Summary
Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP.
Abstract
El transporte nucleocitoplasmático se refiere a la importación y exportación de grandes moléculas del núcleo celular. Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las alteraciones en la vía nucleocitoplasmática. ALS es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a las neuronas motoras y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en 2-5 años en promedio. La mayoría de los casos de ELA son esporádicos, carecen de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante. Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HREs) en el gen del gen 72 de lectura abierta del cromosoma 9 (C9orf72) como una causa genética de ALS y demencia frontotemporal (FTD). Es importante destacar que diferentes grupos han propuesto recientemente que estos mutantes afectan el transporte nucleocitoplasmático. Estos estudios han demostrado principalmente el resultado final y las manifestaciones causadas por HREs en el transporte nucleocytoplasmic, pero no demuestran disfunción de transporte nuclear entiempo real. Como resultado, sólo se puede determinar una deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático, principalmente debido a una alta sobreexpresión o inserción de proteínas exógenas.
Este protocolo describe un nuevo y muy sensible ensayo para evaluar y cuantificar la disfunción nucleocitoplasmática de transporte en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se realiza usando un inhibidor de la exportación, permitiendo así que la GFP de la lanzadera sólo entre en el núcleo. Para validar el ensayo, se usaron las repeticiones de dipéptido traducido HRE de C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han mostrado anteriormente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando el ensayo descrito, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Usando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático y la capacidad de diferentes factores para rescatar (incluso parcialmente)Se puede determinar el defecto de soporte.
Introduction
El complejo de poros nucleares (NPC) controla la importación y exportación de moléculas grandes dentro y fuera del núcleo celular. En contraste con las moléculas pequeñas, que pueden entrar en el núcleo sin la regulación 1 , el transporte de moléculas más grandes es fuertemente controlado por el NPC. Estas moléculas grandes, como las proteínas y el ARN, se asocian con factores de transporte, incluyendo importaciones y exportaciones, para ser importados y exportados desde el núcleo 2 . Para ser importados, las proteínas deben contener un pequeño motivo peptídico, generalmente llamado una señal de localización nuclear (NLS), que está limitada por importins 2 . Estas secuencias de aminoácidos actúan como una etiqueta y son diversas en la composición 3 , 4 . Las proteínas pueden ser exportadas desde el núcleo hasta el citoplasma debido a su asociación con laS, que se unen a una secuencia señal, generalmente llamada una señal de exportación nuclear (NES) 2 . Ambos importins y exportins son capaces de transportar su carga debido a la regulación de la pequeña proteína nuclear relacionada con Ras GTPase (Ran) 2 . Ran se ha demostrado que existen en diferentes estados conformacionales dependiendo de si está ligado a GTP o GDP. Cuando se vincula a GTP, Ran puede vincular a importins o exportins. Al unirse a RanGTP, importins liberan su carga, mientras que las exportaciones deben obligar a RanGTP a formar un complejo con su carga de exportación. El estado de enlace de nucleótidos dominante de Ran depende de su ubicación en el núcleo (RanGTP) o el citoplasma (RanGDP).
Recientemente, varios estudios han demostrado una conexión entre los trastornos en la vía nucleocitoplasmática y tanto la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) como la demencia frontotemporal (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . La ELA es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y fatal que afecta tanto a las neuronas motoras superiores como inferiores (MN) 13 y resulta en parálisis y en última instancia en la muerte, en un promedio de 2-5 años. La mayoría de los casos de ELA se clasifican como esporádica (SALS), carece de cualquier vínculo genético aparente, pero el 10% se hereda de manera dominante (ALS familiar, FALS). Recientemente, se identificaron las expansiones de repetición de hexanucleótidos (HRE) en el gen de lectura abierta del cromosoma 9 72 (C9orf72) 14 , 15 como causa genética de ALS y FTD. Estos mutantes representan el 30-40% de los casos FALS 16 , y diferentes estudios han sostenidoQue causan toxicidad al afectar el transporte nucleocitoplasmático 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Estos estudios han mostrado en su mayoría los resultados finales y las manifestaciones de las ERH sobre el transporte nucleocitoplasmático, pero no demuestran alteración nucleocitoplasmática en tiempo real. Como resultado, sólo se ha evaluado la deficiencia severa de transporte nucleocitoplasmático 11 , 17 , 18 .
Este protocolo describe una nueva y veRy para evaluar y cuantificar la disfunción del transporte nucleocitoplasmático en tiempo real. La tasa de importación de una proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) se puede cuantificar en tiempo real usando microscopía fluorescente. Esto se hace usando un inhibidor de la exportación, tal como se ha descrito anteriormente 18 , permitiendo así que la lanzadera-GFP solamente ingrese al núcleo. Utilizando microscopía fluorescente y un software capaz de cuantificar los cambios fluorescentes en tiempo real, es posible cuantificar cambios graduales en la intensidad de fluorescencia de la lanzadera-GFP, localizada en el núcleo. Como resultado, se puede hacer una curva de saturación similar a Michaelis-Menten del eje de fluorescencia a tiempo, que representa la cantidad de enlace-GFP nuclear en un momento dado. Mediante el uso de la tasa lineal inicial de las curvas, es posible generar una pendiente, que representa la tasa de entrada en el núcleo antes de la saturación de fluorescencia.
Para validar el ensayo, el traductorSe utilizaron repeticiones de dipeptidos C9orf72, poli (GR) y poli (PR), que se han descrito previamente para interrumpir el transporte nucleocitoplasmático, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Usando este ensayo, se observó una disminución del 50% en la tasa de importación nuclear en comparación con el control. Utilizando este sistema, se pueden examinar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Además, se puede determinar la capacidad de diferentes factores para rescatar un defecto de transporte nucleocitoplasmático.
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Protocol
1. Preparación de la Línea Celular
- Descongele aproximadamente 1.000.000 de células de médula espinal de neuroblastoma de ratón (células NSC-34) que se almacenaron en un recipiente de nitrógeno líquido. Utilice una incubadora de agua a 37 ° C hasta que las células estén completamente descongeladas.
- Se añade medio fresco y caliente (medio DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-glutamina y 1% de antibióticos pen-strep).
- Centrifugar las células descongeladas (SL16R) a 500 xg durante 5 min, formando un sedimento celular. Deseche el medio y agregue 1 ml de nuevo medio para la resuspensión celular.
- Coloque las células resuspendidas en un matraz de 15 mL y agregue 5 mL adicionales de medio. Incubar las células durante la noche en una incubadora estéril con 5% de CO 2 a 37 ° C.
- En paralelo, colocar 8 cubreobjetos sin recubrimiento (cubrir el vidrio: 12 mm, 0,13-0,17 mm de espesor) en un plato de cultivo de 60 mm y esterilizar con etanol al 70% y la exposición a 30 minutos de luz UV hasta que esté seco. Agregue el medio a cada plato y disponga para lavar el etanol residual.
- Se añaden tampón de tripsina (2,5 g de tripsina y 0,2 g de EDTA en 1 l de solución balanceada de sal de Hanks) a las células después de alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia (aproximadamente 6 millones de células por matraz) para permitir que las células adherentes se disocien.
NOTA: Las células NSC-34 son sensibles y sólo requieren 15 s de incubación con tampón de tripsina y 1 min adicional de incubación libre de tripsina antes de la disociación utilizando el medio. - Se colocan las células sobre las placas de cultivo de 60 mm que ya contienen los cubreobjetos con 3 ml de medio, aproximadamente 350.000 por placa. Dejarlos en la incubadora durante 24 h para permitir la fijación de células en los cubreobjetos.
2. Transfección celular
NOTA: Después de aproximadamente 24 h, las células NSC-34 alcanzarán una confluencia del 40% (aproximadamente 800.000 células) y estarán listas para la transfección.
- Preparar medio DMEM puro (300 μL de medio DMEM para cada recipiente de cultivo de 60 mm) en una cuba de microcentrífuga estérilEs
- Añadir 2 μg de cada plásmido requerido para la transfección a cada tubo de microcentrífuga que contenga DMEM.
NOTA: El plásmido shuttle-GFP es obligatorio en todas las transfecciones celulares. - Agregue el reactivo de transfección a todos los tubos de microcentrífuga que contengan los plásmidos requeridos. A continuación, añadir 4 μl del reactivo de transfección comercial para cada 2 μg de ADN.
- Vórtice los tubos de microcentrífuga que contienen DMEM, plásmidos y el reactivo de transfección y se incuban a temperatura ambiente durante 25 min.
- Añadir cada tubo de microcentrífuga a un plato de cultivo y agitar suavemente el plato para formar una solución homogénea. Coloque el plato de nuevo en la incubadora durante 48 h.
NOTA: Dado que la GFP de lanzadera debe expresarse en todas las células, la eficiencia de transfección de GFP-lanzadera se puede examinar parcialmente y pre-probar usando microscopía fluorescente después de una transfección durante la noche. Se puede realizar un examen completo de proteínas expresadas no fluorescentes usando un análisis de inmunotransferenciaes.
3. Microscopía
- Fijar los cubreobjetos que contienen las células NSC-34 transfectadas a un porta-cubreobjetos y lavar suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas separadas.
- Identificar un parche celular adecuado utilizando un filtro fluorescente verde con un microscopio invertido.
NOTA: Se define un parche celular adecuado como un campo de visión de microscopio que muestra un gran número de células (20 - 30 células en un campo) y en las que los núcleos están claramente definidos en las células. Los núcleos celulares dentro del parche celular se identifican primero por el ojo y son marcados manualmente por el software de formación de imágenes. - Añadir 200 μl de un inhibidor de la exportación-1 de leptomicina B (LMB) conteniendo 10 ng / mL de LMB en PBS a los cubreobjetos por goteo del búfer en los cubreobjetos bajo el microscopio.
NOTA: Este punto en el tiempo se establece como intervalo cero. - Cuantificar la intensidad fluorescente de los núcleos marcados en intervalos de 3 s por alrededor de 400-500 s.
4. Análisis
NOTA: Dado que diferentes células expresan diferentes niveles de transferencia flotante-GFP, es importante normalizar la intensidad fluorescente nuclear de cada célula a su propia intensidad fluorescente inicial.
- Normalizar la intensidad fluorescente de los núcleos marcados dividiendo el intervalo fluorescente de 3 de cada núcleo con el promedio de los seis intervalos iniciales de ese núcleo.
- Después de la normalización de cada núcleo, producir una curva de intensidad fluorescente que representa el cambio en los núcleos de fluorescencia en función del tiempo para cada parche celular. Para ello, calcule el promedio de todas las células de cada parche celular (que consta de aproximadamente 20 a 30 células en cada parche).
NOTA: La curva de intensidad de fluorescencia de los núcleos se asemeja a una curva de saturación de Michaelis-Menten, la cual se observa mejor dentro de tiMe períodos. Esto se debe a una disminución de las cantidades citosólicas de la lanzadera-GFP con el tiempo debido al transporte nuclear. Esta disminución disminuye estadísticamente la probabilidad de que un transbordador-GFP se transporte al núcleo, alcanzando así la saturación en la fluorescencia nuclear. La pendiente derivada de la tasa inicial lineal de la curva produce la velocidad de entrada de Vmax en el núcleo. - Analizar las pendientes de Vmax de cada parche celular, derivadas de tres a cinco experimentos independientes, utilizando el software de representación gráfica para producir una pendiente que representa cada grupo experimental. Realizar la cuantificación mediante análisis estadístico ANOVA unidireccional.
5. Validación de la expresión de la proteína
- Se colocan placas de cultivo de 60 mm que contienen las células residuales (no usadas en el experimento anterior) de cada grupo experimental sobre hielo.
- Desechar el medio y lavar las células dos veces con PBS para diluir y lavar el medio restante.
- Tratar las células con 200-400 Mu l de tampón de lisis que contiene PBS, 0,5% de Triton y comprimido de coctel de inhibidor de proteasa (PI). Raspe con un rascador de celdas.
- Recoger las células en tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga y homogeneizar con un homogeneizador a 4.000 rpm durante 1 min bajo hielo.
- Centrifugar las células homogeneizadas a 2.500 xg durante 10 min. Recoger el sobrenadante, cuantificar la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford, y almacenar hasta su uso a -20 ° C.
- Recoger entre 30 y 70 μ g de proteína total (dependiendo de la proteína) y cargar en un SDS-PAGE gel para probar la expresión de proteínas utilizando un inmunoblot ensayo.
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Representative Results
Usando el procedimiento presentado aquí, las neuronas motrices-NSC-34 células fueron transfectadas con un NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) de proteínas. Esta proteína, que tiene secuencias de señales NLS y NES ( Figura 1 ), puede transferirse entre el núcleo y el citoplasma. GFP genérico puede entrar o salir del núcleo en la ausencia de cualquier etiqueta de señal de localización sólo por difusión y por lo tanto, distribuido uniformemente entre el núcleo y el citoplasma ( Figura 2A ]. En contraste, la proteína GFP-lanzadera se encuentra principalmente en el citoplasma debido a la señal NES y NLS que afectan su dispersión ( Figura 2B ). Por lo tanto, sólo la adición del inhibidor de la exportación de leptomicina B (LMB), que inhibe la exportación de proteínas, permite la acumulación de la GFP transportista en el núcleo y, finalmente, para la medición de la tasa de importación transbordador-GFP ( Figura 2C ). Utilizando un microscopio fluorescente y Ftware para cuantificar los cambios fluorescentes en tiempo real, los cambios graduales en la intensidad de fluorescencia nuclear de la lanzadera-GFP pueden ser cuantificados. Como resultado, se puede producir una curva de saturación de tipo Michaelis-Menten del eje de fluorescencia a tiempo ( Figura 3 ), que representa la cantidad de transbordador-GFP nuclear en un momento dado. Mediante el uso de la tasa lineal inicial de las curvas (como se indica por el círculo en la Figura 3 ), se puede generar una pendiente, que representa la velocidad de entrada en el núcleo antes de la saturación de fluorescencia.
Varios estudios indican que diferentes proteínas C9orf72 son tóxicas en modelos de Drosophila melanogaster y / o células cultivadas 6 , 11 . Se descubrió que las repeticiones dipeptídicas (DPR), poli (PR) y poli (GR), producidas a partir de HRE en el gen mutado C9orf72, inducen el estrés nucleolar 8 ,Lass = "xref"> 19 , 20 y han sido implicados en el transporte nucleocytoplasmic dañado, haciéndolos parecer especialmente dañino. Para verificar la utilidad del ensayo descrito, las células NSC-34 de tipo neurona motora se transfectaron con estos dos plásmidos DPR, poli (PR) y poli (GR). Dado que los DPR poli (PR) y poli (GR) se conjugan también con GFP, era importante validar que los DPR no estaban afectados por la leptomicina B, lo que daría como resultado un falso positivo. La expresión de poli (PR) se observó completamente en el núcleo como inclusiones; Por lo tanto, no podría dar una señal de importación nuclear falsamente positiva ( Figura 4A ). Poly (GR) expresión, por otro lado, se observó de forma homogénea en el citosol y también como inclusiones en el núcleo ( Figura 4B ]. Cuando se transfectaron células NSC-34 con poli (GR) solamente y se añadió leptomicina B, no se observó movimiento de lanzadera del poli (GR) expresado ( Figura 5 ).
Figura 5 ].
Figura 1: Esquema de la construcción NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La leptomicina B inhibe la exportación de la GFP-lanzadera desde los núcleos de las células NSC-34. Imágenes representativas de células NSC-34 exp( B ) y 20 min después de la adición de 10 ng / mL de Leptomicina B (LMB) ( C ). Después de la adición de LMB, las importaciones de GFP en el núcleo, pero la exportación de vuelta al citoplasma se bloquea. Así, la lanzadera-GFP se acumula en los núcleos. Barra de escala = 15 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: diagrama similar a Michaelis-Menten que muestra un aumento en la fluorescencia nuclear. Curvas representativas de tipo Michaelis-Menten que representan un aumento en la fluorescencia nuclear de dos grupos, células de transporte nucleocitoplasmático afectadas y no afectadas, en 25 minutos. Los 5 minutos iniciales muestran una alta diferencia en la tasa de incremento, que es deCon el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: DPRs C9orf72 expresión poli (PR) y poli (GR) en células NSC-34. Imágenes representativas de células NSC-34 transfectadas con los DPRs C9orf72, poli (GR) ( A ) y poli (PR) ( B ). Poli (GR) se expresa en los núcleos de las células, pero también se distribuye de forma homogénea en el citosol. Poly (PR) se expresa principalmente en los núcleos. Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo demuestra un nuevo ensayo altamente sensible y cuantitativo para evaluar cambios minuciosos en el transporte nucleocitoplasmático. Utilizando este sistema, es posible observar y medir el transporte nucleocitoplasmático y su disfunción en tiempo real, no sólo grandes defectos que resultan en cambios dramáticos en la distribución de proteínas. Este ensayo no sólo tiene una ventaja de sensibilidad, sino que también requiere poca preparación, es barato y es un ensayo muy fácil y de bajo compromiso.
Para probar la eficacia de este sistema, se utilizaron proteínas C9orf72, DPRs poli (GR) y poli (PR), modelos de ALS y FTD que se demostraron anteriormente como causantes de una deficiencia de transporte nucleocitoplasmático 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizando este ensayo, fue posible demostrar, en tiempo real, una disminución de aproximadamente el 50% en elNuclear en las células que expresan los DPR en comparación con las células transfectadas con un vector de control. Por lo tanto, este sistema abre la posibilidad de medir fácilmente pequeños cambios en el transporte nucleocitoplasmático, que pueden ser causados por estos y otros mutantes ALS o FTD u otras enfermedades en las que pueden existir defectos potenciales en el transporte nucleocitoplasmático. Aunque el protocolo descrito aquí se refiere a neuronas motoras como las células, podría ser fácilmente adaptado a otros tipos de células. Lo que es más importante, utilizando este sistema, ahora es posible determinar cómo diferentes factores moleculares o fármacos pueden ayudar a prevenir o rescatar (incluso parcialmente) deficiencias de transporte nucleocitoplasmático en ALS, FTD u otros trastornos.
Una limitación posible en el uso de este ensayo es la capacidad limitada de observar y marcar los núcleos celulares en células que no poseen un núcleo claro o que poseen un núcleo muy pequeño. Para superar esto, una posible solución puede ser simplemente utilizar un mayor magnífico Ción. Sin embargo, esto finalmente disminuirá la cantidad de células en cada parche celular, aumentando así la cantidad de experimentos necesarios para alcanzar un valor significativo.
Otra consideración se refiere a la relación de nucleo-citoplasma de lanzadera-GFP antes de la adición de LMB. Esta relación puede ser muy diferente en diferentes tipos de células y, en consecuencia, puede ser demasiado pequeña (cerca de una relación 1: 1) para mostrar un núcleo visible. Una posible solución es usar un marcador nuclear de antemano. Esto no afectará al análisis final, ya que cada célula se normaliza a su fluorescencia nuclear original. Además, se recomienda calibrar la concentración de LMB utilizada para la inhibición de la exportación antes de realizar este ensayo para observar eficazmente el aumento óptimo de la fluorescencia nuclear.
Se sugiere que la deficiencia de transporte nucleocitoplasmático desempeñe un papel principal en la degeneración de las neuronas motoras en la ELA 5 ,= "Xref"> 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Si este es el caso, los defectos de transporte nucleocitoplasmático similares a los observados en el modelo C9orf72 se prevé que juegan un papel en otros modelos de ALS. Sin embargo, debido a la gran variabilidad entre los diferentes modelos, los resultados finales y las manifestaciones moleculares resultantes de la disrupción nucleocitoplasmática en cada caso pueden ser desapercibidos o fenotípicamente diferentes. A pesar de la extensa investigación sobre diferentes modelos FALS, su vinculación con mecanismos comunes sigue siendo un desafío. Este ensayo puede proporcionar ahora la oportunidad de superar, al menos parcialmente, este desafío.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio de AI por sus útiles comentarios y sugerencias. Nos gustaría agradecer al Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por brindarnos el vector shuttle-GFP. Este trabajo fue apoyado por las concesiones de la fundación israelí de la ciencia (ISF # 124/14), de la fundación binacional de la ciencia (BSF # 2013325), de la concesión de la integración de carrera de Marie Curie FP7 (CIG # 333794), y del instituto nacional para Psychobiology en Israel NIPI # b133 - 14/15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A | |
| DMEM 4.5 g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 | |
| Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thick | Bar Naor LTD | ||
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 | |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | ||
| Imaging Workbench 2 | Axon Instruments | ||
| Leptomycin B | Sigma | L2913 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE | |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
References
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