Vi har utviklet en ny metode i elektronmikroskopi, "flash-og-fryse", som muliggjør visualisering av membran dynamikk med ms tidsoppløsning. Denne teknikken kombinerer optogenetic stimulering av neuroner med høyt trykk frysing. Her viser vi prosedyrene og beskrive protokoller i detalj.
Celler stadig endre sin membran arkitektur og protein fordeling, men det er ytterst vanskelig å visualisere disse hendelsene ved et tidsmessig og romlig oppløsning i størrelsesorden ms og nm, respektivt. Vi har utviklet en tidsoppløst elektronmikroskopi teknikk, "flash-og-fryse", som induserer cellulære hendelser med optogenetics og visualiserer de resulterende membran dynamikken ved frysing av celler ved definerte tidspunkter etter stimulering. For å demonstrere denne teknikken, uttrykte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kation kanal, i mus hippocampus-neuroner. En lysglimt stimulerer neuronal aktivitet og induserer nevrotransmitter-frigjøring fra synaptiske terminaler via fusjon av synaptiske vesikler. Den optogenetic stimulering av neuroner er kombinert med høyt trykk frysing for å følge morfologiske endringer i løpet av synaptisk transmisjon. Ved hjelp av en kommersiell instrument, fanget vi fusjon av synaptiske vesikler og utvinning av synaptic vesikkelmembranen. For å visualisere den sekvens av hendelser, ble store datasett generert og analysert blindt, ettersom morfologiske endringer ble fulgt i forskjellige celler over tid. Ikke desto mindre gjør det mulig for flash-og-fryse visualisering av membran dynamikk i elektronmikrofotografier med ms tidsoppløsning.
Visualisering membran og protein dynamikk innenfor en celle er et viktig skritt i retning av å forstå cellebiologi av bestemte prosesser. hendelser dynamisk menneskehandel kan fanges ved hjelp av lys eller fluorescens mikroskopi. Imidlertid er det subcellulære sammenheng er stort sett fraværende i slike bilder fordi subcellulære strukturer kan ikke fullstendig "malt" av fargestoffer eller fluorescerende prober og løst romlig og spektralt 1, 2. På den annen side, mens elektronmikroskopi kan avgrense subcellulære arkitektur i utsøkt detalj, det kan ikke fange cellulære dynamikk, fordi prøvestykker må festes før avbildning. Således er det vanligvis ikke er tilstrekkelig til fullstendig å forstå cellulære dynamikk ved hjelp av bare ett avbildingsmodalitet.
For å overvinne begrensninger av lys- og elektronmikroskopi, har korrelative mikroskopi-teknikker blitt utviklet. Samsvar Lys og elektronmikroskopi(CLEM) visualiserer intracellulære dynamikk ved hjelp av lysmikroskopi og underliggende subcellulære strukturer med elektronmikroskopi. I CLEM, celler engasjert i ulike prosesser, slik som cytokinese og endocytose 3, 4, 5, 6, er aktive vendt og deretter bearbeidet for elektronmikroskopi. Selv CLEM fanger visse aspekter av intracellulære dynamikk, er det fire faktorer som begrenser nytten av denne fremgangsmåte. Først blir den tidsmessige bestemte oppløsningen er begrenset av hvor hurtig cellene kan immobiliseres, noe som vanligvis tar s – minst på grunn av den langsomme diffusjon og reaksjon av fiksativer 7. For det andre er den subcellulære arkitektur observeres etter facto 8; dermed kan de dynamiske morfologiske endringer ikke fanges opp med denne tilnærmingen. For det tredje, fluorescens og elektronmikroskopibilder kan ikke innrettes nøyaktig på grunn av vev shrinkage forårsaket av dehydrering under prøvepreparering for elektronmikroskopi 9, 10. Fjerde, gjør hendelser som cytokinese og endocytose ikke finne sted på samme tid i hver celle 5, 11, og dermed må en bestemt celle som er engasjert i tilfelle bli identifisert fra en stor populasjon av celler. Denne prosessen er ofte arbeidskrevende. Således er en ny metode er nødvendig for å fremkalle bestemte hendelser i hver celle og for å fange opp de resulterende cellulære dynamikk ved hurtig immobilisering av celler ved definerte tidspunkter.
Nylig har flere verktøy er utviklet for å indusere bestemte cellulære dynamikk ved hjelp av lys (optogenetics). Channelrhodopsin er en lys-sensitive, ikke-selektivt kation kanal isolert fra Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Når channelrhodopsin er uttrykt i neuronal membraner, en kort lysglimt induserer en strøm av natriumioner til neuroner og utløser et aksjonspotensial 14, 15. Aksjonspotensialet deretter forplanter seg inn i de synaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikler som fusjonerer løpet av millisekunder 16, 17, 18. Derfor induserer channelrhodopsin neuronal aktivitet. For å følge membrandynamikk ved synaptiske terminaler, må neuroner være immobilisert ved definerte tidspunkter etter stimulering med ms presisjon.
For å fange membran dynamikk etter fremkallelse neuronal aktivitet, kombinert vi lys stimulering med høyt trykk iskaldt 17, 18, 19. Høytrykks frysing gjør det mulig for den nesten øyeblikkelige immobilisering av celler med redusert iskrystalldannelse 20. Iskrystaller can brudd membraner og forstyrre subcellulær arkitekturen 21. Ved å variere tidsintervallene mellom stimulering og frysing, ble membranen handel innen synaptiske terminaler fanget som følge av induksjon av et aksjonspotensial.
Her viser vi eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av en kommersialisert høytrykksfryseren som kobler en ms tidsmessig styring av lys stimulering med høytrykks frysing. I motsetning til andre instrumenter som krever en ekstern enhet til å styre lys stimulering og frysing, blir lys stimulering fullt integrert i dette systemet, og kan brukes med ms presisjon 19. Denne prosessen involverer flere trinn. 1) Mus hippocampus-neuroner dyrket på safir disker og infisert med lentivirus bærer en ekspresjonsvektor for channelrhodopsin 18. 2) Neurons stimuleres og frosset ved definerte tidspunkter etter stimulering. 3) Det forglassede vann er erstatningd med et organisk oppløsningsmiddel, mens lipider og proteiner er fornettet med fikseringsmidler for å bevare den intracellulære arkitekturen. 4) Prøvene infiltrert og innstøpt i epoksyharpiks. 5) ultratynne snitt ble oppsamlet ved hjelp av en ultramikrotom. 6) Tynne snitt blir avbildet på et transmisjonselektronmikroskop. 7) Bilde innsamling og analyse utføres blindt med hensyn på tidspunkter eller genotyper. Cellular dynamikk kan bestemmes ved rekonstruksjon av tidsoppløst bilder 17, 18. Prøveopparbeidelse (trinn 2-5 ovenfor) krever en uke, men den påfølgende bildeanalyse krever måneder til et år.
Den "flash-og-frost" tilnærming visualiserer membrandynamikk ved å indusere en spesiell cellulær hendelse med optogenetics og ved frysing av cellene ved definerte tidspunkter etter stimulering 19. I denne demonstrasjonen brukte vi channelrhodopsin, en lysfølsom kation kanal, for å stimulere nerveceller og fanget fusjon og gjenvinning av synaptiske vesikler ved den synaptiske terminaler. I de senere år har mange optogenetic verktøy utviklet 22, 23, som alle er kompatible med flash-og-fryse. For eksempel kan organelle trafikk induseres ved hjelp av lys-indusert heterodimerisering av cryptochrome og CIB1 24. På samme måte kan lipidsammensetningen av plasmamembranen bli endret av lys-indusert translokasjon av fosfoinositid-fosfataser til plasmamembranen 25. Videre er små, lysfølsomme forbindelser som azobenzen change konformasjon avhengig av belysningsbølgelengder. Denne konformasjonsendring kan brukes til å aktivere ligandstyrte kanaler eller for å endre lipidsammensetningen i membranen 26, 27. Bur forbindelser kan også anvendes til å indusere cellulær aktivitet. Imidlertid kan LED brukes i dagens oppsett ikke produsere nok energi til uncaging; således ytterligere optimaliseringer av systemet er sannsynligvis nødvendig. Ikke desto mindre er anvendelser av disse lys-aktiverbare verktøy er fleksible-mange cellulære hendelser, kan induseres ved et lysglimt. "Flash-og-frost" kan fange opp de resulterende membran dynamikk.
Det er to hoved begrensninger i "flash-og-fryse" -metoden. Først fanger det "snapshots" av en bestemt hendelse fra forskjellige celler. Med andre ord, er det ikke mulig å følge membran dynamikk i en celle i løpet av en tidsperiode. Derfor, for gjenoppbyggingen av enhver cellulær selvt, må man skaffe og analysere et stort antall bilder fra hver prøve, og ved hvert tidspunkt. Videre er det i nerveceller, er et enda større antall bilder er nødvendig, fordi sammensmeltingen av synaptiske vesikler bare foregår i 20 – 30% av synapsen i mus hippocampalneuroner 18, 28. Analysen av et slikt stort datasett krever enorme mengder av gangen. I fremtiden bilde innsamling og analyse må bli automatisert for å gjøre den mer effektiv tilnærming 29, 30.
Den annen begrensning er satt med arten av høytrykksfryseteknikk. Når celler fryse, omleires cellulær vann for å danne iskrystaller hvis frysehastighet er lavere enn 100 K / s 21. Disse iskrystaller kan trenge gjennom membraner eller konsentrere oppløsninger for å endre lokal osmotisk trykk, noe som resulterer i brudd av membranene. For å unngå iskrystaller, high trykk (~ 2000 atmosfærer) påføres på prøvene. På grunn av den superkjølende effekt, er tilstrekkelig til å hindre vann fra å danne iskrystaller ved dette trykk 21 en frysehastighet på 100 K / sek. I teorien prøver som så tykt som 500 mikrometer kan fryses uten iskrystaller, men ca 200 pm er sannsynligvis den praktiske grense, som kubeformede former av is en tendens til å danne seg i tykt vev, noe som påvirker morfologi. Ved behandling av eksemplarer som er tykkere enn 5 um, er det nødvendig med anvendelsen av et passende cryo-beskyttelsesmiddel, slik som BSA. Imidlertid vil BSA endre oppløsningens osmolaritet, og kan påvirke den fysiologiske responsen av celler. Derfor er omfattende kontrollforsøk som kreves for å validere bruk av BSA i bestemte systemer. Iskrystaller kan også dannes etter høytrykks frysing dersom prøvene uhell fjernes fra det flytende nitrogenbad. Dermed er det viktig å holde prøvestykkene i den flytende nitrogen til enhver tid og til å bruke på forhånd avkjølt til tangmanipulere dem.
Ved planlegging av eksperimenter, bør følgende tre punkter vurderes. For det første er den maksimale intensitet av lys (460 nm-linjen) 5,5 til 8,0 mW / mm2. Hvorvidt denne intensitet er tilstrekkelig til å indusere aktivitet må verifiseres med levende celle-avbildning på et fluorescens mikroskop før flash-og-fryse-eksperimenter. For det andre må eksperimenter utføres ved fysiologisk temperatur. Scenen av høytrykks fryser er varmet opp til 37 ° C i forsøkene med mus hippocampalneuroner 31. Til slutt må de tidspunkter være nøye utvalgt for å fange de membran dynamikk. Innledende studier indikerte at endocytose er avsluttet etter 100 ms av stimulering. Således er tre ytterligere tidspunkter (15, 30, og 50 ms) ble også undersøkt for å følge membran dynamikk 17, 18. Disse tidspunkter var nødvendige for å visualisere membranen trafikk arrangements i løpet av synaptisk transmisjon. Men kravet til antall tidspunkter er forskjellige i hver celle hendelse. Derfor bør noen tidspunkter prøves før oppstart av store datasett samling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Johns Hopkins University (SW). Vi takker Johns Hopkins School of Medicine mikroskop Facility for deres tekniske support. Vi takker Erik Jorgensen og Christian Rosenmund og medlemmer av deres laboratorier for utvikling av teknikken. Vi takker M. Wayne Davis for utformingen av den første enheten. Vi takker Paul Wurzinger, Cveta Tomova, og Delgermaa Luvsanjav for deres teknisk assistanse. Vi takker også Natalie R. Hamilton og Grant F. Kusick for deres kritisk lesing av manuskriptet.
Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
High Pressure Freezer – EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
Osmometer | Gonotec | ||
Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
Oven | Blue M | ||
Razor blade | Personna | ||
Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
Acetone | EMS | RT10016 | |
HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
KCl | Sigma | 746436-1KG | |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
DMEM | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed at 37°C before use |
FBS | Thermo scientific | 26140-079 | |
Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed at 37°C before use |
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
Whatman I filter paper | GE | ||
Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |