Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att noggrant mäta den nukleocytoplasmatiska transporthastigheten inom motor neuronliknande NSC-34-celler genom att kvantifiera förändringen i realtid i nukleär import av ett NLS-NES-GFP-protein.
Abstract
Nukleocytoplasmisk transport avser import och export av stora molekyler från cellkärnan. Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan amyotrofisk lateralskleros (ALS) och nedsatt nukleocytoplasmisk vägen. ALS är en neurodegenerativ sjukdom som påverkar motorneuronerna och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS är sporadiska, saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärvt på ett dominerande sätt. Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsutvidgningar (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen som en genetisk orsak till ALS och frontotemporal demens (FTD). Det är viktigt att olika grupper nyligen föreslog att dessa mutanter påverkar nukleocytoplasmisk transport. Dessa studier har mestadels visat det slutliga resultatet och manifestationer som orsakats av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte dysfunktion i kärntransporter irealtid. Som ett resultat kan endast allvarlig nukleocytoplasmisk transportbrist bestämmas, främst beroende på hög överuttryck eller exogen proteininsättning.
Detta protokoll beskriver en ny och mycket känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta utförs genom att använda en exportinhibitor, vilket möjliggör att shuttle GFP bara kommer in i kärnan. För att validera analysen användes de C9orf72 HRE-translaterade dipeptidreceptionerna, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har visats störa nukleocytoplasmisk transport. Med hjälp av den beskrivna analysen observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Genom att använda detta system kan minutförändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas och förmågan hos olika faktorer att rädda (även delvis) en nukleocytoplasmisk trAnsökningsfel kan bestämmas.
Introduction
Kärnporekomplexet (NPC) kontrollerar import och export av stora molekyler in i och ut ur cellkärnan. I motsats till små molekyler, som kan komma in i kärnan utan reglering 1 , styrs transporten av större molekyler starkt av NPC. Dessa stora molekyler, såsom proteiner och RNA, associerar med transportfaktorer, inklusive importin och exportin, som ska importeras och exporteras från kärnan 2 . För att kunna importeras måste proteiner innehålla ett litet peptidmotiv, i allmänhet kallat en nukleär lokaliseringssignal (NLS), som är bunden av importins 2 . Dessa sekvenser av aminosyror verkar som en etikett och är olika i komposition 3 , 4 . Proteiner kan exporteras från kärnan till cytoplasma på grund av deras association med exportinS, som binder en signalsekvens, generellt kallad en kärntransportsignal (NES) 2 . Både importins och exportins kan transportera sin last på grund av reglering av den lilla Rasrelaterade kärnprotein-GTPasen (Ran) 2 . Ran har visats existera i olika konformationella tillstånd beroende på om den är bunden till GTP eller BNP. När den är bunden till GTP, kan Ran binda till import eller export. Vid bindning till RanGTP släpper importins sin last, medan exportinslutningar måste binda RanGTP för att bilda ett komplex med sin exportlast. Det dominerande nukleotidbindande tillståndet av Ran beror på dess placering i kärnan (RanGTP) eller cytoplasman (RanGDP).
Nyligen har ett antal studier visat en samband mellan försämringar i nukleocytoplasmisk vägen och både amyotrofisk lateralskleros (ALS) och frontotemporal demens (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS är en progressiv och dödlig neurodegenerativ sjukdom som påverkar både övre och nedre motorneuroner (MNs) 13 och resulterar i förlamning och slutligen i död, inom 2-5 år i genomsnitt. De flesta fall av ALS klassificeras som sporadiska (SALS), saknar någon uppenbar genetisk koppling, men 10% ärar på ett dominerande sätt (familjen ALS, FALS). Nyligen identifierades hexanukleotidrepetitionsexpansioner (HRE) i kromosom 9 öppen läsram 72 (C9orf72) gen 14,15 som en genetisk orsak till ALS och FTD. Dessa mutanter står för 30-40% av FALS-fallen 16 , och olika studier har ifrågasattAtt de orsakar toxicitet genom att påverka nukleocytoplasmisk transport 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Dessa studier har mestadels visat de slutliga resultaten och manifestationerna av HRE på nukleocytoplasmisk transport, men de visar inte nukleocytoplasmisk störning i realtid. Som ett resultat har endast svår nukleocytoplasmisk transportbrist utvärderats 11 , 17 , 18 .
Detta protokoll beskriver en ny och veRy-känslig analys för att utvärdera och kvantifiera nukleocytoplasmisk transportdysfunktion i realtid. Importen av ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP) kan kvantifieras i realtid med användning av fluorescerande mikroskopi. Detta görs med användning av en exportinhibitor, såsom beskrivits tidigare 18 , vilket medger att shuttle-GFP enbart kommer in i kärnan. Med hjälp av floriserande mikroskopi och en mjukvara som kan kvantifiera fluorescerande förändringar i realtid, är det möjligt att kvantifiera gradvisa förändringar i fluorescensintensiteten hos shuttle-GFP, som ligger i kärnan. Som en följd kan en Michaelis-Menten-liknande mättnadskurva för fluorescens-till-tiden-axeln, som representerar mängden nukleär shuttle-GFP vid vilken tidpunkt som helst, göras. Genom att använda den initiala linjära kurvhastigheten är det möjligt att generera en lutning, vilken representerar inmatningshastigheten i kärnan före fluorescensmättnad.
För att validera analysen, översättD C9orf72 dipeptidrepetitioner, poly (GR) och poly (PR), vilka tidigare har rapporterats för att störa nukleocytoplasmisk transport, användes 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Med hjälp av denna analys observerades en 50% minskning av nukleär importhastighet jämfört med kontrollen. Med hjälp av detta system kan små förändringar i nukleocytoplasmisk transport undersökas. Dessutom kan förmågan hos olika faktorer att rädda en nukleocytoplasmisk transportdefekt bestämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celllinjepreparation
- Tina cirka 1 000 000 musneuroblastom ryggmärgsceller (NSC-34 celler) som lagrades i en flytande kvävebehållare. Använd en 37 ° C vatteninkubator tills cellerna är helt upptintade.
- Tillsätt färskt, varmt medium (DMEM-medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin och 1% pen-strep antibiotika).
- Centrifuga upptinade celler (SL16R) vid 500 xg under 5 min, bildande en cellpellets. Kassera mediet och tillsätt 1 ml nytt medium för cellresuspendering.
- Placera de resuspenderade cellerna i en 15 ml kolv och tillsätt en extra 5 ml medium. Inkubera cellerna över natten i en steril inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C.
- Placera 8 obelagda täckglas (täckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm tjockt) i en 60 mm odlingsskål och sterilisera med 70% etanol och exponera för 30 min UV-ljus tills det är torrt. Tillsätt medel till varje maträtt och kassera för att tvätta bort resterande etanol.
- Tillsätt trypsinbuffert (2,5 g trypsin och 0,2 g EDTA i 1 liter Hanks balanserade saltlösning) till cellerna efter att de når approximativt 90% sammanflöde (ungefär 6 miljoner celler per kolv) för att tillåta adherenta celler att dissociera.
OBS: NSC-34-celler är känsliga och kräver endast 15 s av trypsinbuffertinkubation och 1 ytterligare min inkubation fri från trypsin före dissociation med användning av mediet. - Placera cellerna på 60 mm odlingsskålen som redan innehåller täckglasen med 3 ml medium, cirka 350 000 per skål. Låt dem ligga i inkubatorn i 24 timmar för att tillåta cellfästning på täckglasen.
2. Celltransfektion
OBS: Efter ca 24 timmar kommer NSC-34-cellerna att nå 40% sammanflöde (cirka 800 000 celler) och är redo för transfektion.
- Förbered rent DMEM-medium (300 μl DMEM-medium för varje 60 mm odlingsskål) i sterilt mikrocentrifugröres.
- Tillsätt 2 μg av varje plasmid som krävs för transfektion till varje DMEM-innehållande mikrocentrifugrör.
OBS: Shuttle-GFP-plasmiden är obligatorisk i alla celltransfektioner. - Tillsätt transfektionsreagens till alla mikrocentrifugrör som innehåller sina erforderliga plasmider. Här tillsätt 4 μL av det kommersiella transfektionsreagenset för varje 2 μg DNA.
- Virvel mikrocentrifugrören innehållande DMEM, plasmider och transfektionsreagenset och inkubera dem vid rumstemperatur under 25 minuter.
- Tillsätt varje mikrocentrifugrör till en odlingsskål och rör omedelbart för att bilda en homogen lösning. Placera disken i inkubatorn i 48 timmar.
OBS! Eftersom shuttle-GFP ska uttryckas i alla celler kan transport-GFP-transfektionseffektiviteten delvis undersökas och förprövas med användning av fluorescerande mikroskopi efter transfektion över natten. En fullständig undersökning av icke-fluorescerande uttryckta proteiner kan utföras med användning av en immunoblotanalysär.
3. Mikroskopi
- Bifoga täckglas som innehåller transfekterade NSC-34-celler till en täckglashållare och tvätta försiktigt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna de frilagda döda cellerna.
- Identifiera en lämplig cellplåster med ett grönt fluorescerande filter med ett inverterat mikroskop.
OBS! En lämplig cellplåster definieras som ett mikroskopfält som visar ett stort antal celler (20-30 celler i ett fält) och i vilka kärnorna är tydligt definierade i cellerna. Cellkärnor i cellpatchen identifieras först av ögat och markeras manuellt av bildhanteringsprogrammet. - Tillsätt 200 μL av en exportin-1-inhibitor Leptomycin B (LMB) buffert innehållande 10 ng / ml LMB i PBS till täckglasen genom att droppa bufferten på täckglasen under mikroskopet.
OBS: Denna punkt i tiden är inställd som intervall noll. - Kvantifiera fluorescensintensiteten hos de markerade kärnorna i 3 s intervaller för runt 400-500 s.
4. Analys
OBS! Eftersom olika celler uttrycker olika nivåer av florscerande shuttle-GFP, är det viktigt att normalisera den nukleära fluorescerande intensiteten hos varje cell till sin egen initiala fluorescerande intensitet.
- Normalisera fluorescensintensiteten hos de markerade kärnorna genom att dividera 3-s fluorescerande intervall för varje kärna med medelvärdet av de initiala sex intervallen för den kärnan.
- Efter normalisering av varje kärna producerar en fluorescerande intensitetskurva som representerar förändringen i kärnfluorescens som en funktion av tiden för varje cellplåster. För att göra detta, beräkna medelvärdet av alla celler i varje cellplåster (bestående av cirka 20-30 celler i varje plåster).
OBS: Kärnans fluorescerande intensitetskurva liknar en Michaelis-Menten mättnadskurva, vilket bättre ses i ökad tiJag perioder. Detta beror på en minskning av de cytosoliska mängderna av shuttle-GFP med tiden på grund av kärntransport. Denna minskning sänker statistiskt sänkt sannolikheten för en shuttle-GFP att transportera in i kärnan, och når sålunda mättnad vid kärnfluorescens. Höjningen härledd från kurvens linjära initialhastighet ger V max- ingångshastigheten i kärnan. - Analysera V max- lutningarna i varje cellplåster, härledd från tre till fem oberoende experiment, med hjälp av grafprogrammet för att producera en lutning som representerar varje experimentgrupp. Utför kvantifiering med enkelriktad ANOVA statistisk analys.
5. Proteinuttryck Validering
- Placera 60 mm odlingsrätter innehållande återstående celler (ej använd i ovanstående experiment) från varje experimentgrupp på is.
- Kassera mediet och tvätta cellerna två gånger med PBS för att späda och tvätta det återstående mediet.
- Behandla cellerna med 200-400Μl lysisbuffert innehållande PBS, 0,5% Triton och proteasinhibitor cocktailtablett (PI). Skrapa med en cellskrapa.
- Samla cellerna i lysbuffert i ett mikrocentrifugrör och homogenisera med en homogenisator vid 4000 rpm under 1 min under is.
- Centrifugera de homogeniserade cellerna vid 2500 xg under 10 minuter. Samla supernatanten, kvantifiera proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys och förvara till användning vid -20 ° C.
- Samla mellan 30 och 70 μg total protein (beroende på proteinet) och ladda det i en SDS-PAGE-gel för att testa för proteinuttryck med hjälp av en immunoblotanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av proceduren som presenteras här transfekterades motor neuronliknande NSC-34-celler med ett NLS-NES-GFP-protein (shuttle-GFP). Detta protein, som har NLS- och NES-signalsekvenser ( Figur 1 ), kan shuttle mellan kärnan och cytoplasman. Generisk GFP kan komma in eller ut ur kärnan i frånvaro av någon lokaliseringssignalmärkning endast genom diffusion och fördelas därför jämnt mellan kärnan och cytoplasman ( Figur 2A ). Däremot finns shuttle-GFP-proteinet mestadels i cytoplasman på grund av att NES- och NLS-signalen s påverkar dess dispersion ( Figur 2B ). Således möjliggör endast tillägget av exportinhibitorleptomycin B (LMB), som hämmar proteinexporten, ackumuleringen av shuttle-GFP i kärnan och slutligen för mätningen av transport-GFP-importhastigheten ( Figur 2C ). Använda ett fluorescerande mikroskop och så Ftware för att kvantifiera fluorescerande förändringar i realtid, kan gradvisa förändringar i kärnfluorescensintensiteten hos shuttle-GFP kvantifieras. Som ett resultat kan en Michaelis-Menten-liknande mättnadskurva för fluorescens-till-tiden-axeln ( Figur 3 ), som representerar mängden nukleär shuttle-GFP vid vilken tidpunkt som helst, kunna produceras. Genom att använda den initiala linjära hastigheten för kurvorna (såsom indikeras av cirkeln i figur 3 ) kan en lutning, vilken representerar inmatningshastigheten i kärnan före fluorescensmättnad, genereras.
Flera studier visar att olika C9orf72 proteiner är toxiska i Drosophila melanogaster- modeller och / eller odlade celler 6 , 11 . Dippeptidrepetitionerna (DPRs), poly (PR) och poly (GR), som framställdes av HRE i den muterade C9orf72-genen, visade sig inducera nukleolär stress 8 ,Lass = "xref"> 19 , 20 och har blivit involverade i försämrad nukleocytoplasmisk transport, vilket gör dem speciellt skadliga. För att verifiera nyttan av den beskrivna analysen transfekterades motorneuronliknande NSC-34-celler med dessa två DPR-plasmider, poly (PR) och poly (GR). Eftersom poly (PR) och poly (GR) DPRs också är konjugerade till GFP, var det viktigt att validera att DPRs inte påverkades av leptomycin-B, vilket skulle resultera i ett falskt positivt resultat. Poly (PR) -uttryck observerades i kärnan fullständigt som inklusioner; Det kunde således inte ge en falsk positiv nukleär importsignal ( Figur 4A ). Poly (GR) -uttryck observerades å andra sidan homogent i cytosolen och även som inklusioner i kärnan ( Figur 4B ). Vid transfektion av NSC-34-celler med endast poly (GR) och tillsats av leptomycin-B observerades ingen shuttle-rörelse av den uttryckta poly (GR) ( Figur 5 ).
Figur 5 ).
Figur 1: Schematisk av NLS-NES-GFP-konstruktionen (shuttle-GFP). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Leptomycin B hämmar exporten av shuttle-GFP från kärnorna i NSC-34-celler. Representativa bilder av NSC-34-celler expMed generisk GFP ( A ) eller shuttle-GFP-protein före ( B ) och 20 minuter efter tillsatsen av 10 ng / ml Leptomycin B (LMB) ( C ). Efter LMB-tillägg importerar transport-GFP till kärnan, men exporten tillbaka till cytoplasman är blockerad. Sålunda ackumuleras shuttle-GFP i kärnorna. Skalstång = 15 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Michaelis-Menten-liknande diagram som visar en ökning av kärnfluorescens. Representativa Michaelis-Menten-liknande kurvor som visar en ökning i kärnfluorescensen hos två grupper, drabbade och icke-drabbade nukleocytoplasmatiska transportceller, inom 25 min. Den första 5 min visar en stor skillnad i ökad hastighet, vilket är deVeckas över tiden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: C9orf72 DPRs poly (PR) och poly (GR) -uttryck i NSC-34-celler. Representativa bilder av NSC-34-celler transfekterade med C9orf72 DPRs, poly (GR) ( A ) och poly (PR) ( B ). Poly (GR) uttrycks i cellernas kärnor men distribueras även homogent i cytosolen. Poly (PR) uttrycks huvudsakligen i kärnorna. Skala bar = 30 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: C9orf72 DPRs, poly (PR) och poly (GR), hämmar kraftigt nukleär importhastighet i NSC-34-celler. Motorneuronliknande NSC-34-celler samtransfekterades med shuttle-GFP, tillsammans med en tom plasmid, poly (PR) eller poly (GR). Nukleär importhastighet definierades som lutningen av kurvens initiala linjära hastighet vid Vmax . Transporthastigheten som erhölls med den tomma plasmiden definierades som 100%. Samtransfektion med poly (PR) och poly (GR) inhiberade transporthastigheten med omkring 50% jämfört med kontroll. Kvantitativ analys utfördes på tre till fem oberoende experiment med ett sätt ANOVA. **** p <0,0001; *** p <0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll demonstrerar en mycket känslig och kvantitativ ny analys för att utvärdera små förändringar i nukleocytoplasmisk transport. Med detta system är det möjligt att observera och mäta nukleocytoplasmisk transport och dess dysfunktion i realtid, inte bara stora defekter som resulterar i dramatiska förändringar i proteinfördelning. Denna analys har inte bara en känslighetsfördel, men det kräver också lite förberedelse, är billigt och är en mycket enkel och låg engagemangsanalys.
För att testa effektiviteten hos detta system användes C9orf72 proteiner, poly (GR) och poly (PR) DPRs, modeller av ALS och FTD som tidigare visat sig orsaka en nukleocytoplasmisk transportbrist, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Med hjälp av denna analys kunde man i realtid visa en minskning på ca 50% iNukleär importhastighet i celler som uttrycker DPRs jämfört med celler transfekterade med en kontrollvektor. Därför öppnar detta system möjligheten att enkelt mäta små förändringar i nukleocytoplasmisk transport, vilket kan orsakas av dessa och andra ALS- eller FTD-mutanter eller andra sjukdomar där potentiella fel i nukleocytoplasmisk transport kan förekomma. Fastän protokollet som beskrivs här behandlar motorneuronliknande celler, kan det lätt anpassas till andra celltyper. Viktigast är det att det med hjälp av detta system är möjligt att bestämma hur olika molekylära faktorer eller droger kan bidra till att förebygga eller rädda (även delvis) nukleocytoplasmatiska transportbrister i ALS, FTD eller andra störningar.
En möjlig begränsning vid användning av denna analys är den begränsade förmågan att observera och markera cellkärnorna i celler som inte har en klar kärna eller som har en mycket liten en. För att övervinna detta kan en möjlig lösning vara att helt enkelt använda en större magnifika ation. Detta kommer dock slutligen att minska mängden celler i varje cellplåster, vilket ökar mängden experiment som behövs för att nå ett betydande värde.
Ett annat övervägande hänför sig till shuttle-GFP-kärn-till-cytoplasmförhållandet före tillsatsen av LMB. Detta förhållande kan vara mycket annorlunda i olika celltyper och kan följaktligen vara för liten (nära ett förhållande 1: 1) för att visa en synlig kärna. En möjlig lösning är att använda en nukleär markör i förväg. Detta påverkar inte den slutliga analysen, eftersom varje cell normaliseras till sin ursprungliga kärnfluorescens. Dessutom rekommenderas att kalibrera koncentrationen av LMB som används för exportinhibering innan denna analys utförs för att effektivt observera den optimala ökningen av nukleär fluorescens.
Den nukleocytoplasmatiska transportbristen föreslås spela en huvudroll i degenerationen av motorneuroner i ALS 5 ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Om så är fallet skulle liknande nukleocytoplasmiska transportfel som de som observerades i C9orf72-modellen förutses spela en roll i andra ALS-modeller. På grund av den stora variationen mellan de olika modellerna kan slutresultatet och molekylära manifestationer som härrör från nukleocytoplasmisk störning i varje fall vara obemärkt eller fenotypiskt annorlunda. Trots omfattande forskning kring olika FALS-modeller är det fortfarande en utmaning att länka dem med gemensamma mekanismer. Denna analys kan nu ge möjlighet att övervinna, åtminstone delvis, denna utmaning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar av AI-laboratoriet för deras hjälpsamma kommentarer och förslag. Vi skulle vilja tacka professor Mark Hipp (Max Planck Institute for Biochemistry) för att ge oss shuttle-GFP-vektorn. Detta arbete stöddes av bidrag från den israeliska vetenskapsstiftelsen (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794) och National Institute for Psychobiology in Israel NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
- Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
