우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.
세포는 끊임없이 막 구조와 단백질의 분포를 변경할 수 있지만, 각각 MS와 나노 미터 정도의 시간적, 공간적 해상도에서 이러한 이벤트를 시각화하기가 매우 어렵다. 우리는 optogenetics와 세포 이벤트를 유도하고 자극 후 정의 된 시간 지점에서 세포를 동결 결과 막 역학을 시각화 시간이 해결 전자 현미경 기술, "플래시와 동결"을 개발했습니다. 이 기술을 보여주기 위해, 우리는 마우스 해마 신경 세포에서 channelrhodopsin, 빛에 민감한 양이온 채널을 표현했다. 빛의 플래시 신경 활성을 자극하여 시냅스 소포의 융합으로 시냅스 말단으로부터의 신경 전달 물질 방출을 유도한다. 신경의 자극은 optogenetic 시냅스 전달 동안 형태 학적 변화를 따라 고압 동결에 연결되어있다. 상용 장비를 사용하여, 우리는 시냅스 소포의 융합과 SYNA의 회복을 캡처PTIC 소포 막. 일련의 이벤트를 시각화하기 위해 큰 데이터 세트를 생성하고, 형태 변화가 시간이 지남에 따라 다른 셀들 되었기 때문에, 무턱대고 분석. 그럼에도 불구하고, 플래시 및 동결은 MS 시간적 해상도를 가진 전자 현미경 사진에서 막 역학의 시각화 할 수 있습니다.
세포 내 세포막 단백질 역학을 가시화하는 특정 프로세스의 세포 생물학을 이해 향해 중요한 단계이다. 동적 인신 매매 이벤트는 빛 또는 형광 현미경을 사용하여 캡처 할 수 있습니다. 세포 내 구조가 완전히 염료 또는 형광 물질로 "그린"과 공간 분해 및 스펙트럼 1,2 될 수 있기 때문에, 세포 내 환경은 주로 이러한 이미지에 누락. 전자 현미경은 정교한 세부에서 세포 내 구조를 묘사 할 수있는 동안 표본 이미징하기 전에 고정해야하기 때문에 다른 한편으로, 그것은 세포 역학를 캡처 할 수 없습니다. 따라서, 완전히 하나의 영상 기법을 이용하여 세포의 역학을 이해하기 일반적으로는 충분하지 않습니다.
빛과 전자 현미경의 한계를 극복하기 위해, 상호 현미경 기술이 개발되었다. 상호 빛과 전자 현미경(클레멘 타인)은 광학 현미경 및 전자 현미경으로 세포 내 기본 구조를 사용하여 세포 내 역학을 가시화. 클레멘 타인, 이러한 세포질과 엔도 시토 시스 3, 4, 5, 6 등의 각종 공정에 종사 세포 라이브 묘화 후 전자 현미경 처리된다. 클레멘 타인은 세포 내 역학의 특정 측면을 캡처하지만,이 방법의 유용성을 제한하는 네 가지 요소가있다. 분 때문에 느린 확산 고정 제 (7)의 반응 – 우선, 시간 해상도는 일반적으로 세포의 소요되며, 고정화하는 속도에 의해 제한된다. 둘째, 세포 내 구조가 관찰 후 사실상 8; 따라서, 동적 형태 변화는이 방법을 사용하여 캡처 될 수 없다. 셋째, 형광 현미경 및 전자 정확하게 조직 SH 때문에 정렬 될 수 없다의 전자 현미경 (9), (10)에 대한 샘플 준비하는 동안 탈수로 인한 rinkage. 넷째, 세포질 분열 및 세포 내 이입과 같은 이벤트는 모든 세포 5, 11에 동시에 발생하지 않으며, 따라서, 이벤트에 종사하는 특정 셀은 세포의 많은 인구에서 식별되어야합니다. 이 과정은 종종 힘든이다. 따라서, 새로운 방법은 모든 세포에서 특정 이벤트를 유도하고 정의 된 시간 지점에서 세포의 급속한 고정하여 그 결과 세포의 역 동성을 포착하는 것이 필요하다.
최근, 여러 도구 등 (optogenetics)를 사용하여 특정 세포 역학을 유도하기 위해 개발되었다. Channelrhodopsin 13, 12 인 Chlamydomonas reinhardtii에서 분리 감광성, 비 선택적 양이온 채널이다. channelrhodopsin은 뉴로 표현하면L 막은 광의 짧은 플래시 뉴런에 나트륨 이온의 유입을 유도 14 15 잠재적 액션을 트리거한다. 활동 전위는 시냅스 소포가 18 따라서 channelrhodopsin 신경 세포 활성을 유도하고, 16 밀리 초 (17) 내의 퓨즈 시냅스 말단으로 전파. 시냅스 터미널에서 막 역학을 수행하기 위해 뉴런은 MS의 정밀도로 자극 한 후 정의 된 시점에 고정해야합니다.
신경 세포 활성을 유도 한 후 막 역학을 캡처하기 위해 고압 17, 18, 19 냉동 빛 자극 결합. 고압 동결 감소 된 얼음 결정의 형성 (20)과 세포의 거의 순간적인 고정을 허용한다. 아이스 크리스탈 캘리포니아N 막을 파열 세포 내 구조 (21)를 방해. 자극 동결 사이의 시간 간격을 변화시킴으로써 시냅스 말단 내의 막 피킹은 활동 전위의 유도 다음 포획 하였다.
여기서, 우리는 커플 고압 동결 광 자극의 시간적 제어 단말 상용화 고압 냉동기를 이용하여 실험 절차를 보여준다. 광 자극 동결을 제어하는 외부 장치를 필요로하는 다른 기기와는 달리, 광 자극은 충분히이 시스템에 통합되고, MS 정밀도 (19)에 적용될 수있다. 이 과정은 여러 단계를 포함한다. 1) 마우스 해마 뉴런 사파이어 디스크 배양 및 렌티 바이러스가 channelrhodopsin 18 발현 벡터를 운반 감염이다. 2) 뉴런은 자극과 자극 후 정의 된 시간 지점에서 동결된다. 3) 유리화 물 대용품유기 용제 (D), 지질 및 단백질 동안 세포 내 구조를 유지하기 위해 고정 제에 의해 돌파 연계. 4) 샘플을 함침 및 에폭시 수지에 포함된다. 5) 매우 얇은 부분은을 Ultramicrotome을 사용하여 수집된다. 6) 얇은 절편을 투과형 전자 현미경 상에 결상된다. 7) 화상 획득 및 분석 시점 또는 유전자형에 대하여 맹목적 행한다. 셀룰러 역학 시분 이미지 (17), (18)의 재구성을 통해 결정될 수있다. 일주일이 필요하지만, 이후의 이미지 분석은 년 개월을 필요로 – 샘플 준비 (위 5 2 단계를).
은 "플래시 및 동결"접근법 optogenetics와 특정 세포 사건을 유도함으로써 자극 후 19 정의 된 시점에서 세포를 동결 막 역학을 가시화한다. 이 예제에서, 우리는 신경을 자극하는 channelrhodopsin, 감광성 양이온 채널을 사용하여 시냅스 말단에서 융합과 시냅스 소포의 복구를 캡처. 최근 몇 년 동안, 많은 optogenetic 도구는 플래시와 동결와 호환 모두 22, 23, 개발되었다. 예를 들어, 세포 소기관 피킹은 cryptochrome 및 CIB1 (24)의 광 – 유도 heterodimerization을 사용하여 유도 될 수있다. 유사하게, 세포막의 지질 성분이 세포막 25 포스 포스파타제의 광 – 유도 된 전위에 의해 변경 될 수있다. 또한, 아조벤젠 CH 같은 작은 감광성 화합물조명 파장에 따라 플랜지 형태. 이러한 형태 변화는 리간드 – 게이트 채널을 활성화 시키거나 막 26, 27, 지질 조성물을 변경하는데 사용될 수있다. 리테이너 화합물은 세포 활성을 유도하는 데 사용될 수있다. 그러나, 현재의 설정에 사용되는 LED는 uncaging위한 충분한 에너지를 얻지 못할 수; 따라서, 시스템의 추가 최적화가 필요한 것. 그럼에도 불구하고,이 빛 기동 도구의 응용 프로그램은 유연한 많은 세포 이벤트가 빛의 플래시에 의해 유도 될 수있다. "플래시와 동결은"결과 막 역학을 캡처 할 수 있습니다.
은 "플래시와 동결"방법 두 가지 제한이 있습니다. 첫째, 다른 세포에서 특정 이벤트의 "스냅 샷"을 캡처합니다. 즉, 일정 기간 동안 하나 개의 셀에 막 역학을 수행 할 수 없다. 따라서, 어떤 세포의 재건도t는 1 구하여 각 시료의 각 시점에서 다수의 이미지를 분석한다. 마우스 해마 뉴런 18, 28 시냅스의 30 % – 시냅스 소포가 융합 20에 대한 걸리므 또한, 뉴런, 화상의 더 큰 수가 필요하다. 이러한 큰 데이터 세트의 분석은 시간의 엄청난 양을 필요로한다. 향후, 이미지 수집 및 분석 (29), (30) 접근 방식이보다 효율적으로 자동화 할 필요가있다.
두 번째 제한은 고압 냉동 기술의 특성에 의해 부과된다. 세포를 동결하면 물이 세포 동결 속도가 100 K / s 미만이면 21 얼음 결정을 형성하도록 재 배열한다. 이 얼음 결정이 세포막을 통과 또는 막의 파열 결과 로컬 삼투압을 변경하는 용질을 집중할 수있다. 얼음 결정을 방지하기 위해, HIGH 압 (~ 2000 기압) 시험편에 적용된다. 인해 과냉각 효과, 100 K / s의 속도 차는 압력이 (21)에 얼음 결정이 형성되는 물을 방지하기에 충분하다. 이론적으로 500 μm의 얼음 결정을하지 않고 고정 할 수 있지만, 얼음 입방 형태 두꺼운 조직으로 형성하는 경향이 약 200 μm의 형태를 손상시키는 가능성이 실제 한계만큼 두꺼운 표본. 처리는보다 두꺼운 5 μm의 표본 때 이러한 BSA 등의 적절한 크라이 보호제의 사용이 필요하다. 그러나, BSA는 용액의 삼투압을 변경하고 세포의 생리적 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 광범위한 제어 실험은 특정 시스템 BSA의 사용을 확인해야한다. 시험편 실수 액체 질소 욕조에서 제거되면 얼음 결정은 고압 동결 후 형성 할 수있다. 따라서, 항상, 액체 질소에서 시료를 유지하고 미리 냉각에 겸자를 사용하는 것이 중요를 조작 할 수 있습니다.
실험을 계획 할 때 다음과 같은 세 가지 점을 고려해야한다. 8.0 mW의 / mm 2 – 먼저, 광의 최대 강도 (460 nm의 라인)은 5.5이다. 이 강도가 활동을 유도하기에 충분 여부 플래시 및 동결 실험 이전에 형광 현미경 라이브 셀 이미징 확인해야합니다. 둘째, 실험은 생리적 온도에서 수행해야합니다. 고압 냉동실 스테이지 마우스 해마 뉴런 31 실험을 37 ℃로 가온된다. 마지막으로, 시점은 신중하게 막 역 동성을 포착하기 위해 선택해야합니다. 초기 연구는 세포 내 이입이 자극의 100 밀리 후 완료 것으로 나타났다. 따라서, 세 개의 추가 시점 (15, 30, 50 밀리 초)도 막 역학 (17) (18)을 따라 조사 하였다. 이 시점은 막 인신 매매 이벤트를 시각화 할 필요가 있었다시냅스 전달시의. 그러나 시점의 수에 대한 요구 사항은 각 세포의 경우에 다릅니다. 따라서, 몇 시간 포인트는 대형 데이터 세트 수집을 시작하기 전에 채취해야한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 존스 홉킨스 대학 (SW)에서 자금을 지원했다. 우리는 그들의 기술 지원 의료 현미경 시설의 존스 홉킨스 대학 감사합니다. 우리는 기술의 발전을 위해 에릭 요르겐센 기독교 Rosenmund과 실험실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 초기 장치의 설계에 M. 웨인 데이비스합니다. 우리는 그들의 기술 지원을 폴 워징거, 크베타 토모바 및 Delgermaa Luvsanjav 감사합니다. 우리는 또한 원고의 비판적 읽기 나탈리 R. 해밀턴 그랜트 F. Kusick 감사합니다.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |