Summary
Nous avons développé une nouvelle technique en microscopie électronique, « flash et gel » qui permet la visualisation de la dynamique de la membrane avec ms résolution temporelle. Cette technique combine la stimulation optogenetic des neurones avec le gel à haute pression. Ici, nous démontrons les procédures et décrire les protocoles en détail.
Abstract
Les cellules changent constamment leur architecture de la membrane et la distribution des protéines, mais il est extrêmement difficile de visualiser ces événements à une résolution spatiale et temporelle de l'ordre de ms et nm, respectivement. Nous avons mis au point une technique de microscopie électronique à résolution temporelle, « flash et gel, » qui induit des événements cellulaires avec optogénétique et la dynamique de visualiser membrane résultante par congélation des cellules à des moments définis après stimulation. Pour démontrer cette technique, nous avons exprimé channelrhodopsin, un canal de cation sensible à la lumière, dans les neurones hippocampiques de souris. Un flash de lumière stimule l'activité neuronale et induit la libération de neurotransmetteurs à partir de terminaux synaptiques par la fusion des vésicules synaptiques. La stimulation des neurones optogenetic est couplée à la congélation à haute pression de suivre les changements morphologiques au cours de la transmission synaptique. L'utilisation d'un instrument commercial, nous avons capturé la fusion des vésicules synaptiques et la récupération du Synamembrane vésiculaire CITP. Pour visualiser la séquence des événements, grands ensembles de données ont été obtenues et analysées à l'aveuglette, car les changements morphologiques ont été suivies dans différentes cellules au fil du temps. , Flash et gel permet néanmoins la visualisation de la dynamique de la membrane en micrographies électroniques avec ms résolution temporelle.
Introduction
membrane visualisant et la dynamique des protéines dans une cellule est une étape clé pour la compréhension de la biologie cellulaire des processus particuliers. les événements de trafic dynamiques peuvent être capturés en utilisant la microscopie optique ou la fluorescence. Cependant, le contexte subcellulaire manque en grande partie dans ces images parce que les structures sous - cellulaires ne peuvent pas être complètement « peint » par des colorants ou des sondes fluorescentes et résolus dans l' espace et spectralement 1, 2. D'autre part, alors que la microscopie électronique peut définir l'architecture subcellulaire en détail exquis, il ne peut pas saisir la dynamique cellulaire, parce que les échantillons doivent être fixés avant l'imagerie. Ainsi, il est généralement pas suffisante pour comprendre complètement la dynamique cellulaire en utilisant une seule modalité d'imagerie.
Pour surmonter les limites de la microscopie optique et électronique, les techniques de microscopie corrélatifs ont été mis au point. Corrélative Lumière et Microscopie électronique(Clem) visualise la dynamique intracellulaire à l'aide de la microscopie optique et des structures sous-cellulaires sous-jacents à la microscopie électronique. Dans CLEM, les cellules engagées dans divers processus, tels que la cytocinèse et l' endocytose 3, 4, 5, 6, sont sous tension imagée et ensuite traitées pour la microscopie électronique. Bien que CLEM capture certains aspects de la dynamique intracellulaire, il y a quatre facteurs qui limitent l'utilité de cette approche. Tout d' abord, la résolution temporelle est limitée par la vitesse à laquelle les cellules peuvent être immobilisées, ce qui prend typiquement s - min en raison de la lente diffusion et la réaction de fixateurs 7. En second lieu , l'architecture est subcellulaire post facto 8 observé; ainsi, les changements morphologiques dynamiques ne peuvent pas être capturées à l'aide de cette approche. Troisièmement, ne peuvent pas être alignés avec précision les micrographies de fluorescence et électronique en raison de tissus shrinkage provoquée par la déshydratation au cours de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique 9, 10. En quatrième lieu , des événements comme la cytocinèse et endocytose ne se produisent pas en même temps dans toutes les cellules 5, 11, et donc, une cellule particulière qui est engagée dans l'événement doivent être identifiés à partir d' une grande population de cellules. Ce processus est souvent laborieux. Ainsi, une nouvelle méthode est nécessaire pour induire des événements particuliers dans toutes les cellules et pour capturer la dynamique cellulaire résultant de l'immobilisation rapide des cellules à des moments définis.
Récemment, plusieurs outils ont été développés pour induire la dynamique cellulaire particulier en utilisant la lumière (optogénétique). Channelrhodopsin est un canal cationique sensible à la lumière, non sélective isolé à partir de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Lorsque channelrhodopsin est exprimé en Neuronamembranes l, un bref éclair de lumière induit un influx d'ions sodium dans les neurones et déclenche un potentiel d' action 14, 15. Le potentiel d'action se propage ensuite dans les terminaisons synaptiques, où les vésicules synaptiques fusionnent en quelques millisecondes 16, 17, 18 Par conséquent, channelrhodopsin induit l' activité neuronale. Pour suivre la dynamique des membranes au niveau des bornes synaptiques, les neurones doivent être immobilisés à des moments définis après stimulation avec ms précision.
Pour capturer la dynamique de la membrane après l' induction de l' activité neuronale, nous avons couplé une stimulation lumineuse à haute pression de congélation 17, 18, 19. Congélation à haute pression permet l'immobilisation quasi-instantanée des cellules avec formation de cristaux de glace 20 réduite. Des cristaux de glace can rupture des membranes et de perturber l'architecture subcellulaire 21. En faisant varier les intervalles de temps entre la stimulation et le gel, le trafic de membrane à l'intérieur des terminaux synaptiques a été capturé suite à l'induction d'un potentiel d'action.
Ici, nous démontrons les procédures expérimentales en utilisant un congélateur à haute pression commercialisé que les couples un ms de contrôle temporel de stimulation lumineuse avec le gel à haute pression. Contrairement à d' autres instruments qui nécessitent un dispositif externe pour contrôler la stimulation et verglaçante, la stimulation lumineuse est entièrement intégrée dans ce système et peut être appliqué avec précision ms 19. Ce processus implique plusieurs étapes. 1) des neurones de l' hippocampe de souris sont mises en culture sur des disques de saphir et infectés par le lentivirus portant un vecteur d'expression pour channelrhodopsin 18. 2) Neurones sont stimulés et congelés à des moments définis après stimulation. 3) L'eau est vitrifié substitutd avec un solvant organique, tandis que les lipides et les protéines sont réticulées par des fixateurs de préserver l'architecture intracellulaire. 4) Les échantillons sont infiltrés et enrobés dans une résine époxy. 5) Des coupes ultrafines sont recueillies à l'aide d'un ultramicrotome. 6) Des coupes minces sont imagés sur un microscope électronique à transmission. 7) l'acquisition et analyse d'images sont réalisées en aveugle par rapport à des points de temps ou génotypes. Dynamique cellulaire peut être déterminée par la reconstruction des images à résolution temporelle 17, 18. Préparation de l'échantillon (étapes 2 - 5 ci-dessus) nécessite une semaine, mais l'analyse de l'image suivante nécessite mois à un an.
Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées selon les règles et règlements d'utilisation des animaux par les National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à Johns Hopkins School of Medicine.
1. Isolement et culture de la souris Neurones hippocampique
- Disséquer corticales d'un jour après la naissance 0 - jour 2 (P0 - 2) le cerveau de la souris 18. Isoler les astrocytes des corticales.
REMARQUE: Le cerveau de la souris a été isolé après la décapitation. Astrocytes servent de couche d'alimentation pour les neurones hippocampiques. - Traiter les cortex avec 800 pL de 0,05% de trypsine-EDTA pendant 15 min à 37 ° C pour dissocier les astrocytes.
- Culture des astrocytes dans un flacon T-75 avec 13 ml de DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 0,2% de pénicilline-streptomycine pendant une semaine à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Placer une lavées à l'acide et stérilisés 18 mm pe de lamelle de verrer puits d'une plaque à 12 puits.
- Laver brièvement deux disques de saphir enrobées de carbone de 6 mm à 70% d'éthanol et de les placer sur le dessus de chaque lamelle de verre.
- Préparer Poly-D-Lysine (PDL) solution en mélangeant 3 ml de 17 nM d'acide acétique avec 1 ml de collagène de queue de rat et 1 ml de PDL (1 mg / ml). Appliquer 200 ul de solution PDL aux disques de saphir et des lamelles de verre pendant 5 minutes à température ambiante.
- Retirer la solution PDL et l'air sec. Avant l'utilisation, la stérilisation de la plaque tel que préparé dans les étapes 1.4 à 1.6 pendant 30 min sous une lumière ultraviolette.
- Ensemencer les astrocytes de l' étape 1.3 dans 2 ml de DMEM à une densité de 5x10 4 cellules / puits dans la plaque tel que préparé dans les étapes 1.4 - 1.6. Cultiver eux à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une semaine.
- Ajouter 20 uL de fluoro-désoxyuridine (concentration finale: 80 uM) à chaque puits pendant au moins quelques heures avant la culture des neurones.
REMARQUE: Fluoro-désoxyuridine arrête la division astrocytes. - Changer le support à 1,5 ml de bas neuronalesal milieu (voir le tableau des matériaux) contenant 1% de L-alanyl-L-glutamine (voir le tableau des matériaux), 2% de supplément exempt de sérum pour des cellules neuronales (voir le tableau des matériaux) et 0,2% de pénicilline-streptomycine .
- Préparer la solution de papaïne en ajoutant 20 unités de papaïne à 5 ml de solution d'enzyme (1,65 mM de cysteine, 1 mM de CaCl2 et 0,5 mM d' EDTA dans du DMEM). Acidifier la solution par passage de gaz de CO 2 pendant 20 minutes. Filtre-stériliser avec un filtre de 0,22 um.
- Récolter le cerveau d'un P0 - 2 souris 18. transférer immédiatement le cerveau à sel Hanks' équilibré glacée Solution (HBSS). Disséquer les hippocampes sous un stéréomicroscope, en gardant le tissu immergé dans HBSS.
- Placez les deux hippocampes dans 1 ml de la solution de papaïne préparée à l'étape 1.11. Incuber pendant 1 h sur un Thermomixer à 37 ° C et 750 tours par minute.
- Remplacez la papaïne avec 1 ml de solution contenant inactivant2,5 mg d'inhibiteur de trypsine et 0,5 mg d'albumine par ml de DMEM. Incuber pendant 5 min à 37 ° C. Aspirer la solution inactivant.
- Ajouter 200 ul de milieu de base neuronale (voir le tableau des matériaux) de l'hippocampe isolé. Triturer l'aide d'une pointe de pipette de 200 pi pour dissocier les cellules. Attendre jusqu'à ce que les cellules non dissociées se déposent au fond. Retirez délicatement le milieu avec les cellules du haut.
- Répétez l'étape 3 x 1,15. Piscine toutes les cellules dissociées dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 ml.
- Comptez le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Neurones en plaques à une densité de 6,5 x 10 4 cellules / puits au - dessus de la couche d'astrocyte préparé dans les étapes 1.1 - 1.10.
- Infecter les neurones avec des lentivirus exprimant channelrhodopsin à DIV 3 (3 d in vitro) 18.
- Effectuer flash et le gel des DIV 14, comme décrit dans les étapes 2.1 - 2.5, ci-dessous.
2. Flash und-Freeze
- Préparation de fixatif
- Sous une hotte chimique, ajouter les substances suivantes dans un tube conique de préparer le fixateur: 2,5 ml de glutaraldéhyde (stock 10% dans l'acétone), 0,25 g de tétroxyde d'osmium, 0,25 ml d'eau et 22,25 ml d'acétone anhydre.
REMARQUE: La concentration finale de chaque composant doit être de 1% dans de l'acétone. Le glutaraldéhyde est ajouté à préserver les structures de protéines au cours de congélation-substitution. ATTENTION: La toxicité aiguë du tétroxyde d'osmium est élevée. L'exposition aux vapeurs pourrait endommager la cornée de l'œil. Il doit être manipulé que dans une hotte chimique certifiée. - Aliquote de 1 ml de fixatif dans des flacons cryogéniques numérotés (2 ml). Gardez le fixatif congelé dans de l'azote liquide jusqu'à utilisation.
NOTE: Le tétroxyde d'osmium et glutaraldehyde réaction croisée et précipiter; Ainsi, une fois mélangée, immédiatement aliquote, coiffer les tubes, et submerger les cryotubes dans de l'azote liquide pour geler le fixateur. Utilisez un crayon pour le numéro cryoflacons géniques, car l'acétone peut laver des marqueurs.
- Sous une hotte chimique, ajouter les substances suivantes dans un tube conique de préparer le fixateur: 2,5 ml de glutaraldéhyde (stock 10% dans l'acétone), 0,25 g de tétroxyde d'osmium, 0,25 ml d'eau et 22,25 ml d'acétone anhydre.
- Préparation de la Saline Physiologique
- Ajouter une solution saline physiologique par mélange Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) et du glucose (10 mM).
NOTE: Ces valeurs sont des concentrations finales. Cryoprotecteurs ne sont pas utilisés pour les cultures monocouche. Cependant, un cryo-protecteur approprié est nécessaire pour les échantillons plus épais que 5 um. L'utilisation de 20% de BSA est généralement recommandé. Pâte de levure et E. coli peuvent OP50 de également être utilisés comme cryoprotecteurs pour les larves de mouches ou C. elegans. - Ajouter CaCl2 à 4 mM et du MgCl2 à 1 mM concentrations finales.
NOTE: Les concentrations de CaCl2 et MgCl2 varient en fonction des expériences. Afin d' assurer la capture des intermédiaires exocytose, 4 mM de calcium est utilisé pour ces expériences particulières pour augmenter la probabilité de libération de vésicules 18. - Vérifier laosmolarité en utilisant un osmomètre. Assurez-vous qu'il est de 300 ± 5 mOsm.
- Ajouter antagoniste du récepteur AMPA (NBQX) à une concentration finale de 3 uM et de l'antagoniste du récepteur GABA (bicuculline) à une concentration finale de 30 uM.
NOTE: les antagonistes des récepteurs de neurotransmetteur sont ajoutés pour éviter l' activité du réseau récurrent suite à une stimulation neuronale 18. - Réchauffer la solution saline physiologique à 37 ° C pour une utilisation.
- Ajouter une solution saline physiologique par mélange Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) et du glucose (10 mM).
- Préparation du Specialized haute pression Congélateur et une unité de gel automatique Remplacement
- Avant la congélation à haute pression, refroidir une unité de substitution de blocage automatique à -90 ° C en remplissant le réservoir avec de l'azote liquide.
- Refroidir l'acétone dans une petite tasse à -90 ° C en la plaçant à l'intérieur de la chambre de spécimen.
- Remplir le Dewar d'azote liquide et le vase Dewar de stockage du congélateur à haute pression (voir le tableau des matériaux) avec nitro liquidegen.
- Mettre en place le protocole de stimulation lumineuse à l'aide du moniteur à écran tactile.
- Nommez le programme en cliquant sur « Modifier » à côté de « Nom du programme » dans la fenêtre de stimulation lumineuse. Une autre fenêtre pop-up.
- Mettre en place un programme en tapant « 15.000 ms » en « phase sombre », « 100 ms » dans « période », « 10 ms » dans « impulsion » et « 1 » en « nombre de périodes » pour un seul stimulus de 10 Mme. Congeler les cellules 90 ms plus tard (Figure 1C).
NOTE: La « phase sombre » permet aux cellules de récupérer d'une exposition lumière pendant le chargement des échantillons. « Période » définit la fréquence de stimulation. Par exemple, si le stimulus doit être appliqué à 20 Hz, cette colonne doit être réglée à 50 ms. « Pulse » définit la durée du stimulus lumineux. Enfin, le « nombre de périodes » définit le nombre total de stimuli appliqués. Pour la mise en place d'une stimulation à haute fréquence, s'il vous plaît voir
- Pour une commande « pas de stimulation », type « 15 s » dans la « phase d'obscurité », « 0 ms » dans « période », « 1 ms » en « impulsion » et « 0 » en « nombre de périodes » à la lumière la fenêtre de configuration de stimulation, comme décrit dans l'étape 2.3.4.
REMARQUE: Par défaut, le « pouls » doit être d'au moins 1 ms. - Sur l'écran principal, assurez-vous que la case pour la stimulation lumineuse est cochée.
- Mettre en place le protocole de stockage en cliquant sur « des échantillons de stockage » sur l'écran principal. Cliquez sur « Modifier ». Dans la fenêtre suivante, en utilisant « + » ou « - », pour sélectionner « 2 » pour stocker 2 disques dans chaque canal (3 canaux au total). Cochez la case « Stockage LN2 activé. »
- Chargement des échantillons et de congélation dans la haute pression Congélateur
REMARQUE: Tous l'ensemble de l'échantillon et l'étape de chargement sont effectuées sous une loupe binoculaire avec une plage de grossissement 7.5-60X. A Tweezer est utilisé dans les étapes 2.4.1 - 2.4.4 pour manipuler les échantillons. Les expériences doivent être effectuées à la température physiologique.- Placer un disque de saphir, du côté de la cellule vers le haut, dans le puits de la plaque médiane noir, (figure 1B).
- Placer un anneau d'espacement 100 um sur le disque de saphir (figure 1B).
- Placer un disque de saphir blanc sur la bague d'écartement (figure 1B) après immersion d' un côté du disque dans la solution de sérum physiologique préchauffé à l' étape 2.2. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air piégées entre les deux disques saphir.
- Placer une autre bague d'écartement 100 um et une bague d'espacement 400 um (figure 1B). Retirez le liquide en utilisant du papier filtre.
- Placer l'ensemble dans l' étape 2.4.3 entre les deux demi-cylindres transparents (figure 1A). Fermez le couvercle rouge en haut pour lancer le processus de congélation.
REMARQUE: Le protocole prédéfini exécute automatiquement une fois que le couvercle est fermé. L'échantillon reste dans la même orientation dans la chambre de congélation, et un éclair de lumière est appliqué à partir du haut de l'ensemble de l'échantillon. Le couvercle rouge désenclencher automatiquement une fois le processus de congélation est terminée. - Conservez l'échantillon dans le dewar de stockage.
NOTE: Après congélation, l'échantillon est laissé tomber automatiquement dans un vase de Dewar de stockage rempli d'azote liquide et stockées jusqu'à ce que le traitement ultérieur. Le vase de Dewar de stockage comporte trois chambres et chaque chambre peut contenir jusqu'à 3 échantillons au maximum. En règle générale, deux échantillons sont congelés dans les mêmes conditions de stimulation, et la congélation à haute pression est programmé pour stocker à la fois dans la même chambre. - Répétez les étapes 2.4.1 - 2.4.6 pour chaque échantillon.
- Passer à l'étape 2.5 une fois que toutes les chambres sont pleines.
REMARQUE: Le dispositif a été mis pour stocker jusqu'à 6 exemplaires dans le dewar de stockage à la fois. Par conséquent, après chaque échantillon 6 e, étape 2.5 doit être effectuée. Une fois déchargé, répétez les étapes 2.4.1 - 2.4.6.
- Exemple de collecte et de transfert à une unité automatique gel substitution
- Ouvrez la porte du dewar de stockage, qui est situé sous la table du congélateur à haute pression. Retirez le dewar de stockage et placez-le sur la paillasse.
- Utilisation de la main, retirer la chambre d'échantillon à partir du vase de Dewar et le transférer dans le magasin spécialisé d'échantillon rempli d'azote liquide. Déverrouiller le bouton pour libérer la coupelle éprouvette.
- Retirer les demi-cylindres transparents à partir de la coupelle d'échantillon en utilisant une paire de pinces à épiler après pré-refroidissement des extrémités des pinces à épiler avec de l'azote liquide (-196 ° C ~). transférer soigneusement le milieu, plaque noire à une petite tasse contenant de l'azote liquide.
NOTE: Les conseils de la pince à épiler doivent être préalablement refroidi à la température de l'azote liquide. L'échantillon doit être maintenu sous azote liquide à tout moment pour empêcher la formation de cristaux de glace.
3. Remplacement gel dans l'Aumatis Unité gel de substitution
- En utilisant une pince à épiler préalablement refroidis (conseils à ~ 196 ° C), transférer rapidement la plaque médiane de l'étape 2.5.3 à l'acétone, refroidie au préalable (-90 ° C).
- Séparer le disque de saphir à partir de la plaque centrale en agitant doucement ou en tapotant.
NOTE: De temps en temps, il peut être difficile de séparer le disque de saphir de la plaque centrale. Dans une telle situation, laisser la plaque intermédiaire dans de l'acétone préalablement refroidie (-90 ° C) pendant quelques minutes. tapotant doucement avec des pincettes aide aussi à dissocier le saphir de la plaque centrale. - Placer un flacon cryogénique contenant des fixateurs (étape 2.1) à l'intérieur d'une chambre d'échantillon de l'unité de substitution. Transférer le disque de saphir dans le flacon cryogénique et placer un bouchon sur le flacon.
- Mettre en place le programme de substitution de gel de la manière suivante: (i) à -90 ° C pendant 5-30 h, (ii) de -90 à -20 ° C en 14 h (5 ° C / h), (iii) -20 ° C pendant 12 h, et (iv) -20 ° C - 20 ° C en 4 h (10 ° C / h).
NOTE: Le duration de la première étape à -90 ° C peut être modifiée. La durée totale de substitution gel est réglé de telle sorte que le programme se termine le matin (~ 1,5 d postexperiment) vers 8 heures afin que les étapes suivantes peuvent être effectuées pendant la journée.
4. Embedding Infiltration et plastique avec résine époxy
- Une fois que le programme est terminé, utiliser des gants pour transférer les flacons cryogéniques contenant les disques de saphir à partir de la chambre d'échantillon de l'unité de substitution à une hotte chimique.
- À l'aide d'une pipette, ajouter l'acétone (température ambiante) à chaque flacon cryogénique et laver chaque disque de saphir 4 - 6x pour 1 - 2 h.
- Eventuellement, incuber les échantillons dans 0,1% d'acétate d'uranyle pendant 1 h, si le contraste supplémentaire est nécessaire. Laver 4 - 6x avec de l'acétone pendant 1 - 2 h.
REMARQUE: ATTENTION: Il existe un risque associé à l'exposition interne suite à l'inhalation d'acétate d'uranyle, ce qui provoque une irritation des voies respiratoires supérieures. Une forte exposition peut Damagles cellules sanguines. e Le travail avec de l'acétate d'uranyle doit être fait sous ventilation d'échappement. Vêtements de protection est recommandé. - Préparer le milieu de résine époxy liquide en pesant 6,2 g d'éther polyglycidylique de glycérol, 4,4 g de bisphénol-A de résine époxy, et 12,2 g d'anhydride dodécénylsuccinique (DDSA). Bien mélanger et ajouter 800 ul de la benzyldiméthylamine (BDMA) tout en mélangeant. De gaz pendant 10 min.
- Préparer 30, 70, et 90% de résine époxyde dans de l'acétone à partir de la résine époxy à 100% préparé à l'étape 4.4.
- Ajouter 30% de résine époxy pour les flacons cryogéniques contenant des disques de saphir et incuber pendant 2 - 3 h à TA dans un agitateur orbital à 120 tours par minute.
- Remplacer la résine époxy de 30% avec une résine époxy de 70% par pipetage et incuber pendant 3 - 4 h à TA dans un agitateur orbital.
- En utilisant des pinces, transférer chaque disque de saphir, cellule-side-up, à la coiffe d'une capsule enrobage. Ajouter 90% de résine époxy pour le bouchon. Incuber O / N à 4 ° C.
- Le lendemain, faire moyen de résine époxy frais, comme dans l'étape 4.4.
- Transférer chaque disque de saphir, du côté de la cellule vers le haut, à la coiffe d'une capsule enrobage. Remplir la capsule avec de la résine à 100% d'époxy fraîchement préparé. Modification de résine époxy frais 100% toutes les 2 h, en répétant trois fois.
- Placer les échantillons dans un four à 60 ° C pendant 48 heures pour polymériser.
5. Les échantillons de montage
- Placer l'échantillon à l'envers sur le stéréomicroscope de telle sorte que le disque de saphir est situé dans la partie supérieure du bloc de résine. Retirer la couche mince de résine époxy à partir du haut en grattant avec une lame de rasoir.
- En utilisant une lame de rasoir, couper une ligne peu profonde le long du bord du disque de saphir; cette ligne permet de séparer le disque de saphir à partir de la résine époxy dans l'étape 5.3.
- Séparer le disque de saphir à partir de la résine époxy en le plongeant dans l'azote liquide pendant environ 10 s.
NOTE: Les cellules restent dans la résine époxy. - Après avoir retiré le disque de saphir, utiliser un microscope de dissection pour trouver une zone avec des cellules (grossissement 4-10X). Couper autour de la région d'intérêt (~ 2 x 2 mm) en utilisant une lame de rasoir (double tranchant). Pour garder l'échantillon en place, effectuer cette étape alors que l'échantillon est scotchée à la surface du microscope.
- Monter le petit morceau de plastique (~ 2 x 2 x 5 mm) contenant les cellules avec de la colle cyanoacrylate d'éthyle contenant un bloc fictif cylindrique en résine époxy. Incuber le bloc à 60 ° C pendant 1 h.
6. Sectionnement
- Utilisez un ultramicrotome à la section de l'échantillon.
- Garniture de la surface de l'échantillon, incorporé en plastique avec un couteau de verre à une vitesse de 3 mm / s et une épaisseur de 200 nm / section. Couper 4 - 5 sections de la surface où les astrocytes sont situés.
- Passer à un couteau de diamant et de l'article à une vitesse de 0,8 mm / s et une épaisseur de 40 nm / section. Couper 20 - 25 sections.
- Récupérer des rubans de sections sur des grilles de cuivre unique sous couvert de 0,7% d'acétate de vinyle (voirla table des matières).
7. imagerie à l'aide d'un microscope électronique à transmission (TEM)
- Avant imagerie TEM, tacher la section avec 2,5% d'acétate d'uranyle dans du methanol pendant 5 minutes.
- Laver la grille 15x à 50% de methanol. Puis, lavez à 15x de l'eau ultra pure, chaque lavage durant 30 s.
- En bref séchage à l'air de la section et placer la grille dans un porte-échantillon du TEM.
- Image au grossissement 93,000X.
- Acquérir des images.
NOTE: L'imagerie est généralement fait aveugle aux points de temps ou génotypes, et typiquement ~ 200 images sont collectées / point de temps.
8. Analyse de l'image
- Analyser les images à l' aide d' un logiciel (par exemple, ImageJ) avec une macro personnalisée (Watanabe, Davis et Jorgensen, non publié).
NOTE: les coordonnées x / y sont enregistrées à partir de vésicules, la membrane plasmatique, la membrane de zone active, et tous les autres organelles liées à la membrane au niveau des synapses. Le fil de textees contenant les informations sont exportées vers un autre logiciel (par exemple, Matlab). Les données sont ensuite analysées à l'aide des programmes personnalisés.
Representative Results
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons réalisé des expériences « flash et regel » chez la souris les neurones hippocampiques exprimant channelrhodopsin. Ces neurones ont été gelés soit 15 ms ou 100 ms après l'apparition de la lumière. Nous avons précédemment montré que l'exocytose et l' endocytose des vésicules synaptiques se produisent dans les terminaisons synaptiques au cours des 15 ms et 100 ms points de temps, respectivement 18. Ces événements ont été capturés avec succès aux moments appropriés (figure 2), ce qui suggère que des expériences flash et regel peuvent être effectuées avec succès sur le congélateur spécialisés à haute pression choisie (voir la table des matières).
Figure 1. Chargement des échantillons et la programmation dans la haute pression Congélateur. A) table de chargement de l' échantillon d'un haut-pcongélateur ression. La plaque intermédiaire, représentée dans l'encart pour les détails de structure, est placé dans un support CLEM pour le chargement de l'échantillon. L'un des demi-cylindres est placé à la partie inférieure de la table de chargement de l'échantillon, et l'autre est fixé par un clip sur le couvercle supérieur. Une fois que l'échantillon est chargé, la plaque centrale est poussée vers l'avant de la demi-cylindre inférieur et le couvercle est fermé pour initier la congélation. B) le montage de l' éprouvette. Le disque de saphir neurones contenant est placé dans le puits de la plaque intermédiaire, avec le côté de la cellule vers le haut. Un anneau 100 um est placée directement au-dessus du disque de saphir à l'intérieur du puits. Ensuite, un disque de saphir vide trempé dans du sérum physiologique est placé avec la solution vers le bas. Les bulles d'air doivent être évités. Enfin, une bague 100 um et une bague 400 um sont parfaitement placées au-dessus. Tout liquide supplémentaire est retiré avec du papier filtre. C) Une coupe transversale d'une capsule enrobage avec le disque de saphir immergé dans une résine époxy. le SAPPengager le disque est placé au fond de la capsule, avec le côté de la cellule vers le haut et recouverte de résine époxy pour l'infiltration et l'enrobage. D) Programmation du congélateur à haute pression pour un seul stimulus de 10 ms. Les échantillons sont congelés 90 ms après l'impulsion de lumière. E) Programmation du congélateur à haute pression pour 10 stimuli à 20 Hz. Les échantillons sont congelés 5 ms après la dernière impulsion lumineuse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Visualisation de l' exocytose et endocytose dans Souris Neurones hippocampique. les neurones hippocampiques sont stimulés une fois et congelés aux heures indiquées. Les micrographies électroniques montrent l'exocytose d'une vésicule synaptique A) et ultra - rapide endocytose
Discussion
L'approche « flash et gel » dynamique de la membrane permet de visualiser en induisant un événement cellulaire particulier avec optogénétique et par congélation des cellules à des moments définis après stimulation 19. Dans cette démonstration, nous avons utilisé channelrhodopsin, un canal cationique sensible à la lumière, pour stimuler les neurones et captura la fusion et la récupération des vésicules synaptiques aux bornes synaptiques. Ces dernières années, de nombreux outils ont été développés optogénétiques 22, 23, qui sont tous compatibles avec le flash et le gel. Par exemple, le trafic de organite peut être induite en utilisant hétérodimérisation induite par la lumière de cryptochrome et CIB1 24. De même, la composition lipidique de la membrane plasmatique peut être altérée par la translocation induite par la lumière du phosphoinositide phosphatases à la membrane de plasma 25. En outre, de petits composés sensibles à la lumière tels que azobenzène chconformation ange en fonction des longueurs d'onde d'illumination. Ce changement de conformation peut être utilisé pour activer les canaux ligand-dépendants ou pour modifier la composition lipidique de la membrane 26, 27. les composés peuvent également être mis en cage utilisés pour induire une activité cellulaire. Cependant, la LED utilisée dans la configuration actuelle ne peut pas produire suffisamment d'énergie pour uncaging; ainsi, d'autres optimisations du système sont probablement nécessaires. Néanmoins, les applications de ces outils de lumière activables sont des événements cellulaires-plusieurs flexibles peuvent être induites par un éclair de lumière. « Flash et gel » peuvent saisir la dynamique de la membrane résultant.
Il y a deux principales limites à la méthode « flash et gel ». Tout d'abord, il capture des « instantanés » d'un événement particulier de cellules différentes. En d'autres termes, il est impossible de suivre la dynamique de la membrane dans une cellule sur une période de temps. Ainsi, pour la reconstruction d'un même cellulairet, il faut acquérir et analyser un grand nombre d'images de chaque échantillon et à chaque point de temps. De plus, dans les neurones, est nécessaire, un nombre encore plus d'images depuis la fusion des vésicules synaptiques ne prend place dans 20 - 30% des synapses dans les neurones hippocampiques de souris 18, 28. L'analyse d'un tel grand ensemble de données nécessite d'énormes quantités de temps. À l'avenir, l' acquisition et l' analyse d' image doivent être automatisée pour rendre l'approche plus efficace 29, 30.
La deuxième limite est imposée par la nature de la technique de congélation à haute pression. Lorsque le gel cellules, réarrange l' eau cellulaire pour former des cristaux de glace , si la vitesse de congélation est inférieure à 100 K / s 21. Ces cristaux de glace peuvent pénétrer les membranes ou concentrer des solutés pour modifier la pression osmotique locale, ce qui entraîne la rupture des membranes. Pour éviter des cristaux de glace, HIGh Pression (~ 2.000 atm) est appliquée aux échantillons. En raison de l'effet de super-refroidissement, une vitesse de congélation de 100 K / s est suffisante pour empêcher l' eau de se former des cristaux de glace à cette pression 21. En théorie, les échantillons plus épais que 500 um peuvent être congelés sans cristaux de glace, mais environ 200 um est probablement la limite pratique, comme des formes cubiques de glace ont tendance à se former dans les tissus épais, ce qui compromet la morphologie. Lorsque le traitement des échantillons plus épais que 5 um, l'utilisation d'un cryo-protecteur approprié, tel que BSA, est nécessaire. Cependant, la BSA va changer l'osmolarité de la solution et peut affecter la réponse physiologique des cellules. Par conséquent, les expériences de contrôle approfondies sont nécessaires pour valider l'utilisation de BSA dans des systèmes particuliers. Les cristaux de glace peuvent se former après congélation à haute pression si les échantillons sont accidentellement enlevés du bain d'azote liquide. Ainsi, il est essentiel de garder les échantillons dans l'azote liquide à tout moment et d'utiliser des pinces préréfrigérés àles manipuler.
Lors de la planification des expériences, les trois points suivants doivent être pris en considération. Tout d' abord, l'intensité maximale de la lumière (la ligne 460 nm) est de 5,5 à 8,0 mW / mm 2. Que cette intensité est suffisante pour induire l'activité doit être vérifiée avec l'imagerie de cellules vivantes sur un microscope à fluorescence avant les expériences flash et regel. D'autre part, les expériences doivent être effectuées à la température physiologique. L'étape de la congélation à haute pression est réchauffé à 37 ° C pour les expériences avec les neurones de l' hippocampe de souris 31. Enfin, les points de temps doivent être choisis avec soin de saisir la dynamique de la membrane. Les premières études ont indiqué que l'endocytose est complète après 100 ms de stimulation. Ainsi, trois points de temps supplémentaires (15, 30, et 50 ms) ont également été examinés pour suivre la dynamique de la membrane 17, 18. Ces points de temps ont été nécessaires pour visualiser l'événement de trafic membranaires lors de la transmission synaptique. Cependant, l'exigence du nombre de points de temps sont différents dans chaque événement cellulaire. Par conséquent, quelques points de temps doivent être échantillonnés avant de lancer grande collection de données.
Disclosures
Ouvrir la publication d'accès de cet article a été parrainé par Leica Mikrosysteme GmbH.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le financement de l'Université Johns Hopkins (SW). Nous remercions l'école Johns Hopkins School of Medicine Facility Microscope pour leur soutien technique. Nous remercions Erik Jorgensen et Christian Rosenmund et les membres de leurs laboratoires pour le développement de la technique. Nous remercions M. Wayne Davis pour la conception du dispositif initial. Nous remercions Paul Wurzinger, Cveta Tomova, et Delgermaa Luvsanjav pour leur assistance technique. Nous remercions également Natalie R. Hamilton et Grant F. Kusick pour leur lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
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