씻어 수 있습니다.
- 글루 타르 알데히드 2.5 ㎖ (아세톤 10 % 주), 산화 오스뮴 0.25 g, 물 0.25 ㎖, 무수 아세톤 22.25 용액 : 화학 후드, 정착액을 제조 원뿔형 튜브에 다음 성분을 추가한다.
- 생리 식염수의 제조
- 헤 페스 (10 mm의 pH를 7.5), 염화나트륨 (140 밀리미터)의 KCl (2.4 mM)을 포도당 (10 mm)를 혼합하여 생리 식염수 용액을 만든다.
참고 :이 값은 최종 농도이다. 극저온 보호제는 단층 배양에 사용되지 않습니다. 그러나, 적절한 크라이 보호제는 5㎛보다 두꺼운 시험편에 요구된다. 20 % BSA의 사용은 일반적으로 권장합니다. 효모 페이스트 및 E. 콜라이 OP50은 파리 유충 또는 선충에 대한 극저온 보호제로서 사용될 수있다. - 1 개 mM의 최종 농도 4 mM 내지의 MgCl 2의 CaCl2를 추가.
참고 : 염화칼슘 2의 MgCl 2의 농도는 실험에 따라 달라집니다. exocytic 중간체의 캡처를 보장하기 위해, 4 mM의 칼슘은 소포 (18)의 방출 확률을 높이기 위해 이러한 특정 실험에 사용됩니다. - 을 체크하다삼투압을 이용하여 삼투압. 이 300 ± 5 mOsm 있는지 확인합니다.
- 30 μM의 최종 농도가 3 μM 및 GABA 수용체 길항제 (bicuculline)의 최종 농도로 AMPA 수용체 길항제 (NBQX)를 추가한다.
참고 : 신경 전달 물질 수용체 길항제는 신경 자극 (18) 다음 재발 네트워크 활동을 방지하기 위해 추가됩니다. - 사용을위한 37 ° C에 생리 식염수를 따뜻하게.
- 헤 페스 (10 mm의 pH를 7.5), 염화나트륨 (140 밀리미터)의 KCl (2.4 mM)을 포도당 (10 mm)를 혼합하여 생리 식염수 용액을 만든다.
- 특수 고압 냉장고와 자동 정지 대체 단위의 준비
- 고압 동결 이전에, 액체 질소 탱크에 충전하여 -90 ℃로 냉동 자동 대행 부 식혀.
- 시료 챔버의 내부에 배치하여 C ° -90 작은 컵 아세톤 식혀.
- 액체 니트로 고압 냉동기의 액체 질소 듀어 스토리지 듀어 (물질의 표를 참조)에 기입세대.
- 터치 스크린 모니터를 사용하여 빛 자극 프로토콜을 설정합니다.
- 빛 자극 창에서 다음 "프로그램 이름"에 "편집"을 클릭하여 프로그램의 이름을 지정합니다. 또 다른 창이 나타납니다.
- "펄스"에서의 "15000 MS」 「어두운 상", "100 밀리 기간"에 "," "10 MS"를 입력하여, 프로그램을 설정하고 "1"(10)의 하나의 자극은 "주기의 수"에 MS. 세포 90 밀리 이상 (그림 1C)를 고정.
참고 : "어두운 단계는"세포 샘플로드하는 동안 빛에 노출로부터 복구 할 수 있습니다. "기간"자극 주파수를 정의합니다. 자극은 20 Hz에서 적용 할 경우, 예를 들어,이 열은 50 밀리 초에서 설정되어야한다. "펄스"빛 자극의 지속 시간을 정의합니다. 마지막으로, "기간 수는"적용 자극의 총 수를 정의합니다. 고주파 자극을 설정을 참조하시기 바랍니다
- 빛의 "아니오 자극"제어 입력 "15 초", "다크 상", "주기 수"에서 "0 시간"에서 "단말기", "1 MS" "펄스"및 "0"에 대한 자극 설정 창이 같은 단계 2.3.4에서 설명.
참고 : 기본적으로는 적어도 1 밀리해야한다 "펄스". - 메인 화면에서 빛 자극에 대한 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
- 메인 화면에 "표본 저장"을 클릭하여 저장 프로토콜을 설정합니다. 를 클릭하십시오 "편집." "-"(총 3 개 채널), 각 채널에서 2 개 개의 디스크를 저장하는, "2"를 선택한 다음 창에서 "+"또는 사용. 확인 "저장 LN2 활성화."
- 샘플로드와 고압 냉장고에 냉동
참고 : 모든 샘플 조립 및 로딩 단계는 7.5-60X 확대 범위와 실체 현미경 아래에서 수행됩니다. tweez표본을 조작 2.4.4 - 어이 단계에서 2.4.1를 사용한다. 실험은 생리적 온도에서 수행해야합니다.- 셀 측 블랙, 중간 플레이트 (도 1b)의 웰에서 위로 향하게 한 사파이어 디스크를 놓는다.
- 사파이어 디스크 (도 1b) 위에 100㎛의 스페이서 링을 놓는다.
- 단계 2.2에서 예열 식염수에 디스크의 한쪽면을 침지 한 후, 스페이서 링 (도 1b) 위에 빈 사파이어 디스크를 놓는다. 공기 방울이 두 개의 사파이어 디스크 사이에 갇혀 있지 않은지 확인합니다.
- 다른 100 ㎛의 스페이서 링 및 400 ㎛의 스페이서 링 (도 1b)를 놓는다. 종이 필터를 사용하여 여분의 액체를 제거합니다.
- 두 투명 반 실린더 (도 1a) 사이의 단계 2.4.3에서 어셈블리를 놓는다. 냉동 과정을 시작 상단 빨간색 덮개를 닫습니다.
참고 : 덮개가 닫혀 일단 사전 설정 프로토콜은 자동으로 실행. 샘플은 냉동실에서 동일한 방향으로 유지하고, 빛의 플래시 샘플 조립체의 상부로부터인가된다. 빨간색 커버까지 자동으로 동결 프로세스가 완료되면 다시 나타납니다. - 저장 듀어의 표본을 저장합니다.
주 : 동결 한 후, 시험편을 자동 액체 질소로 채워진 저장소 듀어 삭제 및 추가 처리 될 때까지 거기에 저장된다. 저장 듀어 세 챔버를 갖고, 각 챔버는 많아야 3 개 시료를 넣을 수있다. 일반적으로, 두 시험편은 동일한 자극 조건에서 동결되고, 고압의 냉동기 동일한 챔버 모두를 저장하도록 프로그램된다. - 각 시편 2.4.6 - 반복 2.4.1 단계를 반복합니다.
- 모든 챔버가 가득하면 2.5 단계로 진행합니다.
참고 : 장치가 한 번에 저장 듀어 6 개 검체까지 저장하도록 설정했다. 따라서, 매 6 번째 샘플 후에 단계 250가 수행되어야한다. 2.4.6 - 언로드되면 반복 2.4.1 단계.
- 컬렉션 샘플 및 자동화 냉동 대체 단위로 이동
- 고압 냉동기 테이블 아래에 위치되는 스토리지 듀어, 문을 연다. 저장 듀어를 제거하고 벤치 탑에 놓습니다.
- 손을 사용 듀어로부터 시료 챔버를 분리하고 액체 질소로 채워진 전문 샘플 트레이에 옮긴다. 시료 컵을 해제 손잡이의 잠금을 해제합니다.
- 액체 질소 핀셋의 선단을 미리 냉각 한 후, 핀셋을 이용하여 시료 컵의 투명 반 실린더를 제거 (~ -196 ° C). 조심 액체 질소를 함유하는 작은 컵 중앙 검정 플레이트를 옮긴다.
참고 : 핀셋의 끝은 액체 질소의 온도로 미리 냉각해야합니다. 샘플을 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 항상 액체 질소하에 유지되어야한다.
아프리카 연합 3. 정지 대체tomated 동결 대체 단위
- (~ -196 C °에서 팁을) 미리 냉각 핀셋을 사용하여 신속하게 미리 냉각 된 아세톤 단계 2.5.3에서 중간 판을 전송 (-90 ° C).
- 부드럽게 흔들거나 터치하여 중간 판으로부터 사파이어 디스크를 분리한다.
참고 : 때때로, 그것은 중간 판에서 사파이어 디스크를 분리하기 어려울 수 있습니다. 이러한 상황에서, 미리 냉각하여 아세톤의 중간 판을 떠나 (-90 ° C) 몇 분 동안. 핀셋 젠틀 도청은 중앙 판에서 사파이어를 떼어 놓다하는 데 도움이됩니다. - 대체 수단의 시료 챔버 안에 고정 제 (단계 2.1)을 함유하는 저온 유리 병을 놓고. 극저온 바이알에 사파이어 디스크를 전송하고 병에 뚜껑을 놓습니다.
- - 30 시간, (ⅱ) -90 - -20 ° C 14 시간 (5 ° C / H)에있어서, (ⅲ) -20 ° C (Ⅰ) -90 ° C에서 5 : 다음 동결 교체 프로그램 설정 20 ℃에서 4 시간 (10 ° C / H) - 12 개 (H), 및 (IV)에서 -20 ° C에 대한.
참고 : 뒤-90 ℃에서의 첫 번째 단계의 정량은 변화 될 수있다. 동결 대체의 총 기간은 후속 단계가 낮 동안 수행 할 수 있도록 프로그램이 오전 8 주위의 아침 (~ 1.5 개발 postexperiment)로 끝나는 방식으로 설정되어 있습니다.
에폭시 수지 4 침윤 성형 임베딩
- 프로그램이 종료되면, 화학 후드로 교체 유닛의 시료 챔버로부터 사파이어 디스크를 포함하는 극저온 튜브를 전송할 낀 손을 사용한다.
- 피펫을 사용하여, 각각 저온 바이알에 아세톤 (실온)를 첨가하고, 각각의 디스크 (4) 사파이어 워시 - 2 시간 - 1 6X한다.
- 여분의 대비가 필요한 경우 선택적으로, 1 시간 동안 0.1 % 우라 닐 아세테이트에서 시료를 배양. 4 워시 - 2 시간 - 1 이상 아세톤으로 6 배.
주 :주의 : 상부기도의 자극을 일으키는 우라 닐 아세테이트의 흡입 다음 내부 노출과 관련된 위험이있다. 높은 노출 damag 수 있습니다전자 혈액 세포. 우라 닐 아세테이트과 협력 배기 장치에서 수행해야합니다. 보호 복을 권장합니다. - 글리세롤 폴리 글리시 딜 에테르 6.2 g, 비스페놀 A 형 에폭시 수지 4.4 g 및 도데 세닐 숙신산 무수물 (DDSA) 12.2 g을 칭량하여 액체 에폭시 수지 재료를 준비한다. 철저하게 믹스와 혼합하면서 벤질 디메틸 아민 (BDMA)의 800 μL를 추가합니다. 10 분 드 가스.
- 단계 4.4에서 제조 한 100 %의 에폭시 수지를 아세톤에 30, 70, 및 90 %의 에폭시 수지를 준비한다.
- 사파이어 디스크를 포함하는 극저온 병에 30 %의 에폭시 수지를 첨가하고 2 부화 - 120 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 3 시간.
- 피펫으로 70 % 에폭시 수지 30 % 에폭시 수지를 교체하고 3 부화 - 오비탈 진탕 기에서 실온에서 4 시간.
- 핀셋을 사용하여, 매립 캡슐의 캡에 각각 사파이어 디스크 셀 측해서 옮긴다. 캡에 90 % 에폭시 수지를 추가합니다. 4 ℃에서 O / N 부화.
- 다음 날, 4 단계로, 신선한 에폭시 수지 매체를 만들0.4.
- 매립 캡슐의 캡을 위로 향하게 각각 사파이어 디스크 셀 측 이동. 새로 제조 된 100 % 에폭시 수지와 캡을 작성하십시오. 세 번 반복, 신선한 100 % 에폭시 수지로 매 2 시간을 변경합니다.
- 48 시간 중합을 위해 60 ° C의 오븐에서 샘플을 놓는다.
5. 설치 샘플
- 사파이어 디스크 수지 블록의 상단에 위치되도록 실체에 샘플 거꾸로 놓는다. 면도날을 긁어서 위로부터 에폭시 수지의 얇은 층을 제거한다.
- 면도날을 사용하여 사파이어 디스크의 가장자리를 따라 얕은 선 절단; 이 광고는 단계 5.3에 에폭시 수지 사파이어 디스크를 분리하는 것을 돕는다.
- 약 10 초간 액체 질소로 침지하여 에폭시 수지와 사파이어 디스크를 분리한다.
참고 : 세포가 에폭시 수지에 남아있을 것입니다. - 사파이어 디스크를 제거한 후 (셀 영역을 찾는 해부를 사용4-10X 배율). 면도날을 이용하여 관심 영역 (~ 2 × 2mm) 주위 컷 (이중 칼날). 시편은 현미경의 표면에 녹화되는 동안 자리에 표본을 유지하려면이 단계를 수행합니다.
- 에폭시 수지로 이루어지는 원통형의 더미 블록에 에틸 시아 노 아크릴 레이트를 함유하는 접착제를 사용하여 세포를 포함하는 플라스틱의 작은 조각 (~ 2 × 2 × 5 mm)를 탑재. 1 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 블록.
6. 단면
- 섹션에을 Ultramicrotome 샘플을 사용합니다.
- 3mm / s의 속도를 200 ㎚ / 부의 두께 유리 칼 플라스틱 매립 시험편의 표면을 낸다. 아스트로 사이트가있는 표면으로부터 5 부 - 4 컷.
- 0.8 mm / s의 속도로 40 ㎚ / 부의 두께 다이아몬드 나이프 섹션으로 전환. 25 절 - 20 컷.
- 0.7 %의 폴리 비닐 아세테이트 덮여 단일 슬롯 구리 그리드에 부의 리본을 수집 (참조 :재료의 표).
전송 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 7. 이미징
- 이미징을 TEM 5 분간 메탄올 중 2.5 % 우라 닐 아세테이트 부분을 염색하기 전에.
- 50 % 메탄올 그리드의 15 배를 씻으십시오. 그런 다음, 30 초 지속 각각의 세척으로, 초순수의 15 배에 씻는다.
- 짧게 부분을 공기 - 건조와의 TEM 표본 홀더에 격자를 배치했다.
- 93,000X 배율에서 이미지.
- 이미지를 획득.
참고 : 이미지는 일반적으로 시점 또는 유전자형에 블라인드 수행되며, 일반적으로 ~ 200 이미지 / 시간 포인트를 수집하고 있습니다.
8. 이미지 분석
- 사용자 지정 매크로 (게시되지 않은 와타나베, 데이비스, 그리고 젠슨)와 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에)를 사용하여 이미지를 분석합니다.
주 :이 X / Y 좌표 소체로부터 기록, 세포막, 활성 존 막 및 시냅스 다른 막 결합 소기관. 텍스트 FIL정보가 포함 된 ES는 다른 소프트웨어 (예를 들어, matlab에)에 수출하고 있습니다. 데이터는 추가로 사용자 지정 프로그램을 사용하여 분석한다.
Representative Results
위에 설명 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 마우스 해마 신경 세포에서 "플래시와 동결"실험 channelrhodopsin을 표현하는 수행. 이 뉴런은 15 밀리 초 또는 빛 발병 후 100 밀리 하나를 동결했다. 우리는 이전에 시냅스 소포의 세포 외 유출 및 세포 내 이입이 시냅스 15 MS에서 터미널과 100 개 밀리 시점 각각 18에서 발생하는 것으로 나타났습니다. 이러한 이벤트는 성공적으로 (재료의 표 참조) 그 플래시 및 동결 실험이 성공적으로 선택한 전문 고압 냉장고에서 수행 할 수있는 제안, 적절한 시간 (그림 2)에서 붙 잡았다.
고압 냉장고 그림 1. 샘플로드 및 프로그래밍. 높은 쪽의 A) 샘플 탑재 대ressure 냉장고. 구조적 세부 사항에 대한 삽입에 도시 된 중간 플레이트, 샘플 로딩하는 클렘 홀더에 배치된다. 하프 실린더 중 하나가 샘플 적재 테이블의 바닥 부에 배치되고, 다른 하나는 상부 커버에 클립이 부착된다. 샘플이로드되면 미들 플레이트 아래쪽 실린더로 진행되고 커버가 동결을 개시하기 위해 폐쇄된다. B) 시험편 조립체. 뉴런을 포함하는 사파이어 디스크 셀 측이 위쪽을 향하도록 상기 중간 플레이트의 웰에 배치된다. 100㎛의 링은 직접 내부 웰 사파이어 디스크 위에 배치된다. 이어서, 생리 식염수에 침지 빈 사파이어 디스크 아래 용액 측에 배치된다. 공기 방울은 피해야한다. 마지막으로, 100㎛의 링 및 400 μm의 링을 꼭 위에 배치된다. 여분의 액을 여과지로 제거된다. C) 에폭시 수지에 잠긴 사파이어 디스크 매립 캡슐의 단면도. SAPP고용 디스크 셀 측이 위로 향하게하여, 캡슐의 아래쪽에 배치되고 침윤 및 매립 에폭시 수지로 덮여있다. 하나의 10ms 자극 용 고압 냉동기 프로그래밍 D). 시편 빛 펄스 후 90 밀리 동결된다. E)는 20 Hz에서 10 자극 용 고압 냉동 프로그래밍. 시편은 마지막 빛 펄스 후 5 밀리 동결된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 해마 신경 세포에서 세포 외 유출 및 세포 내 이입 2. 시각화 그림. 해마 신경 세포는 한 번 자극하고 지정된 시간에 고정된다. 전자 현미경은 시냅스 소포 A의 세포 외 유출) 및 초고속 엔도 시토 시스를 보여
Discussion
은 "플래시 및 동결"접근법 optogenetics와 특정 세포 사건을 유도함으로써 자극 후 19 정의 된 시점에서 세포를 동결 막 역학을 가시화한다. 이 예제에서, 우리는 신경을 자극하는 channelrhodopsin, 감광성 양이온 채널을 사용하여 시냅스 말단에서 융합과 시냅스 소포의 복구를 캡처. 최근 몇 년 동안, 많은 optogenetic 도구는 플래시와 동결와 호환 모두 22, 23, 개발되었다. 예를 들어, 세포 소기관 피킹은 cryptochrome 및 CIB1 (24)의 광 - 유도 heterodimerization을 사용하여 유도 될 수있다. 유사하게, 세포막의 지질 성분이 세포막 25 포스 포스파타제의 광 - 유도 된 전위에 의해 변경 될 수있다. 또한, 아조벤젠 CH 같은 작은 감광성 화합물조명 파장에 따라 플랜지 형태. 이러한 형태 변화는 리간드 - 게이트 채널을 활성화 시키거나 막 26, 27, 지질 조성물을 변경하는데 사용될 수있다. 리테이너 화합물은 세포 활성을 유도하는 데 사용될 수있다. 그러나, 현재의 설정에 사용되는 LED는 uncaging위한 충분한 에너지를 얻지 못할 수; 따라서, 시스템의 추가 최적화가 필요한 것. 그럼에도 불구하고,이 빛 기동 도구의 응용 프로그램은 유연한 많은 세포 이벤트가 빛의 플래시에 의해 유도 될 수있다. "플래시와 동결은"결과 막 역학을 캡처 할 수 있습니다.
은 "플래시와 동결"방법 두 가지 제한이 있습니다. 첫째, 다른 세포에서 특정 이벤트의 "스냅 샷"을 캡처합니다. 즉, 일정 기간 동안 하나 개의 셀에 막 역학을 수행 할 수 없다. 따라서, 어떤 세포의 재건도t는 1 구하여 각 시료의 각 시점에서 다수의 이미지를 분석한다. 마우스 해마 뉴런 18, 28 시냅스의 30 % - 시냅스 소포가 융합 20에 대한 걸리므 또한, 뉴런, 화상의 더 큰 수가 필요하다. 이러한 큰 데이터 세트의 분석은 시간의 엄청난 양을 필요로한다. 향후, 이미지 수집 및 분석 (29), (30) 접근 방식이보다 효율적으로 자동화 할 필요가있다.
두 번째 제한은 고압 냉동 기술의 특성에 의해 부과된다. 세포를 동결하면 물이 세포 동결 속도가 100 K / s 미만이면 21 얼음 결정을 형성하도록 재 배열한다. 이 얼음 결정이 세포막을 통과 또는 막의 파열 결과 로컬 삼투압을 변경하는 용질을 집중할 수있다. 얼음 결정을 방지하기 위해, HIGH 압 (~ 2000 기압) 시험편에 적용된다. 인해 과냉각 효과, 100 K / s의 속도 차는 압력이 (21)에 얼음 결정이 형성되는 물을 방지하기에 충분하다. 이론적으로 500 μm의 얼음 결정을하지 않고 고정 할 수 있지만, 얼음 입방 형태 두꺼운 조직으로 형성하는 경향이 약 200 μm의 형태를 손상시키는 가능성이 실제 한계만큼 두꺼운 표본. 처리는보다 두꺼운 5 μm의 표본 때 이러한 BSA 등의 적절한 크라이 보호제의 사용이 필요하다. 그러나, BSA는 용액의 삼투압을 변경하고 세포의 생리적 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 광범위한 제어 실험은 특정 시스템 BSA의 사용을 확인해야한다. 시험편 실수 액체 질소 욕조에서 제거되면 얼음 결정은 고압 동결 후 형성 할 수있다. 따라서, 항상, 액체 질소에서 시료를 유지하고 미리 냉각에 겸자를 사용하는 것이 중요를 조작 할 수 있습니다.
실험을 계획 할 때 다음과 같은 세 가지 점을 고려해야한다. 8.0 mW의 / mm 2 - 먼저, 광의 최대 강도 (460 nm의 라인)은 5.5이다. 이 강도가 활동을 유도하기에 충분 여부 플래시 및 동결 실험 이전에 형광 현미경 라이브 셀 이미징 확인해야합니다. 둘째, 실험은 생리적 온도에서 수행해야합니다. 고압 냉동실 스테이지 마우스 해마 뉴런 31 실험을 37 ℃로 가온된다. 마지막으로, 시점은 신중하게 막 역 동성을 포착하기 위해 선택해야합니다. 초기 연구는 세포 내 이입이 자극의 100 밀리 후 완료 것으로 나타났다. 따라서, 세 개의 추가 시점 (15, 30, 50 밀리 초)도 막 역학 (17) (18)을 따라 조사 하였다. 이 시점은 막 인신 매매 이벤트를 시각화 할 필요가 있었다시냅스 전달시의. 그러나 시점의 수에 대한 요구 사항은 각 세포의 경우에 다릅니다. 따라서, 몇 시간 포인트는 대형 데이터 세트 수집을 시작하기 전에 채취해야한다.
Disclosures
이 문서의 오픈 액세스 출판은 라이카 Mikrosysteme GmbH에 의해 후원되었다.
Acknowledgments
이 작품은 존스 홉킨스 대학 (SW)에서 자금을 지원했다. 우리는 그들의 기술 지원 의료 현미경 시설의 존스 홉킨스 대학 감사합니다. 우리는 기술의 발전을 위해 에릭 요르겐센 기독교 Rosenmund과 실험실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 초기 장치의 설계에 M. 웨인 데이비스합니다. 우리는 그들의 기술 지원을 폴 워징거, 크베타 토모바 및 Delgermaa Luvsanjav 감사합니다. 우리는 또한 원고의 비판적 읽기 나탈리 R. 해밀턴 그랜트 F. Kusick 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
- Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), aab3500 (2015).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. Correlated light microscopy and electron microscopy. Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography. Cell. 150 (3), 508-520 (2012).
- Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution. Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).
- Müller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis. Cellular Electron Microscopy. 79, Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X06790045 101-119 (2007).
- Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).
- Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM. Micron. 88, 77-83 (2016).
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. eLife. 2, e00723 (2013).
- Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S. Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution. Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , Springer-Verlag. (1987).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Weitzman, M., Hahn, K. M. Optogenetic approaches to cell migration and beyond. Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).
- Niu, J., Ben Johny,, Dick, M., E, I., Inoue, T. Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects. Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).
- van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning. Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).
- Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).
- Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides. J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).
- Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-757 (1993).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Watanabe, S., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
