Nous avons développé une nouvelle technique en microscopie électronique, « flash et gel » qui permet la visualisation de la dynamique de la membrane avec ms résolution temporelle. Cette technique combine la stimulation optogenetic des neurones avec le gel à haute pression. Ici, nous démontrons les procédures et décrire les protocoles en détail.
Les cellules changent constamment leur architecture de la membrane et la distribution des protéines, mais il est extrêmement difficile de visualiser ces événements à une résolution spatiale et temporelle de l'ordre de ms et nm, respectivement. Nous avons mis au point une technique de microscopie électronique à résolution temporelle, « flash et gel, » qui induit des événements cellulaires avec optogénétique et la dynamique de visualiser membrane résultante par congélation des cellules à des moments définis après stimulation. Pour démontrer cette technique, nous avons exprimé channelrhodopsin, un canal de cation sensible à la lumière, dans les neurones hippocampiques de souris. Un flash de lumière stimule l'activité neuronale et induit la libération de neurotransmetteurs à partir de terminaux synaptiques par la fusion des vésicules synaptiques. La stimulation des neurones optogenetic est couplée à la congélation à haute pression de suivre les changements morphologiques au cours de la transmission synaptique. L'utilisation d'un instrument commercial, nous avons capturé la fusion des vésicules synaptiques et la récupération du Synamembrane vésiculaire CITP. Pour visualiser la séquence des événements, grands ensembles de données ont été obtenues et analysées à l'aveuglette, car les changements morphologiques ont été suivies dans différentes cellules au fil du temps. , Flash et gel permet néanmoins la visualisation de la dynamique de la membrane en micrographies électroniques avec ms résolution temporelle.
membrane visualisant et la dynamique des protéines dans une cellule est une étape clé pour la compréhension de la biologie cellulaire des processus particuliers. les événements de trafic dynamiques peuvent être capturés en utilisant la microscopie optique ou la fluorescence. Cependant, le contexte subcellulaire manque en grande partie dans ces images parce que les structures sous – cellulaires ne peuvent pas être complètement « peint » par des colorants ou des sondes fluorescentes et résolus dans l' espace et spectralement 1, 2. D'autre part, alors que la microscopie électronique peut définir l'architecture subcellulaire en détail exquis, il ne peut pas saisir la dynamique cellulaire, parce que les échantillons doivent être fixés avant l'imagerie. Ainsi, il est généralement pas suffisante pour comprendre complètement la dynamique cellulaire en utilisant une seule modalité d'imagerie.
Pour surmonter les limites de la microscopie optique et électronique, les techniques de microscopie corrélatifs ont été mis au point. Corrélative Lumière et Microscopie électronique(Clem) visualise la dynamique intracellulaire à l'aide de la microscopie optique et des structures sous-cellulaires sous-jacents à la microscopie électronique. Dans CLEM, les cellules engagées dans divers processus, tels que la cytocinèse et l' endocytose 3, 4, 5, 6, sont sous tension imagée et ensuite traitées pour la microscopie électronique. Bien que CLEM capture certains aspects de la dynamique intracellulaire, il y a quatre facteurs qui limitent l'utilité de cette approche. Tout d' abord, la résolution temporelle est limitée par la vitesse à laquelle les cellules peuvent être immobilisées, ce qui prend typiquement s – min en raison de la lente diffusion et la réaction de fixateurs 7. En second lieu , l'architecture est subcellulaire post facto 8 observé; ainsi, les changements morphologiques dynamiques ne peuvent pas être capturées à l'aide de cette approche. Troisièmement, ne peuvent pas être alignés avec précision les micrographies de fluorescence et électronique en raison de tissus shrinkage provoquée par la déshydratation au cours de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique 9, 10. En quatrième lieu , des événements comme la cytocinèse et endocytose ne se produisent pas en même temps dans toutes les cellules 5, 11, et donc, une cellule particulière qui est engagée dans l'événement doivent être identifiés à partir d' une grande population de cellules. Ce processus est souvent laborieux. Ainsi, une nouvelle méthode est nécessaire pour induire des événements particuliers dans toutes les cellules et pour capturer la dynamique cellulaire résultant de l'immobilisation rapide des cellules à des moments définis.
Récemment, plusieurs outils ont été développés pour induire la dynamique cellulaire particulier en utilisant la lumière (optogénétique). Channelrhodopsin est un canal cationique sensible à la lumière, non sélective isolé à partir de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Lorsque channelrhodopsin est exprimé en Neuronamembranes l, un bref éclair de lumière induit un influx d'ions sodium dans les neurones et déclenche un potentiel d' action 14, 15. Le potentiel d'action se propage ensuite dans les terminaisons synaptiques, où les vésicules synaptiques fusionnent en quelques millisecondes 16, 17, 18 Par conséquent, channelrhodopsin induit l' activité neuronale. Pour suivre la dynamique des membranes au niveau des bornes synaptiques, les neurones doivent être immobilisés à des moments définis après stimulation avec ms précision.
Pour capturer la dynamique de la membrane après l' induction de l' activité neuronale, nous avons couplé une stimulation lumineuse à haute pression de congélation 17, 18, 19. Congélation à haute pression permet l'immobilisation quasi-instantanée des cellules avec formation de cristaux de glace 20 réduite. Des cristaux de glace can rupture des membranes et de perturber l'architecture subcellulaire 21. En faisant varier les intervalles de temps entre la stimulation et le gel, le trafic de membrane à l'intérieur des terminaux synaptiques a été capturé suite à l'induction d'un potentiel d'action.
Ici, nous démontrons les procédures expérimentales en utilisant un congélateur à haute pression commercialisé que les couples un ms de contrôle temporel de stimulation lumineuse avec le gel à haute pression. Contrairement à d' autres instruments qui nécessitent un dispositif externe pour contrôler la stimulation et verglaçante, la stimulation lumineuse est entièrement intégrée dans ce système et peut être appliqué avec précision ms 19. Ce processus implique plusieurs étapes. 1) des neurones de l' hippocampe de souris sont mises en culture sur des disques de saphir et infectés par le lentivirus portant un vecteur d'expression pour channelrhodopsin 18. 2) Neurones sont stimulés et congelés à des moments définis après stimulation. 3) L'eau est vitrifié substitutd avec un solvant organique, tandis que les lipides et les protéines sont réticulées par des fixateurs de préserver l'architecture intracellulaire. 4) Les échantillons sont infiltrés et enrobés dans une résine époxy. 5) Des coupes ultrafines sont recueillies à l'aide d'un ultramicrotome. 6) Des coupes minces sont imagés sur un microscope électronique à transmission. 7) l'acquisition et analyse d'images sont réalisées en aveugle par rapport à des points de temps ou génotypes. Dynamique cellulaire peut être déterminée par la reconstruction des images à résolution temporelle 17, 18. Préparation de l'échantillon (étapes 2 – 5 ci-dessus) nécessite une semaine, mais l'analyse de l'image suivante nécessite mois à un an.
L'approche « flash et gel » dynamique de la membrane permet de visualiser en induisant un événement cellulaire particulier avec optogénétique et par congélation des cellules à des moments définis après stimulation 19. Dans cette démonstration, nous avons utilisé channelrhodopsin, un canal cationique sensible à la lumière, pour stimuler les neurones et captura la fusion et la récupération des vésicules synaptiques aux bornes synaptiques. Ces dernières années, de nombreux outils ont été développés optogénétiques 22, 23, qui sont tous compatibles avec le flash et le gel. Par exemple, le trafic de organite peut être induite en utilisant hétérodimérisation induite par la lumière de cryptochrome et CIB1 24. De même, la composition lipidique de la membrane plasmatique peut être altérée par la translocation induite par la lumière du phosphoinositide phosphatases à la membrane de plasma 25. En outre, de petits composés sensibles à la lumière tels que azobenzène chconformation ange en fonction des longueurs d'onde d'illumination. Ce changement de conformation peut être utilisé pour activer les canaux ligand-dépendants ou pour modifier la composition lipidique de la membrane 26, 27. les composés peuvent également être mis en cage utilisés pour induire une activité cellulaire. Cependant, la LED utilisée dans la configuration actuelle ne peut pas produire suffisamment d'énergie pour uncaging; ainsi, d'autres optimisations du système sont probablement nécessaires. Néanmoins, les applications de ces outils de lumière activables sont des événements cellulaires-plusieurs flexibles peuvent être induites par un éclair de lumière. « Flash et gel » peuvent saisir la dynamique de la membrane résultant.
Il y a deux principales limites à la méthode « flash et gel ». Tout d'abord, il capture des « instantanés » d'un événement particulier de cellules différentes. En d'autres termes, il est impossible de suivre la dynamique de la membrane dans une cellule sur une période de temps. Ainsi, pour la reconstruction d'un même cellulairet, il faut acquérir et analyser un grand nombre d'images de chaque échantillon et à chaque point de temps. De plus, dans les neurones, est nécessaire, un nombre encore plus d'images depuis la fusion des vésicules synaptiques ne prend place dans 20 – 30% des synapses dans les neurones hippocampiques de souris 18, 28. L'analyse d'un tel grand ensemble de données nécessite d'énormes quantités de temps. À l'avenir, l' acquisition et l' analyse d' image doivent être automatisée pour rendre l'approche plus efficace 29, 30.
La deuxième limite est imposée par la nature de la technique de congélation à haute pression. Lorsque le gel cellules, réarrange l' eau cellulaire pour former des cristaux de glace , si la vitesse de congélation est inférieure à 100 K / s 21. Ces cristaux de glace peuvent pénétrer les membranes ou concentrer des solutés pour modifier la pression osmotique locale, ce qui entraîne la rupture des membranes. Pour éviter des cristaux de glace, HIGh Pression (~ 2.000 atm) est appliquée aux échantillons. En raison de l'effet de super-refroidissement, une vitesse de congélation de 100 K / s est suffisante pour empêcher l' eau de se former des cristaux de glace à cette pression 21. En théorie, les échantillons plus épais que 500 um peuvent être congelés sans cristaux de glace, mais environ 200 um est probablement la limite pratique, comme des formes cubiques de glace ont tendance à se former dans les tissus épais, ce qui compromet la morphologie. Lorsque le traitement des échantillons plus épais que 5 um, l'utilisation d'un cryo-protecteur approprié, tel que BSA, est nécessaire. Cependant, la BSA va changer l'osmolarité de la solution et peut affecter la réponse physiologique des cellules. Par conséquent, les expériences de contrôle approfondies sont nécessaires pour valider l'utilisation de BSA dans des systèmes particuliers. Les cristaux de glace peuvent se former après congélation à haute pression si les échantillons sont accidentellement enlevés du bain d'azote liquide. Ainsi, il est essentiel de garder les échantillons dans l'azote liquide à tout moment et d'utiliser des pinces préréfrigérés àles manipuler.
Lors de la planification des expériences, les trois points suivants doivent être pris en considération. Tout d' abord, l'intensité maximale de la lumière (la ligne 460 nm) est de 5,5 à 8,0 mW / mm 2. Que cette intensité est suffisante pour induire l'activité doit être vérifiée avec l'imagerie de cellules vivantes sur un microscope à fluorescence avant les expériences flash et regel. D'autre part, les expériences doivent être effectuées à la température physiologique. L'étape de la congélation à haute pression est réchauffé à 37 ° C pour les expériences avec les neurones de l' hippocampe de souris 31. Enfin, les points de temps doivent être choisis avec soin de saisir la dynamique de la membrane. Les premières études ont indiqué que l'endocytose est complète après 100 ms de stimulation. Ainsi, trois points de temps supplémentaires (15, 30, et 50 ms) ont également été examinés pour suivre la dynamique de la membrane 17, 18. Ces points de temps ont été nécessaires pour visualiser l'événement de trafic membranaires lors de la transmission synaptique. Cependant, l'exigence du nombre de points de temps sont différents dans chaque événement cellulaire. Par conséquent, quelques points de temps doivent être échantillonnés avant de lancer grande collection de données.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le financement de l'Université Johns Hopkins (SW). Nous remercions l'école Johns Hopkins School of Medicine Facility Microscope pour leur soutien technique. Nous remercions Erik Jorgensen et Christian Rosenmund et les membres de leurs laboratoires pour le développement de la technique. Nous remercions M. Wayne Davis pour la conception du dispositif initial. Nous remercions Paul Wurzinger, Cveta Tomova, et Delgermaa Luvsanjav pour leur assistance technique. Nous remercions également Natalie R. Hamilton et Grant F. Kusick pour leur lecture critique du manuscrit.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |