Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Published: May 16, 2017 doi: 10.3791/55676
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Abstract

התחבורה Nucleocytoplasmic מתייחס יבוא ויצוא של מולקולות גדולות מן הגרעין התא. לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין טרשת לרוחב האמיטרופית (ALS) לבין ליקויים במסלול nucleocytoplasmic. ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית המשפיעה על נוירונים מוטוריים וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS הם ספורדיים, ללא כל קישור גנטי לכאורה, אבל 10% יורשים באופן דומיננטי. לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) ב chromosome 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו כגורם גנטי של ALS ו דמנציה פרונטוטמפוראל (FTD). חשוב לציין, קבוצות שונות הציעו לאחרונה כי מוטציות אלה משפיעות על התחבורה nucleocytoplasmic. מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאה הסופית ואת הביטויים שנגרמו על ידי HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים תפקוד התחבורה הגרעינית בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה ניתן לקבוע, בעיקר בשל overexpression גבוה או הכנסת חלבון אקסוגני.

פרוטוקול זה מתאר assay חדש ורגיש מאוד להעריך לכמת תפקוד לקוי nucleocytoplasmic בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה מבוצע באמצעות מעכב exportin, ובכך מאפשר המעבורת GFP רק כדי להזין את הגרעין. כדי לאמת את assay, C9orf72 HRE מתורגם חוזר dipeptide, פולי (GR) ו פולי (PR), אשר הוכחו בעבר לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו. באמצעות assay המתואר, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים זעירים בתחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבחון את היכולת של גורמים שונים כדי להציל (אפילו באופן חלקי) nucleocytoplasmic trפגם ansport ניתן לקבוע.

Introduction

קומפלקס הגרעין הגרעיני (NPC) שולט ביבוא וביצוא של מולקולות גדולות אל תוך גרעין התא וממנו. בניגוד מולקולות קטנות, אשר יכול להיכנס לגרעין ללא תקנה 1 , הובלה של מולקולות גדולות נשלטת מאוד על ידי NPC. מולקולות גדולות אלה, כגון חלבונים ורנ"א, מקושרות לגורמי תובלה, כולל יבואנים ויצואנים, לייבוא ​​ולייצוא מהגרעין 2 . כדי לייבא, חלבונים חייבים להכיל מוטיב פפטיד קטן, הנקרא בדרך כלל אות לוקליזציה גרעינית (NLS), אשר מחויב על ידי importins 2 . רצפים אלה של חומצות אמינו לשמש תג והם מגוונים בהרכב 3 , 4 . חלבונים ניתן לייצא מן הגרעין כדי הציטופלסמה בשל הקשר שלהם עם exportinS, אשר נקשרים רצף האות, נקרא בדרך כלל אות הייצוא הגרעיני (NES) 2 . הן importins ו exportins מסוגלים להעביר את המטען שלהם עקב הרגולציה של קטן ראס הקשורים חלבון גרעיני GTPase (רן) 2 . רן הוכח להתקיים במצבים קונפורמטיביים שונים, תלוי אם הוא קשור ל- GTP או לתוצר. כאשר מחויב ל- GTP, רן יכול להיקשר לייבוא ​​או לייצוא. עם החובה ל- RanGTP, היבואנים משחררים את מטענם, ואילו היצואנים חייבים לחייב את רנג-טאפ כדי ליצור קומפלקס עם מטען היצוא שלהם. מצב נוקליאוטיד הדומיננטי מחייב של רן תלוי במיקום שלה בגרעין (RanGTP) או הציטופלסמה (RanGDP).

לאחרונה, מספר מחקרים הראו קשר בין ליקויים בנתיב nucleocytoplasmic לבין טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) ו דמנציה frontotemporal (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS היא מחלה נוירודגנרטיבית פרוגרסיבית וקטלנית המשפיעה על שני נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים (MNs) 13 וכתוצאה מכך שיתוק ובסופו של דבר למוות, בתוך 2-5 שנים בממוצע. רוב המקרים של ALS מסווגים כ- SPS, ללא כל קשר גנטי לכאורה, אך 10% הם בירושה באופן דומיננטי (ALS משפחתי, FALS). לאחרונה, hexanucleotide הרחבות חוזרות (HREs) של כרומוזום 9 פתוח מסגרת הקריאה 72 (C9orf72) הגן זוהו 14 , 15 כגורם גנטי של ALS ו FTD. מוטציות אלה מהווים 30-40% מהמקרים של FALS 16 , ומחקרים שונים טענוכי הם גורמים לרעילות על ידי המשפיעים על התחבורה nucleocytoplasmic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

מחקרים אלה הראו בעיקר את התוצאות הסופיות ואת הביטויים של HRS על התחבורה nucleocytoplasmic, אבל הם לא מראים הפרעה nucleocytoplasmic בזמן אמת. כתוצאה מכך, רק מחסור חמור nucleocytoplasmic התחבורה הוערך 11 , 17 , 18 .

פרוטוקול זה מתאר חדש וישAssay רגיש להעריך להעריך לכמת nucleocytoplasmic תפקוד לקוי בזמן אמת. שיעור היבוא של NLS-NES-GFP חלבון (מעבורת-GFP) ניתן לכמת בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זה נעשה באמצעות מעכב exportin, כפי שתואר קודם לכן 18 , ובכך מאפשר המעבורת- GFP רק כדי להזין את הגרעין. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט תוכנה לכימות שינויי פלורסנט בזמן אמת, ניתן לכמת שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה של המעבורת- GFP, הממוקם בגרעין. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן, המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לבצע. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים, ניתן ליצור מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה.

כדי לאמת את assay, לתרגםD C9orf72 dipeptide חוזר, פולי (GR) ו פולי (יחסי ציבור), אשר דווחו בעבר כדי לשבש את התחבורה nucleocytoplasmic, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ירידה של 50% בשיעור היבוא הגרעיני נצפתה בהשוואה לשליטה. באמצעות מערכת זו, שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic ניתן לבדוק. יתר על כן, היכולת של גורמים שונים כדי להציל פגם תחבורה nucleocytoplasmic ניתן לקבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת קו סלולרי

  1. הפשירי כ -1,000,000 תאי עצב בעמוד השדרה של תאי עצב נוירובלסטומה (NSC-34 תאים) שאוחסנו במיכל חנקן נוזלי. השתמש 37 ° C אינקובטור מים עד התאים מופשר לחלוטין.
  2. הוסף בינוני טרי, חם (בינוני DMEM המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 1% L- גלוטמין, 1% אנטיביוטיקה עט עט).
  3. צנטריפוגה תאים מופשר (SL16R) ב XG 500 במשך 5 דקות, ויצרו תא גלולה. מחק את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של המדיום החדש עבור resuspension התא.
  4. מניחים את התאים resuspended בבקבוק 15 מ"ל ולהוסיף תוספת 5 מ"ל של המדיום. דגירה התאים לילה חממה סטרילית עם 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. במקביל, במקום coverslips 8 uncoated (כיסוי זכוכית: 12 מ"מ, 0.13-0.17 מ"מ עובי) בתוך 60 מ"מ צלחת תרבות לעקר באמצעות אתנול 70% וחשיפה 30 דקות של אור UV עד יבש. מוסיפים את המדיום לכל צלחת ומפזרים כדי לשטוף את אתנול שיורית.
  6. הוסף חיץ טריפסין (2.5 גרם של טריפסין ו 0.2 גרם של EDTA ב 1 L של תמיסת מלח מאוזן של הנקס) לתאים לאחר שהם מגיעים כ -90% מפגש (בערך 6 מיליון תאים לכל בקבוק) כדי לאפשר תאים חסיד לנתק.
    הערה: NSC-34 תאים רגישים רק דורשים 15 ים של הדגירה חיץ טריפסין 1 דקות נוספות של הדגירה ללא טריפסין לפני דיסוציאציה באמצעות המדיום.
  7. פלייט התאים על 60 מנות תרבות מ"מ כבר המכיל את coverslips עם 3 מ"ל של מדיום, כ 350,000 לכל מנה. להשאיר אותם בחממה במשך 24 שעות כדי לאפשר מצורף התא על coverslips.

2. Transfection Cell

הערה: לאחר כ 24 שעות, תאים NSC-34 יגיעו המפגש 40% (כ 800,000 תאים) ויהיה מוכן transfection.

  1. הכן בינוני DMEM טהור (300 μL של מדיום DMEM עבור כל צלחת 60 מ"מ תרבות) באמבט microcentrifuge סטריליEs.
  2. הוסף 2 מיקרוגרם של כל פלסמיד נדרש transfection לכל צינור microcentrifuge המכיל DMEM.
    הערה: המעבורת- GFP פלסמיד היא חובה בכל transfections התא.
  3. הוסף transfection מגיב לכל צינורות microcentrifuge המכילים פלסמידים הנדרשים שלהם. הנה, להוסיף 4 μL של מגיב transfection מסחרי עבור כל 2 מיקרוגרם של ה- DNA.
  4. וורטקס צינורות microcentrifuge המכיל DMEM, פלסמידים, ואת מגיב transfection ו דגירה אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.
  5. מוסיפים כל צינור microcentrifuge לצלחת תרבות ומערבבים את המנה בעדינות כדי ליצור פתרון הומוגני. מניחים את צלחת בחזרה בחממה במשך 48 שעות.
    הערה: מאז המעבורת- GFP צריך לבוא לידי ביטוי בכל התאים, המעבורת- GFP יעילות transfection ניתן בחינה חלקית נבדק מראש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר transfection לילה. בדיקה מלאה של חלבונים שאינם פלואורסצנטי לידי ביטוי יכול להתבצע באמצעות analys immunoblotJ

3. מיקרוסקופיה

  1. צרף את coverslips המכילים transfected NSC-34 תאים לבעלים coverslip ולשטוף בעדינות עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להסיר את התאים המתים מנותקים.
  2. זיהוי תיקון התא מתאים באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק עם מיקרוסקופ הפוך.
    הערה: תיקון תא מתאים מוגדר שדה מיקרוסקופ של נוף מראה מספר גדול של תאים (20-30 תאים בשדה) שבו גרעינים מוגדרים בבירור בתאים. גרעיני תאים בתוך תיקון התא מזוהים לראשונה על ידי העין מסומנים ידנית על ידי תוכנת הדמיה.
  3. הוסף 200 μL של מעכב exportin 1 Leptomycin B (LMB) המכיל 10 ng / mL LMB ב PBS כדי coverslips ידי טפטוף המאגר על coverslips תחת המיקרוסקופ.
    הערה: נקודת זמן זו נקבעת כאפס מרווח.
  4. לכמת את עוצמת הניאון של גרעינים מסומנים במרווחים של 3 במשך כ 400-500 s.

4. ניתוח

הערה: מאז תאים שונים להביע רמות שונות של מעבורת ניאון- GFP, חשוב לנרמל את עוצמת הניאון הגרעיני של כל תא כדי עוצמת ניאון הראשונית שלה.

  1. לנרמל את עוצמת הניאון של הגרעינים המסומנים על ידי חלוקת מרווח פלורסנט 3-s של כל גרעין עם הממוצע של שישה אינטרוולים הראשונים של גרעין זה.
  2. לאחר הנורמליזציה של כל גרעין, לייצר עקומת עוצמת ניאון המייצג את השינוי גרעיני הקרינה כפונקציה של זמן עבור כל תיקון התא. כדי לעשות זאת, לחשב את הממוצע של כל התאים בכל תיקון תאים (בהיקף של כ 20-30 תאים בכל תיקון).
    הערה: עקומת עוצמת ניאון גרעיני דומה עקומת הרוויה Michaelis-Menten, אשר נצפה טוב יותר בתוך ti מוגברתלי תקופות. זאת בשל ירידה בכמויות cytosolic של המעבורת- GFP עם הזמן עקב התחבורה הגרעינית. ירידה זו סטטיסטית מורידה את ההסתברות של המעבורת- GFP להובלה לגרעין, ובכך להגיע הרוויה הקרינה הגרעינית. המדרון נגזר מן השיעור ההתחלתי ליניארי של עקומת התשואות קצב הכניסה V מקסימום לתוך הגרעין.
  3. לנתח את המדרונות V מקסימום של כל תיקון התא, נגזר שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים, באמצעות תוכנת גרפים לייצר מדרון אחד המייצג כל קבוצה ניסיונית. בצע כימות באמצעות ניתוח סטטיסטי חד כיווני ANOVA.

5. אימות חלבון ואלידציה

  1. מקום 60 מנות תרבות מ"מ המכילים תאים שיורית (לא נעשה שימוש בניסוי לעיל) מכל קבוצה ניסיונית על הקרח.
  2. להשליך את המדיום לשטוף את התאים פעמיים עם PBS לדלל ולשטוף את המדיום שנותר.
  3. לטפל בתאים עם 200-400ΜL של חיץ תמוגה המכיל PBS, 0.5% Triton, ו פרוטאז מעכב קוקטייל Tablet (PI). לגרד באמצעות מגרד תא.
  4. לאסוף את התאים במאגר תמוגה בצינור microcentrifuge ו homogenize עם homogenizer בסל"ד 4,000 דקות 1 מתחת לקרח.
  5. צנטריפוגה תאים homogenized ב 2,500 xg במשך 10 דקות. איסוף supernatant, לכמת את ריכוז החלבון באמצעות assay Bradford, ולאחסן עד לשימוש ב -20 מעלות צלזיוס.
  6. איסוף בין 30 ו - 70 מיקרוגרם של חלבון הכולל (תלוי בחלבון) לטעון אותו לתוך ג'ל SDS-PAGE לבדיקת ביטוי חלבון באמצעות assay immunoblot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הנוהל המוצג כאן, נוירון כמו מנוע NSC-34 תאים היו transfected עם NLS-NES-GFP (מעבורת- GFP) חלבון. חלבון זה, אשר NLS ו- NES רצפים האות ( איור 1 ), יכול מעבורת בין הגרעין לבין הציטופלזמה. Generic GFP יכול להיכנס או לצאת הגרעין בהעדר כל תג לוקליזציה רק ​​על ידי דיפוזיה ולכן מופץ באופן שווה בין הגרעין לבין הציטופלזמה ( איור 2 א ). לעומת זאת, המעבורת- GFP חלבון נמצא בעיקר בציטופלסמה בשל האות NES ו- NLS המשפיעים על הפיזור שלה ( איור 2 ב ). לכן, רק את תוספת של מעכב exportin leptomycin B (LMB), אשר מעכב את הייצוא חלבון, מאפשר הצטברות של המעבורת- GFP לגרעין ובסופו של דבר למדידת המעבורת- GFP היבוא שיעור ( איור 2 ג ). באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט וכך Ftware לכמת שינויים ניאון בזמן אמת, שינויים הדרגתיים בעוצמת הקרינה הגרעינית של המעבורת- GFP ניתן לכמת. כתוצאה מכך, עקומת הרוויה Michaelis-Menten כמו של ציר הקרינה אל הזמן ( איור 3 ), המייצג את כמות המעבורת הגרעינית- GFP בכל זמן נתון, ניתן לייצר. באמצעות שיעור ליניארי הראשוני של הקימורים (כפי שצוין על ידי המעגל באיור 3 ), מדרון, אשר מייצג את שיעור הכניסה לגרעין לפני הרוויה הקרינה, ניתן ליצור.

מספר מחקרים מראים כי חלבונים שונים C9orf72 הם רעילים מודלים תסיסנית melanogaster ו / או תאים בתרבית 6 , 11 . דיפפטיד חוזר (DPRs), פולי (PR) ו poly (GR), המיוצר מ HRs בגן C9orf72 מוטציה, נמצאו לגרום מתח גרעיני 8 , Lass = "xref"> 19 , 20 ו היו מעורבים פגום nucleocytoplasmic התחבורה, מה שהופך אותם מופיעים מזיקים במיוחד. כדי לאמת את התועלת של assay המתואר, מנוע נוירון כמו NSC-34 תאים היו transfected עם אלה שני פלסמידים DPR, פולי (PR) ו poly (GR). מאז פולי (PR) ו פולי (GR) DPRs הם מצומדות כדי GFP גם כן, חשוב היה לאמת כי DPRs לא הושפעו על ידי leptomycin-B, כמו גם, אשר יביא תוצאה חיובית שקר. הביטוי הפוליטי (PR) נצפה בגרעין לחלוטין כתכלילים; ולכן, זה לא יכול לתת איתות חיובי חיובי לייבא גרעיני ( איור 4 א ). פולי (GR) ביטוי, לעומת זאת, נצפתה הומוגנית cytosol וגם תכלילים בגרעין ( איור 4 ב ). כאשר transfecting NSC-34 תאים עם פולי (GR) בלבד והוסיף leptomycin-B, לא תנועה מעבורת של פולי לידי ביטוי (GR) נצפתה ( איור 5 ).

"Jove_content" עבור: לשמור יחד.בעוד דף = "1"> על ידי ניתוח שיעור התחבורה nucleocytoplasmic של המעבורת- GFP, NSC-34 תאים נמצאו שיתוף להביע או פולי (PR) או פולי (GR) DPRs , מראה ירידה בשיעור היבוא הגרעיני של כ 50% לעומת transfected תאים עם פלסמיד ריק כמו שליטה ( איור 5 ).

איור 1
איור 1: סכמטי של NLS-NES-GFP (מעבורת-GFP) לבנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Leptomycin B מעכב את הייצוא של המעבורת- GFP מן הגרעינים של NSC-34 תאים. תמונות נציג של NSC-34 תאים expRessing גנרי כללי ( A ) או מעבורת-GFP חלבון לפני ( ב ) ו 20 דקות לאחר תוספת של 10 ng / מ"ל ​​Leptomycin B (LMB) ( C ). בעקבות LMB בנוסף, המעבורת- GFP יבוא לתוך הגרעין, אבל הייצוא בחזרה הציטופלסמה נחסם. לפיכך, המעבורת- GFP מצטבר הגרעינים. סולם בר = 15 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מייקל, מנטן כמו העלילה מראה עלייה הקרינה הגרעינית. נציג מייקל, מנטן, כמו עקומות המתארים עלייה הקרינה הגרעינית של שתי קבוצות, מושפע ולא מושפע תאים תעבורה nucleocytoplasmic, בתוך 25 דקות. 5 דקות הראשונית להראות הבדל גבוה בשיעור הגידול, שהוא דהמקומט לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: C9orf72 DPRs פולי (PR) ו poly (GR) ביטוי ב NSC-34 תאים. תמונות נציג של NSC-34 תאים transfected עם D9s C9orf72, פולי (GR) ( A ) ו poly (PR) ( B ). פולי (GR) באה לידי ביטוי גרעיני של התאים, אבל הוא מופץ גם הומוגנית cytosol. פולי (PR) מתבטאת בעיקר בגרעינים. סולם בר = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: D9s C9orf72, פולי (PR) ו poly (GR), לעכב את שיעור היבוא הגרעיני בתאי NSC-34. מנוע נוירון כמו NSC-34 תאים היו שיתוף transfected עם המעבורת- GFP, יחד עם פלסמיד ריק, פולי (PR) או פולי (GR). שיעור היבוא הגרעיני הוגדר כשיפוע של השיעור הליניארי הראשוני של העקום ב- V max . שיעור ההובלה המתקבל עם הפלסמיד הריק הוגדר כ- 100%. Co-transfection עם פולי (PR) ו poly (GR) מעכב את שיעור ההובלה של כ 50% לעומת שליטה. ניתוח כמותי בוצע על שלושה עד חמישה ניסויים עצמאיים באמצעות ANOVA דרך אחת. **** p <0.0001; *** p <0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים assay חדש רגיש וכמותי חדש להעריך שינויים דקה התחבורה nucleocytoplasmic. באמצעות מערכת זו, ניתן לבחון ולמדוד התחבורה nucleocytoplasmic ואת תפקוד לקוי שלה בזמן אמת, לא רק פגמים גדולים המביאים לשינויים דרמטיים בחלוקה חלבון. Assay זה לא רק יש יתרון רגישות, אבל זה גם דורש הכנה קטנה, הוא זול, והוא מבחין קל מאוד מעורבות נמוכה.

כדי לבחון את היעילות של מערכת זו, C9orf72 חלבונים, פולי (GR) ו פולי (PR) DPRs, מודלים של ALS ו FTD שהיו בעבר הוכיחו לגרום מחסור nucleocytoplasmic התחבורה, שימשו 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . באמצעות assay זה, ניתן היה להוכיח, בזמן אמת, ירידה של כ 50% בקצב ייבוא ​​גרעיני בתאים המבטאים את DPRs לעומת תאים transfected עם וקטור שליטה. לכן, מערכת זו פותחת את האפשרות בקלות למדוד שינויים קטנים בתחבורה nucleocytoplasmic, אשר יכול להיגרם על ידי אלה או אחרים ALS או FTD מוטציות או מחלות אחרות שבהן פגמים פוטנציאליים בתחבורה nucleocytoplasmic עשויים להתקיים. למרות פרוטוקול המתואר כאן עוסק בתאי נוירון דמויי המנוע, זה יכול להיות מותאם בקלות סוגים אחרים של תאים. חשוב יותר, באמצעות מערכת זו, ניתן כעת לקבוע כיצד גורמים מולקולריים שונים או תרופות עשוי לסייע במניעת או לחילופין (אפילו חלקית) ליקויים בתחבורה nucleocytoplasmic ALS, FTD, או הפרעות אחרות.

מגבלה אפשרית אחת באמצעות assay זה הוא היכולת מוגבלת לצפות ולסמן את גרעיני התא בתאים שאינם בעלי גרעין ברור או שיש אחד קטן מאוד. כדי להתגבר על זה, פתרון אפשרי עשוי להיות פשוט להשתמש magnific גדול Ation. עם זאת, זה יהיה בסופו של דבר להפחית את כמות התאים כל תיקון התא, ובכך להגדיל את כמות הניסויים הדרושים כדי להגיע לערך משמעותי.

שיקול נוסף מתייחס היחס בין ה- GFP-GFP ל- cytoplasm לפני הוספת LMB. יחס זה עשוי להיות שונה מאוד בסוגי תאים שונים וכתוצאה מכך עשוי להיות קטן מדי (קרוב ל 1: 1 יחס) כדי להראות גרעין גלוי. פתרון אפשרי אחד הוא להשתמש בסמן גרעיני מראש. זה לא ישפיע על הניתוח הסופי, שכן כל תא הוא מנורמל המקורי הקרינה הגרעינית שלה. בנוסף, מומלץ לכייל את ריכוז LMB המשמש לעיכוב exportin לפני assay זה מבוצע ביעילות לבחון את הגידול האופטימלי הקרינה הגרעינית.

מחסור nucleocytoplasmic התחבורה הוא הציע לשחק תפקיד מרכזי ניוון של נוירונים המנוע ALS 5 ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . אם זה המקרה, פגמים דומים nucleocytoplasmic תחבורה כמו אלה שנצפו במודל C9orf72 היה צפוי לשחק תפקיד מודלים אחרים ALS. עם זאת, בשל השונות הגדולה בין המודלים השונים, התוצאות הסופיות והביטויים המולקולריים הנובעים מהפרעה נוקלאוקסיטופלאסמית בכל מקרה עשויים להיות שונים מעיניהם. למרות מחקר מקיף על מודלים שונים FALS, קישור אותם עם מנגנונים משותפים נשאר אתגר. Assay זה עשוי כעת לספק את ההזדמנות כדי להתגבר, לפחות באופן חלקי, אתגר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

אנו מודים לכל חברי מעבדת AI על הערותיהם והצעותיהם המועילות. ברצוננו להודות פרופ 'מארק היפ (מקס פלנק המכון לביוכימיה) עבור מתן לנו את המעבורת- GFP וקטור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הישראלית למדע (ISF # 124/14), הקרן הדו-לאומית למדע (BSF # 2013325), FP7 מארי קורי (קרייג # 333794) והמכון הלאומי לפסיכוביולוגיה בישראל NIPI # b133-14 / 15).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) tebu-bio CLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucose Biological Industries 01-055-1A
FBS European Grade Biological Industries 04-007-1A
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick Bar Naor LTD
TurboFect Transfection Reagent Thermo Scientific R0531
Axiovert 100 inverted microscope Zeiss
Imaging Workbench 2 Axon Instruments
Leptomycin B Sigma L2913
PBS Biological Industries 02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp Glas-Col 099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated Thermo Scientific 75002455

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
  13. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
  14. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
  15. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
  16. Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
  17. Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
  18. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
  19. Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

Tags

Neuroscience גיליון 123 תחבורה nucleocytoplasmic GFP המעבורת NSC-34 תאים C9orf72 ALS
Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shani, T., Levy, M., Israelson, A.… More

Shani, T., Levy, M., Israelson, A. Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells. J. Vis. Exp. (123), e55676, doi:10.3791/55676 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter