Wir entwickeln eine neue Technik in der Elektronenmikroskopie, „flash-and-freeze“, die die Visualisierung von Membrandynamik mit ms zeitlicher Auflösung ermöglicht. Diese Technik kombiniert die optogenetische Stimulation von Neuronen, die mit Hochdruck-Einfrieren. Hier haben wir die Verfahren zeigen, und die Protokolle im Detail beschreiben.
Zellen ständig ihre Membranarchitektur und Proteinverteilung ändern, aber es ist extrem schwierig, diese Ereignisse zu einer zeitlichen und räumlichen Auflösung in der Größenordnung von ms und nm sichtbar zu machen sind. Wir haben eine zeitaufgelöste Elektronenmikroskopie Technik entwickelt, „flash-and-freeze“, die die zelluläre Ereignisse mit Optogenetik induziert und visualisiert die resultierende Membrandynamik von Zellen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Stimulation Einfrieren. Um diese Technik zu demonstrieren, wir ausgedrückt Kanalrhodopsin, ein lichtempfindliches Kationenkanal, in Maus-Hippocampus-Neuronen. Ein Lichtblitz, stimuliert die neuronale Aktivität und induziert die Freisetzung von Neurotransmittern aus synaptischen Terminals durch die Fusion von synaptischen Vesikeln. Die optogenetische Stimulation von Neuronen gekoppelt ist, mit Hochdruck-Gefrieren zu morphologischen Veränderungen während der synaptischen Übertragung zu folgen. Mit einem kommerziellen Instrument erfasst wir die Fusion von synaptischen Vesikeln und die Erholung der synaptic Vesikelmembran. Um die Abfolge der Ereignisse zu visualisieren, wurden große Datensätze erzeugt und analysiert blind, da morphologische Veränderungen in verschiedenen Zellen im Laufe der Zeit folgten. Dennoch Blitz-und-freeze ermöglicht die Visualisierung von Membrandynamik in elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit ms zeitlicher Auflösung.
Visualizing Membran und Proteindynamik innerhalb einer Zelle ist ein wichtiger Schritt, um die Zellbiologie bestimmter Prozesse zum Verständnis. Dynamische Handel Ereignisse können unter Verwendung von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie erfasst. Fehlt jedoch wird der subzelluläre Kontext weitgehend in solchen Bildern , weil subzellulärer Strukturen nicht vollständig „gemalt“ durch Farbstoffe oder Fluoreszenzsonden und gelöst werden räumlich und spektral 1, 2 werden können. Auf der anderen Seite, während der Elektronenmikroskopie subzellulärer Architektur in kleinstem Detail beschreiben können, kann es nicht zelluläre Dynamik erfassen, weil Proben vor der Bildgebung fixiert werden müssen. So ist es in der Regel nicht ausreicht, um vollständig zelluläre Dynamik zu verstehen mit nur einer Bildgebungsmodalität.
Zur Überwindung der Grenzen von Licht- und Elektronenmikroskopie, korrelative Mikroskopie-Techniken entwickelt. Korrelat Licht- und Elektronenmikroskopie(Clem) visualisiert intrazellulärem Dynamik unter Verwendung von Lichtmikroskopie und die darunter liegende subzellulären Strukturen mit Elektronenmikroskopie. In Clem in verschiedenen Prozessen in Eingriff Zellen, wie Zytokinese und Endozytose 3, 4, 5, 6, sind Live-Bild versehen und dann für die Elektronenmikroskopie verarbeitet. Obwohl CLEM bestimmte Aspekte der intrazellulären Dynamik erfasst, gibt es vier Faktoren, die den Nutzen dieses Ansatzes begrenzen. Zuerst wird die zeitliche Auflösung begrenzt, wie schnell die Zellen immobilisiert werden, die typischerweise s dauert – min aufgrund der langsamen Diffusion und Reaktion von Fixiermitteln 7. Zweitens ist die subzelluläre Architektur beobachtet post facto 8; somit können die dynamischen morphologischen Veränderungen nicht mit diesem Ansatz erfaßt werden. Drittens können die Fluoreszenz und elektronenmikroskopische Aufnahmen nicht genau aufgrund von Geweben sh ausgerichtet werden,rinkage durch Dehydratation während der Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie 9, 10 hervorgerufen. Viertens Veranstaltungen wie Zytokinese und Endozytose finden nicht zugleich in jeder Zelle 5, 11, und somit eine bestimmte Zelle, die im Fall beschäftigt ist , muss von einer großen Population von Zellen identifiziert werden. Dieser Prozess ist oft mühsam. Somit ist ein neues Verfahren notwendig bestimmte Ereignisse in jeder Zelle zu induzieren und die daraus resultierende zellulären Dynamik durch die schnelle Immobilisierung von Zellen zu bestimmten Zeitpunkt zu erfassen.
In letzter Zeit wurden mehrere Werkzeuge entwickelt besondere zelluläre Dynamik zu induzieren mit Hilfe von Licht (Optogenetik). Kanalrhodopsin ist ein lichtempfindlicher, nicht-selektiver Kationenkanal , isoliert aus Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Wenn Kanalrhodopsin in Neurona ausgedrücktl – Membranen, ein kurzer Lichtblitz induziert einen Einstrom von Natriumionen in Neuronen und löst ein Aktionspotential 14, 15. Das Aktionspotential breitet sich dann in den synaptischen Terminals, in denen synaptische Vesikel fusionieren innerhalb von Millisekunden 16, 17, 18 daher Kanalrhodopsin neuronaler Aktivität induziert. Um Membrandynamik an synaptischen Klemmen zu folgen, müssen Neuronen zu definierten Zeitpunkten nach der Stimulation mit Präzision ms immobilisiert werden.
Um Membrandynamik nach Induktion neuronaler Aktivität zu erfassen, wir koppelten Licht Stimulation mit Hochdruckgefrier 17, 18, 19. Hochdruck – Gefrieren ermöglicht die nahezu sofortige Immobilisierung von Zellen mit reduzierter Eiskristallbildung 20. Eiskristalle can Berstfolien und stören die subzelluläre Architektur 21. Durch Variation der Zeitintervalle zwischen Stimulation und Gefrieren, Membrantransport innerhalb synaptischen Terminals wurde nach der Induktion eines Aktionspotentials erfasst.
Hier zeigen wir, experimentelle Verfahren unter Verwendung einer kommerziell Hochdruckgefriermaschine, die Paare, die eine ms zeitliche Steuerung der Licht Stimulation mit Hochdruck-Einfrieren. Im Gegensatz zu anderen Instrumenten , die ein externes Gerät erfordern Lichtstimulation und Gefrieren zu steuern, ist Lichtstimulation vollständig in diesem System integriert und kann mit 19 ms Genauigkeit angewandt werden. Dieser Prozess umfasst mehrere Schritte. 1) Maus – Hippocampus – Neuronen , kultiviert auf Saphirscheiben und Lentivirus infiziert mit einem Expressionsvektor für Kanalrhodopsin 18 trägt. 2) Neurons stimuliert und zu definierten Zeitpunkten nach der Stimulation eingefroren. 3) Das vitrifiziert Wasser Ersatzd mit einem organischen Lösungsmittel, während Lipide und Proteine werden durch Fixative vernetzt die intrazelluläre Architektur zu erhalten. 4) Die Proben werden infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. 5) Ultradünne Schnitte werden unter Verwendung eines Ultramikrotom gesammelt. 6) Dünne Schnitte werden auf einem Transmissionselektronenmikroskop abgebildet. 7) Bildaufnahme und Analyse blind in Bezug auf Zeitpunkt oder Genotypen durchgeführt. Zelluläre Dynamik kann durch die Rekonstruktion der zeitaufgelösten Bilder 17, 18 bestimmt werden. Probenvorbereitung (Schritte 2 bis 5 oben) eine Woche benötigt, aber die anschließende Bildanalyse erfordert Monate bis ein Jahr.
Der „Flash-and-freeze“ Ansatz visualisiert Membrandynamik durch ein bestimmtes Zellereignis mit Optogenetik induzieren und durch die Zellen zu bestimmten Zeitpunkt nach der Stimulation 19 einfriert. In dieser Demonstration verwenden wir Kanalrhodopsin, um einen lichtempfindlichen Kationenkanal, Neuronen zu stimulieren und erfasst die Fusion und Rückgewinnung von synaptischen Vesikeln an dem synaptischen Terminals. In den letzten Jahren haben viele optogenetische Werkzeuge wurden 22 entwickelt, 23, die alle mit kompatiblen Flash-und Kühltruhe. Zum Beispiel kann Organell Handel 24 unter Verwendung von durch Licht induzierte Heterodimerisierung von Crypto und CIB1 induziert werden. In ähnlicher Weise kann die Lipid – Zusammensetzung der Plasmamembran durch die lichtinduzierte Translokation von Phosphoinositid Phosphatasen zur Plasmamembran 25 verändert werden. Weiterhin kleine, lichtempfindliche Verbindungen wie Azobenzol change Konformation auf den Beleuchtungswellenlängen abhängig. Diese Konformationsänderung kann verwendet werden , Liganden-gesteuerte Kanäle zu aktivieren oder Lipidzusammensetzung in der Membran 26, 27 zu ändern. Caged Verbindungen können auch zu induzieren Zellaktivität verwendet werden. Jedoch kann die LED verwendet in der aktuellen Setup nicht ausreichend Energie für Uncaging erzeugen; somit weitere Optimierungen des Systems sind wahrscheinlich notwendig. Dennoch sind die Anwendungen dieser lichtaktivierbaren Werkzeuge flexiblen viele zelluläre Ereignisse, die von einem Lichtblitz induziert werden kann. „Flash-and freeze“ können die resultierenden Membrandynamik erfassen.
Es gibt zwei Haupt Einschränkungen für die „Flash-and-freeze“ -Verfahren. Erstens, es fängt „Schnappschüsse“ eines bestimmten Ereignisses aus verschiedenen Zellen. Mit anderen Worten ist es nicht möglich Membrandynamik in einer Zelle über einen Zeitraum von Zeit zu folgen. So wird für die Rekonstruktion eines zellulären selbstt, muss man eine große Anzahl von Bildern von jeder Probe und zu jedem Zeitpunkt erwerben und analysieren. Weiterhin in Neuronen, eine noch größere Anzahl von Bildern ist notwendig, da die Fusion von synaptischen Vesikeln nur Orte nimmt in 20 – 30% der Synapsen in Maus – Hippocampus – Neuronen 18, 28. Die Analyse einer solch großen Datenmenge erfordert enorme Mengen an Zeit. In Zukunft Bildaufnahme und Analyse müssen automatisiert werden der Ansatz effizienter 29, 30 zu machen.
Die zweite Einschränkung ist durch die Natur der Hochdruckgefriertechnik auferlegt. Wenn die Zellen einzufrieren, zelluläres Wasser lagert sich Eiskristalle zu bilden , wenn die Gefriergeschwindigkeit unter 100 K / s 21 ist. Diese Eiskristalle kann Membranen eindringen oder gelöste Stoffe konzentrieren lokalen osmotischen Druck zu verändern, was zu dem Bruch von Membranen. Zur Vermeidung von Eiskristallen, high Druck (~ 2,000 atm) wird an den Proben angewendet. Aufgrund des Unterkühlungs-Effekts ist eine Gefriergeschwindigkeit von 100 K / s ausreichend Wasser , um zu verhindern , 21 bei diesem Druck Eiskristalle bilden. Theoretisch Proben so dick wie 500 & mgr; m ohne Eiskristallen gefroren werden kann, aber etwa 200 & mgr; m ist wahrscheinlich die praktische Grenze, wie quader Formen von Eis neigen dazu, in dickem Gewebe zu bilden, zu beeinträchtigen Morphologie. Bei der Bearbeitung von Proben dicker als 5 um, ist die Verwendung eines geeigneten Cryo-Schutzmittel, wie beispielsweise BSA, notwendig. BSA wird die Osmolarität der Lösung ändert jedoch und kann die physiologische Reaktion von Zellen beeinflussen. Daher sind umfangreiche Kontrollexperimente erforderlich, um die Verwendung von BSA in bestimmten Systemen zu validieren. Eiskristalle kann auch nach dem Hochdruck Einfrieren bilden, wenn die Proben aus Versehen aus dem Bad aus flüssigen Stickstoff entfernt werden. Somit ist es wichtig, die Proben in dem flüssigen Stickstoff zu allen Zeiten zu halten, und vorgekühlte Zange zu verwenden, ummanipulieren sie.
Wenn Experimente planen, sollten die folgenden drei Punkte in Betracht gezogen werden. Zuerst wird die maximale Intensität des Lichts (die 460 nm – Linie) ist 5,5 bis 8,0 mW / mm 2. Ob diese Intensität ausreicht Aktivität zu induzieren muß mit Live-Cell-Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop vor dem Blitz-und-freeze Experimente überprüft werden. Zweitens müssen Experimente bei physiologischer Temperatur durchgeführt werden. Die Stufe der Hochdruck – Tiefkühltruhe ist , auf 37 ° C für die Experimente mit Maus – Hippocampus – Neuronen 31 erwärmt. Schließlich müssen die Zeitpunkte sorgfältig die Membrandynamik gewählt werden, zu erfassen. Erste Untersuchungen zeigten, dass die Endozytose nach 100 ms der Stimulation abgeschlossen ist. Somit werden drei zusätzliche Zeitpunkten (15, 30, und 50 ms) wurden auch die Membrandynamik 17 zu folgen , untersucht 18. Diese Zeitpunkte waren notwendig, Membrantransport Ereignis zu visualisierens während der synaptischen Übertragung. Allerdings sind die Voraussetzung für die Anzahl von Zeitpunkten unterschiedlich in jedem Zellereignis. Daher sollte ein paar Zeitpunkten vor große Daten-Set Sammlung initiiert werden abgetastet.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von der Johns Hopkins University (SW) unterstützt. Wir danken der Johns Hopkins School of Medicine Mikroskop Einrichtung für ihre technische Unterstützung. Wir danken Erik Jorgensen und Christian Rosenmund und die Mitglieder ihrer Labors für die Entwicklung der Technik. Wir danken M. Wayne Davis für die Gestaltung des ursprünglichen Geräts. Wir danken Paul Wurzinger, Cveta Tomova und Delgermaa Luvsanjav für ihre technische Hilfe. Wir danken auch Natalie R. Hamilton und Grant F. Kusick für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |