我们开发的电子显微镜,“闪光和冻结,”一种新的技术,使膜动力学与毫秒的时间分辨率的可视化。该技术结合了高压冷冻神经元的光遗传学刺激。这里,我们证明的程序和详细描述了协议。
细胞不断地改变它们的膜结构和蛋白质的分布,但它是非常困难的,在MS和纳米量级的时间和空间分辨率分别可视化这些事件。我们已经开发出一种时间分辨电子显微技术,“闪光和冻结,”诱导细胞事件与光遗传学和刺激后在规定的时间点冷冻细胞可视化所产生的膜动力学。为了证明这种技术,我们表达通道视紫红,光敏阳离子通道,在小鼠海马神经元。光的闪光刺激神经元活动,并通过突触小泡的融合诱导从突触末端释放神经递质。神经元的光遗传学刺激加上高压冷冻跟随突触传递中的形态学变化。使用商业工具,我们捕捉到突触小泡的融合和SYNA恢复普天泡膜。为了显现事件序列,产生和分析盲目的,因为形态学变化在不同的细胞随着时间的推移,接着大的数据集。尽管如此,闪存和冻结允许膜动力学的电子显微照片与毫秒时间分辨率的可视化。
一个小区内的可视化膜和蛋白质动力学是理解特定过程的细胞生物学中的关键步骤。动态广告投放管理事件可以使用光或荧光显微镜来捕获。然而,亚细胞状况很大程度上在这样的图像丢失,因为亚细胞结构不能完全的“绘制”由染料或荧光探针和空间分辨的光谱和1,2。在另一方面,当电子显微镜可以以精致的细节描绘亚细胞结构,它不能捕获细胞动力学,因为标本必须成像前固定。因此,它通常是不够的仅使用一个成像模态完全理解细胞动力学。
为了克服光学和电子显微镜的局限,相关的显微镜技术已经开发出来。相关光学和电子显微镜(CLEM)可视化使用光镜和电镜底层的亚细胞结构细胞内动力学。在CLEM,从事各种过程,例如胞质和胞吞作用3,4,5,6个细胞,是活成像,然后用于电子显微镜进行处理。虽然CLEM捕捉细胞内动态的某些方面,有四个因素限制了这种方法的实用性。分由于缓慢扩散和固定剂7的反应-首先,时间分辨率被细胞能多快被固定,后者通常需要限量。其次,亚细胞结构中观察到事后 8;因此,动态的形态变化,不能使用这种方法捕获。第三,荧光和电子显微照片不能精确由于组织SH对准用于电子显微镜9,10中的样品制备过程中通过脱水rinkage引起的。第四,像细胞分裂和内吞作用的事件不采取在同一时间发生在每一个细胞5,11,因此,这是从事活动的特定细胞必须从一个人口众多的细胞进行鉴定。这个过程通常是费力。因此,一种新的方法是必要的,以诱导在每个细胞中的特定事件,并在确定的时间点,以捕获由细胞的快速固定化所得到的细胞动力学。
最近,一些工具被开发出来,以引起利用光(光遗传学)特定细胞动力学。紫红质通道是从莱茵衣藻 12,13分离的光敏感,非选择性阳离子通道。当紫红质通道中neurona表示升膜,光的简要闪光诱导钠离子的流入神经元和触发动作电位14,15。然后将动作电位传播到突触终端,其中,突触小泡融合毫秒16,17内,18因此,通道视紫红诱导神经元活性。跟随在突触末端膜动力学,神经元必须在限定的时间点与MS精度刺激后固定。
为了诱导神经元活性后捕获膜动力学,我们耦合光刺激用高压冷冻17,18,19。高压冷冻允许具有降低的冰晶形成20个细胞的近瞬时固定。冰晶CAÑ破裂膜和破坏的亚细胞结构21。通过改变刺激和冷冻之间的时间间隔,突触末端内的膜运输被捕获的动作电位的感应以下。
在这里,我们证明了用商业化的高压冷冻,夫妻光刺激的高压冻结一毫秒的时间控制实验程序。与需要的外部设备来控制光刺激和冷冻其它仪器,光刺激完全集成在该系统中,并且可以与毫秒精度19来施加。这个过程涉及多个步骤。 1)小鼠海马神经元是在蓝宝石上的磁盘培养并慢病毒感染携带表达载体紫红质通道18。 2)神经元刺激和刺激后在确定的时间点冷冻。 3)玻璃化水替代通过固定剂20d与有机溶剂,而脂质和蛋白质是交联的以保持细胞内结构。 4)将样品渗透并包埋在环氧树脂中。 5)超薄切片使用超微切片收集。 6)薄切片进行成像上的透射型电子显微镜。 7)图像采集和分析相对于时间点或基因型盲目地进行的。细胞动力学可以通过时间分辨的图像17,18的重建来确定。样品制备(步骤2 – 5以上)需要一个星期,但随后的图像分析需要半年到一年。
“闪蒸和冻结”的方法通过诱导与光遗传学特定细胞事件,并通过刺激19后冻结确定的时间点的细胞可视化膜动力学。在此演示中,我们使用通道视紫红,光敏阳离子通道,刺激神经元和捕获在突触末端融合和突触小泡的回收。近年来,许多光遗传学工具已经开发22,23,所有这些都与闪存和冻结兼容。例如,细胞器贩卖可使用隐和CIB1 24的光诱导的异二聚化来诱导。类似地,质膜的脂质组合物可以通过磷酸肌醇磷酸酶的光诱导易位到质膜25来改变。此外,像偶氮苯CH小,光敏感的化合物安格构象取决于照明波长。这种构象变化可以被用来激活配体门控通道或改变脂质组合物在膜26,27。笼化合物也可用于诱导细胞活性。然而,在目前的安装中使用的LED可能不产生用于解笼锁足够的能量;因此,该系统的进一步优化是可能必要的。然而,这些光可激活工具的应用是灵活的,很多细胞事件可以由闪光引起。 “闪存和冻结”可以捕获产生的膜动力学。
有以“闪存和冻结”法两个主要局限。首先,它捕获来自不同小区的特定事件的“快照”。换句话说,它是不可能在一段时间跟随膜动力学在一个小区中。因此,对于任何蜂窝的重建,即使吨,必须获得和分析大量的来自每个样品和在每个时间点的图像。此外,在神经元中,图像的更大的数目是必要的,因为突触小泡的融合只需要地点20 -突触的30%小鼠海马神经元18,28。如此大的数据集的分析需要时间的巨大数额。在未来,图像采集和分析需要实现自动化,使办法更有效29,30。
第二个限制是由高压冷冻技术的性质强加的。当细胞冷冻,细胞水重排形成冰晶如果冷冻速率是低于100 K / S 21。这些冰晶可以渗透膜或浓缩溶质,以改变局部的渗透压,从而导致膜的破裂。为了避免冰晶,HIGh压力(〜2000大气压)施加到标本。由于过冷却效果,100 K / s的冷冻速率是足够的,以防止水从在此压力下21形成冰晶。从理论上讲,如500微米可以在没有冰晶被冻结,但大约为200μm是容易的实际限制,因为冰的立方形形式倾向于形成在厚组织,从而损害形态标本一样厚。当处理标本厚于5μm,则使用适当的冷冻保护的,如BSA,是必要的。然而,BSA将改变溶液的渗透压,并可能影响细胞的生理响应。因此,需要大量的对照实验来验证尤其系统中使用的BSA。冰晶也可以高压冷冻后,如果标本无意中从液氮浴中取出形成。因此,关键是要在保持液氮将样品在任何时候,使用预冷却镊子操作它们。
在规划的实验,以下三点应予以考虑。首先,光的最大强度(在460nm的线)是5.5 – 8.0毫瓦/毫米2。是否该强度足以诱导活动都必须与上之前闪存和冷冻实验的荧光显微镜的活细胞成像进行验证。其次,实验必须在生理温度下进行。高压冷冻机的阶段升温至37℃与小鼠海马神经元31中的实验。最后,时间点必须仔细选择捕捉膜动力学。初步研究表明,细胞内吞作用是后100毫秒刺激的完整。因此,三个附加的时间点(15,30,和50毫秒)还进行了检查以跟随膜动力学17,18。这些时间点是必要的,可视化的膜贩运事件突触传递期间秒。然而,对于时间点的数目的要求在每个细胞事件不同。因此,有几个时间点应该启动大数据集收集之前进行采样。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由来自约翰霍普金斯大学(SW)的资金支持。我们感谢医学显微镜基金的约翰霍普金斯大学为他们提供技术支持。我们感谢埃里克·乔琴森和克里斯蒂安·罗斯蒙及其实验室成员,该技术的发展。我们感谢M.韦恩·戴维斯初始设备的设计。我们感谢保罗·齐杰,克韦塔·托莫瓦和Delgermaa Luvsanjav为他们提供技术援助。我们也感谢纳塔利·R·哈密尔顿和格兰特·F·库西克对稿件他们的批判性阅读。
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
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Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |