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Immunology and Infection

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

doi: 10.3791/55688 Published: May 30, 2019

Summary

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Genetik und Systembiologie haben unser Verständnis der Biologie von Malariaparasiten auf molekularer Ebene gefördert. Die effektiven Malariaparasitenziele für die Entwicklung von Impfstoffen und Chemotherapien sind jedoch nach wie vor begrenzt. Dies ist weitgehend auf die Nichtverfügbarkeit relevanter und praktischer In-vivo-Infektionsmodelle für humane Plasmodium-Arten zurückzuführen, insbesondere für P. falciparum und P. vivax. Daher wurden Nagetier-Malaria-Arten ausgiebig als praktische Alternative für Malaria-Impfstoffe, Wirkstoff-Targeting, Immunantwort und funktionelle Charakterisierungsstudien konservierter Plasmodiumspp-Gene eingesetzt. Tatsächlich haben sich Nagetier-Malariamodelle als von unschätzbarem Wert erwiesen, insbesondere für die Erforschung der Mückenübertragung und der Biologie im Leberstadium, und waren für immunologische Studien unverzichtbar. Es gibt jedoch Unterschiede in den Methoden zur Bewertung der Phänotypen von transgenen und wildtypen asexuellen und sexuellen Blutstadiumparasiten. Beispiele für diese Diskrepanzen sind die Wahl einer intravenösen vs. intraperitonealen Infektion von Nagetieren mit blutenden Parasiten und die Bewertung der männlichen Gamete-Exflagellation. Hierin beschreiben wir standardisierte experimentelle Methoden zur Bewertung der Phänotypen von asexuellen und sexuellen Blutstadien bei transgenen Parasiten, die Reporter-Gen oder wilde Nagetier-Malariaparasitenarten exemittieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Bewertung der Phänotypen von Malariaparasitenmückenstadien (Gameten, Ookinete, Oozysten und Sporozoiten) in Anopheles-Mückenvektoren. Diese Methoden sind hier detailliert und vereinfacht für die tödlichen und nicht-tödlichen Stämme von P. berghei und P. yoelii, können aber auch mit einigen Anpassungen an P. chabaudi und P. vinckei Nagetier Malariaarten angewendet werden.

Introduction

Malariaparasiten verursachen weltweit Hunderte Millionen von Malariainfektionen beim Menschen, mehr als 600.000 Todesfälle pro Jahr1. Menschliche Infektionen werden durch fünf Malariaparasitenarten verursacht, nämlich P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeund P. knowlesi. Die meisten klinischen Malaria-Sterblichkeiten werden durch P. falciparum in Afrika südlich der Saharaverursacht 1. Eine weitere menschliche Malariaparasitenart, die außerhalb Afrikas südlich der Sahara umfangreiche weltweite Morbiditäten verursacht, ist P. vivax2. Die anderen drei Arten sind alle geografisch stärker eingeschränkt und verursachen gutartige Malariainfektionen, mit Ausnahme der tödlichen P. knowlesi3. Die Nichtverfügbarkeit relevanter und praktischer nichtmenschlicher In-vivo-Modelle von Infektionen war und ist immer noch ein Hindernis für Malaria-Impfstoffe und die Entwicklung von Medikamenten. Frühere Malaria-Medikamente Targeting und Metabolische Studien haben sich weitgehend auf Aviäre Malaria-Modelle wie P. gallinaceum und P. lophuraeverlassen, hühner und enten zu infizieren, bzw.4. Danach wurden Nagetier-Malaria-Arten nach und nach in verschiedenen Impfstoffen und Medikamenten-Targeting-Studien als In-vivo-Modelle eingeführt. Im Laufe der Jahre haben sich Hinweise auf Ähnlichkeiten der Biologie und der Wirtsparasiten-Wechselwirkungen von Lebenszyklusstadien von Nagetier-Malariamodellen mit menschlichen Malariaarten angesammelt.

Insbesondere Nagetier-Malaria-Modelle waren extrem wichtig, um die Biologie von Mücken und präerythrozytischen Stadien zu erforschen und zu charakterisieren5. Es gibt jedoch vier Nagetier-Malaria-Arten (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudiund P. vinckei), die unterschiedliche biologische Merkmale aufweisen, von denen die bemerkenswertesten in den Blutstadien6sind. Nagetier-Malaria-Arten unterscheiden sich in der Synchronität der Blutstadien, wo blutbildende Stadien von P. chabaudi und P. vinckei Stämmen meist synchron sind, während die Blutstadien von P. berghei und P. yoelii nicht6 sind. , 7. Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied ist die Selbstclearance von Blutstadien, die in einigen Stämmen auftritt(z.B. , P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, und P. vinckei lentum), während die Blutinfektion anderer Stämme der gleichen Art könnten tödlich sein, wenn sie unbehandelt bleiben (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA und P. chabaudi AS). Darüber hinaus p. yoelii 17X-NL Stamm und P. berghei ANKA Stamm bevorzugt eindringen retikulozyten8,9,10,11, obwohl diese Merkmale von P. yoelii und P. berghei Stämme sind keine strenge Wachstumsanforderung12,13,14. Daher werden Mäuse mit Phenylhydrazin vor einer Infektion mit den Blutstadien dieser Parasiten behandelt, um die Parasiten- und Gametozytämie zu erhöhen, die für eine Mückeninfektion für den P. berghei ANKA-Stamm und für P. yoelii erforderlich sind. 17X-NL15,16,17,18,19.

Unterschiede in der Entwicklung der Mückenstadien gibt es auch zwischen verschiedenen Nagetier-Malaria-Arten, die bemerkenswertesten sind die Temperatur und Zeit für die optimale Entwicklung der Mückenstadien und die Sporozoit-Länge5,6, 20. In den präerythrozytischen Stadien von Nagetier-Malaria-Arten, Unterschiede umfassen die Nagetierarten und Stamm, die am anfälligsten für infektiöse Sporozoit-Inokulation sind, die Anzahl der Sporozoiten für die Impfung in einem anfälligen Nagetierstamm benötigt, Säugetierzelltypen für In-vitro-Leberstadium-Entwicklungstests benötigt, und die Zeit, um Leberstadium Entwicklungabzuschließen 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

Trotz dieser Variabilitäten waren Nagetier-Malariaparasiten schon früh die günstigen Modelle für die Anwendung von umgekehrten genetischen Ansätzen, da sie mit einer hohen Erfolgswahrscheinlichkeit weniger zeit- und ressourcenschonend waren31. Tatsächlich waren Nagetier-Malaria-Modelle die besten Modelle und in vielen Fällen die einzigen Modelle, die seit vielen Jahren zur funktionellen Charakterisierung von Genen in Mücken- und Leberstadien zur Verfügung stehen.

Angesichts der Popularität und Amenability von umgekehrten genetischen Ansätzen in Nagetier-Malaria-Modellen wurden eine Reihe verschiedener Methoden verwendet, um die Phänotypen der transgenen Parasiten-Lebenszyklusstadien, insbesondere der Blutstadien, zu analysieren. Einige dieser Methoden sind jedoch inkonsistent; zum Beispiel, Vergleich von Infektionen von Blut-Stadium Parasiten nach einer IP-Injektion (die möglicherweise auf die peritonealen Lymphknoten abgelassen werden und von dort aus in den Blutkreislauf gelangen können; daher landen die injizierten Parasiten nicht gleichmäßig im Blutkreislauf) , Vergleich der Mückenübertragung von Klonen mit einer unterschiedlichen Anzahl von seriellen Blutstufenübertragungen oder G-Nummern (die die Gametozytogenese32,33beeinflussen könnten), oder vergleicht transgene Parasiten direkt mit naivem Wildtyp (WT) Parasiten, die nie einer Elektroporation und positiven Medikamentenauswahl und den verschiedenen nicht standardisierten Bewertungen der männlichen Gamete-Exflagellation unterzogen wurden. Daher ist es wichtig, Protokolle zu standardisieren, die für die phänotypische Analyse jeder Art von transgenen oder WT Nagetier-Malariaparasiten im Blut und in der Mücke einfach zu befolgen sind, um die biologischen Variabilitäten der Nagetier-Malaria zu berücksichtigen. Parasitenarten.

Hierin berichten wir über ein standardisiertes, detailliertes Versuchsprotokoll zur phänotypischen Analyse der Blut- und Mückenlebenszyklusstadien von transgenen oder wilden P. yoelii- und P. berghei Parasiten. Diese Protokolle gelten auch für Parasiten von P. chabaudi und P. vinckei.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden nach den genehmigten Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Tulane University und der Tierethikkommission der Bezmialem Vakif University durchgeführt. Alle anderen experimentellen Protokolle und die Verwendung von rekombinanter DNA wurden nach den genehmigten Protokollen des Institutional Biosafety Committee (IBC) der Tulane University durchgeführt.

1. Infektion von Mäusen mit blutenden Parasiten für Parasitenanalyse und Mückeninfektion Assays

  1. Tag -3: optionale Injektion von Phenylhydrazin in Empfängermäuse
    1. Injizieren Sie ausgezüchtete SW- oder CD1-Empfängermäuse (Mäuse, die für Mückeninfektionen und Mückeninfektions-Assays verwendet werden) intraperitoneal (IP) mit 100 l Phenylhydrazin (50 mg Phenylhydrazin in 5 ml 1x phosphatgepufferter Saline (PBS)) mit einer 26 G Nadel spritze.
      HINWEIS: Bei robusten Mückeninfektionen von P. berghei und P. yoeliiwird Phenylhydrazin verwendet, um Eine Retikulozytose bei den Empfängermäusen zu induzieren, was die Parasitenundinämie und in der Folge den Prozentsatz der Gametozyten erhöht und erhöht die Exflagellation männlicher Gameten (Abbildung 5), was zu einer besseren Infektion mit Denkbecken und P. Yoelii-Stämmen 15,16,17führt, was zu einer besseren Infektion mit den Mückenstadien führt. 18.
  2. Tag -2: Injektion von gefrorenen Parasitenbeständen in Spendermäuse
    1. Schnell auftauen kryokonservierte gefrorene Bestände und injizieren sofort jede Spendermaus (in der Regel zwei Mäuse pro Genotyp) IP mit 200 L Desatole mit einer 26 G Nadelspritze.
      HINWEIS: Nicht mehr als fünf Mäuse sind pro Käfig in kontrollierten Vivarium-Einstellungen untergebracht.
    2. Beginnen Sie mit der Überprüfung der Parasitenmie unter einem 100-fachen Mikroskopobjektiv auf Giemsa-gefärbtem dünnen Blutabstrich nach 24 h Nachinfektion. Folgen Sie Abschnitt 2.1 des Protokolls für Giemsa-gefärbte dünne Blutabstriche.
      HINWEIS: Aufgrund der Unfähigkeit, die überlebenden lebensfähigen Blutstadien nach dem schnellen Auftauen und Injizieren von kryokonserviertem infiziertem Blut genau zu zählen, erhalten Spendermäuse zuerst das kryokonservierte Blut. Die infizierten Erythrozyten der Spendermaus können genau quantifiziert und anschließend verwendet werden.
  3. Tag 0: Blutung der Spendermäuse
    1. Bluten Sie die Spendermäuse (siehe Abschnitt 3.1), wenn ihre Parasitenzwischen 0,1% und 1% liegt, was in der Regel 2-3 Tage nach der gefrorenen Stockinfektion im Falle von P. yoelii 17X-NL und P. berghei ANKA-Stämmen erreicht wird.
    2. Verwenden Sie die Gesichtsvenenpunktion (um zwischen 200 und 500 l zu erhalten), oder bluten Sie die Tiere durch Herzpunktion (um zwischen 600 l und 1,2 ml) infiziertem Blut zu erhalten. Die Mäuse durch Herzpunktion, wie in Abschnitt 3.1 ausführlich beschrieben, bluteten.
      HINWEIS: Gesichtsvenenblutungen sind keine routinemethode zur Gewinnung von Blut, da es viel schwieriger anzuwenden ist und für Mäuse sehr belastend ist, im Vergleich zu tödlichen Blutungen. Die optimale Parasitenart für die Blutung von Spendermäusen liegt zwischen 0,1%-1%, da es in diesem Parasitenbereich nur sehr wenige Gametozyten gibt (die sich nicht vermehren können, um asexuelle Blutstadien zu produzieren) und es weniger doppel- oder dreifach infizierte Erythrozyten (die macht die Quantifizierung weniger genau).
  4. Tag 0: Quantifizierung des infizierten Blutes zur Vorbereitung von Dosen infizierter Erythrozyten durch serielle Verdünnungen
    1. Bereiten Sie serielle Verdünnungen des Spenderblutes vor, indem Sie einem Mikrozentrifugenröhrchen 100 l Blut hinzufügen (Verdünnungsröhre 1). Fügen Sie 900 L RPMI Medium zu Rohr 1 hinzu und mischen Sie gut, indem Sie mit der gleichen Pipettenspitze nach oben und unten pfeifen, wodurch eine Verdünnung von 1:10 entsteht.
    2. Nehmen Sie 100 l des verdünnten Blutes aus Tube 1 und fügen Sie es einem neuen Mikrozentrifugenrohr (Verdünnungsröhre 2) hinzu. Fügen Sie 900 L RPMI Medium zu Tube 2 hinzu und mischen Sie gut, indem Sie mit der gleichen Pipettenspitze nach oben und unten pfeifen, wodurch eine Verdünnung von 1:100 entsteht.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2, um zwei weitere serielle Verdünnungen vorzunehmen, wodurch 1:1.000 (Verdünnungsrohr 3) und 1:10.000 Verdünnungen (Verdünnungsröhre 4) entstehen.
    4. Fügen Sie 12 l verdünntes Blut aus Tube 3 und 12 L verdünntes Blut aus Tube 4 zu verschiedenen Seiten eines Hämozytometers hinzu und bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Erythrozyten auf jeder Seite des Hämozytometers. Multiplizieren Sie diese Zahlen mit 10. Multiplizieren Sie diese Zahlen mit dem Verdünnungsfaktor 1.000 bzw. 10.000, um die Anzahl der Erythrozyten in 1 l jeder Verdünnung zu bestimmen.
    5. Teilen Sie die gewünschte Anzahl infizierter Erythrozyten, die injiziert werden sollen, durch die Anzahl der Erythrozyten in 1 l jeder Verdünnung, um das Volumen des verdünnten Spenderblutes zu bestimmen, das für die Injektion erforderlich ist. Wählen Sie die Verdünnung mit dem am besten geeigneten Injektionsvolumen, fügen Sie das Volumen einem neuen Mikrozentrifugenrohr hinzu und vervollständigen Sie es mit RPMI-Medium auf 120 l.
  5. Tag 0: intravenöse Injektion der Empfängermäuse
    1. Legen Sie die Empfängermäuse unter eine wärmerote Lampe, um ihre Venen zur Injektion zu verdünnen. Die Parasitendosen in eine 27 G Insulinspritze geben und die Empfängermaus in ein Restrainer legen.
    2. Injizieren Sie 1 Million oder 10.000 infizierte Erythrozyten intravenös (IV) mit der 27 G Insulinspritze in jeder Empfängermaus für Mückeninfektionstests bzw. für asexuelle und sexuelle Wachstumstests im Blutstadium. Halten Sie die Mäuse unter standarden Gehäusebedingungen aufrecht.
      HINWEIS: Eine IP-Injektion ist eine indirekte Methode zur Einschleppung von Parasiten in den Blutkreislauf, da parasitierte Erythrozyten durch die entwässernden Lymphknoten der Peritonealhöhle gehen müssen, um ins Blut zu gelangen. Dies macht eine IP-Injektion zu einem indirekten Verabreichungsweg für die Injektion einer genauen Anzahl von Parasiten in den Blutkreislauf. Daher wird die IV-Route bevorzugt, da sie genaue Parasitendosen direkt in den Blutkreislauf liefert, wie in Abbildung 3 dargestellt und in den repräsentativen Ergebnissenbeschrieben.

2. Bestimmung der blutenden Parasitenlast für sexuelle und asexuelle Stadien

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden standardisierte phänotypische Bewertungsmethoden von Malariaparasiten-Blutstadien aufgeführt. Diese Methoden sind nützlich bei der Bewertung neuartiger Malaria- oder Impfstoffkandidaten oder sogar genknockout auf sexuelle und asexuelle Stadien Entwicklung in den gleichen experimentellen Mäusen. Bemerkenswert sind auch P. chabaudi und P. vinckei, die sehr rational und wichtige alternative Optionen für diese Arten von Assays sind, insbesondere bei der Drogenvorsorge.

  1. Bestimmung der Parasitenvonatik asexueller Stadien und männlicher vs. weiblicher Gametozyten durch Giemsa-gefärbte dünne Blutabstriche für Parasitenwachstumstests
    1. Mit einer 26 G- oder 27-G-Nadel stechen Sie in den Schwanz der Maus und sammeln Sie das Bluttröpfchen auf einem Mikroskopschlitten. Verwenden Sie die kurze Kante eines anderen Mikroskopschlittens, um das Blut schnell über die Folie zu schmieren.
    2. Fixieren Sie die Rutsche mit 100% Methanol für mindestens 1 min, erst nachdem das Blut vollständig auf der Rutsche getrocknet ist. 10-15 min in 10- bis 15 min. In 10-15 min. In 10-15 min. Färben Sie die Rutsche mit ein- oder doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie sie trocknen.
    3. Lesen Sie die Folie mit einem 100-fachen Objektiv- und Öleintauchen unter einem Lichtmikroskop. Für eine genaue Parasitenmessung können mindestens 6.000 Erythrozyten überprüft werden, die durch Zählen von mindestens 30 oder 40 mikroskopischen Gittern mit einer durchschnittlichen Anzahl von 200 bzw. 150 Erythrozyten (RBCs) pro Raster erhalten werden können. Zählen Sie die Gesamtzahl der RBCs im ersten und letzten Raster, um die durchschnittliche Anzahl roter Blutkörperchen für alle Gitter zu bestimmen.
    4. Zählen Sie die Gesamtzahl der infizierten Erythrozyten pro Raster. Männliche und weibliche Gametozyten können getrennt gezählt werden, um Gametozytämie zu bestimmen, sollten aber auch in die Gesamtparasitenanzahl einbezogen werden.
    5. Bestimmen Sie den gesamtparasiten Prozentsatz, indem Sie die Gesamtzahl der parasitierten Erythrozyten durch die Gesamtzahl der beobachteten RBCs dividiert. Multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um den Parasitenanteil zu bestimmen.
    6. Bestimmen Sie die Gametozytämie, indem Sie die Gesamtzahl der Gametozyten, die durch die Gesamtzahl der beobachteten RBCs gezählt werden, dividiert. Multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, um den Prozentsatz der Gametozytämie pro Maus zu bestimmen.
      HINWEIS: Die einzige zuverlässige Methode zur Differenzierung zwischen verschiedenen asexuellen und sexuellen Blutstadien ist die Verwendung eines Mikroskops zur Bewertung von Giemsa-gefärbten dünnen Blutabstrichen, da jede der Stadien unterschiedliche Morphologien hat, mit Ausnahme von unreifen Gametozyten, die sind meist nicht von asexuellen Blutstadien zu unterscheiden.
  2. Bestimmung der Blutstadiumsparasitemie durch Durchflusszytometrie für fluoreszierende Reporterprotein-exzierende WT-ähnliche Parasitenstämme
    1. Beschriften Sie zwei Mikrozentrifugenrohre für jede Mausprobe, wobei ein Rohr für eine Verdünnung von 1:1.000 und das andere für eine Verdünnung von 1:2.000 rohriert wird. Fügen Sie dem Verdünnungsrohr 1,5 l von 1x Heparin hinzu.
    2. Mit einer 26 G oder 27 G Nadel den Schwanz der Maus stechen und 1,5 l Blut in die Röhre geben, die 1,5 l 1x Heparin (das 1:1.000 Verdünnungsrohr) enthält. Mischen Sie das Blut und das 1x Heparin sanft miteinander, indem Sie auf und ab pfeifen.
    3. Fügen Sie dem Mikrozentrifugenrohr 1.497 L RPMI-Medium hinzu und pipette sanft nach oben und unten, um sie gut zu mischen.
    4. Übertragen Sie 500 l des Gemischs aus dem 1:1.000 Verdünnungsrohr auf das Verdünnungsrohr von 1:2.000. Fügen Sie dem 1:2.000-Rohr 500 l RPMI-Medium hinzu und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie nach oben und unten pfeifen.
    5. Befolgen Sie das entsprechende Anlaufprotokoll des Herstellers für das Durchflusszytometer. Führen Sie die Samples mit einer langsamen Durchflussrate aus, und legen Sie die Erkennung für mindestens 20.000 Ereignisse fest.
      HINWEIS: Es gibt einen alternativen praktischen Test, um Parasiten über die trikolore FACS-Sortierung zu messen, ob Parasiten fluoreszierende Marker ausdrücken oder nicht34. Der hier beschriebene Test bietet jedoch ein genaues Maß an Parasitemie bei lebenden Parasiten ohne Zugabe von DNA-bindenden Farbstoffen und die Verwendung von FACS-Sortierung.
  3. Bestimmung der Exflagellationsrate männlicher Gameten pro Mikroliter infiziertem Mausblut
    1. Bereiten Sie ein 1:10 Verdünnungsmikrozentrifugenrohr mit 40 l unvollständigem ookinetem Medium (RPMI + Natriumbicarbonat + Hypoxanthin + Xanthurensäure) und 5 l 1x Heparin vor.
    2. Mit einer 26 G oder 27 G Nadel, stechen Sie den Schwanz der Maus und übertragen Sie 5 L Blut (mit einer Mikropipette) schnell in die Röhre mit dem unvollständigen ookinete Medien + Heparin. Mischen Sie die 12 l des 1:10 Blutverdünnungsrohrs vorsichtig auf ein Hämozytometer und lassen Sie es bei Raumtemperatur (20-24 °C).
    3. Beginnen Sie mit der Zählung der Exflagellation-Ereignisse 9-10 min nach der Vorbereitung der 1:10 Verdünnung. Verwenden Sie ein Phasenkontrastlichtmikroskop mit 40-facher Vergrößerung.
    4. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der mit 10 gezählten Exflagellationsereignisse und multiplizieren Sie sie dann mit dem Verdünnungsfaktor (10), um die durchschnittliche Anzahl der Exflagellation pro Mikroliter infizierten Blutes zu bestimmen.
      HINWEIS: Dieser Test misst die Anzahl der männlichen Gamet-Exflagellationsereignisse in einem Blutvolumen von 1 L, das mit einem Hämozytometer quantifiziert werden kann. Ein unvollständiges ookinete Medium18 wird mit dem Blut gemischt, um die Bedingungen, unter denen exflagellation innerhalb des Mückenmittelguts kurz nach einer Blutmahlzeit auftritt, genau nachzuahmen.

3. Isolierung und Verarbeitung von Blutparasiten aus infizierten Erythrozyten und gefrorener Lagervorbereitung

  1. Terminale Blutung ensachierter Nagetiere durch Herzpunktion
    1. Bereiten Sie eine 26 G Nadelspritze vor, die ca. 20 L Heparin (200 Einheiten/ml) enthält, um das Blut der Spendermaus durch Herzpunktion zu sammeln.
    2. Verwenden Sie einen langsamen Co2-Fluss, um die Maus vor dem Ausbluten einzuschläfern. Alternativ, beästhesieren Sie die Maus mit Isofluran (die vor und während des Hautschnitts gepflegt werden muss, um das Herz zu belichten).
    3. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie ihre Anhänge. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut in der Nähe der Basis des Brustbeins, indem Sie die Haut mit Zange hochziehen und mit einer Schere schneiden. Ziehen Sie die Haut an der Stelle des Einschnitts auseinander, um das Zwerchfell und die Oberseite der Bauchhöhle freizulegen.
    4. Halten Sie die Basis des Rippenkäfigs mit Zangen und schneiden Sie durch das Zwerchfell, um in die Brusthöhle zu gelangen; achten Sie darauf, das Herz oder die Lunge nicht zu beschädigen. Stecken Sie den Rippenkäfig zurück, um das Herz freizulegen.
    5. Das Herz sanft durchstechen und langsam auf den Spritzenkolben ziehen, um 1 ml Blut zu sammeln und in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen.
  2. Vorbereitung von gefrorenen Vorräten aus infiziertem Blut
    1. Bluten Sie die Mäuse (siehe Abschnitt 3.1) mit Blutparasitemien, die zwischen etwa 2% und 5% liegen, mit einer signifikanten Menge an Ringstadien und nicht so viele Gametozyten.
    2. Mischen Sie den gewünschten Blutanteil mit Gefrierlösung (10% Glycerin in Alsever-Lösung) im Verhältnis 1:2 und lagern Sie in kryogenen Durchstechflaschen. In flüssigem Stickstoff einfrieren.
  3. Isolierung und Reinigung von Blutstadiumparasiten zur Extraktion von DNA, RNA und Proteinen
    1. Blutmäuse (siehe Abschnitt 3.1) mit Blutparasitemien, die höher als 0,5% sind.
    2. Bereiten Sie eine 10 ml Spritze vor, indem Sie den Kolben entfernen und einen kleinen Wattestäbchen einlegen. Die Baumwolle auf den Boden der Spritze einpacken. Füllen Sie es mit Zellulose, bis der Cellulosespiegel die 3 ml-Marke erreicht, aber die 4 ml-Marke auf der Spritze nicht überschreitet.
    3. Befestigung der Spritze in einem Clip auf einem Ringständer und legen Sie ein Abfallsammelrohr darunter. Fügen Sie der Spritze 5 ml PBS hinzu und lassen Sie sie in das Abfallrohr fließen.
    4. Bereiten Sie gefrorene Vorräte bei Bedarf vor, mit nur 100-300 l Blut. Fügen Sie den Rest des infizierten Blutes (400-700 l) in die Spalte. Sammeln Sie den Durchfluss mit einem Abfallrohr, bis die Tröpfchen rot zu werden beginnen. Sobald die Tröpfchen rot zu werden beginnen, legen Sie ein neues 14-ml-Sammelrohr unter die Spritze, um den Durchfluss zu sammeln.
    5. Sobald sich der Durchfluss verlangsamt, fügen Sie der Spritze PBS hinzu und sammeln Sie den Durchfluss im 15 ml-Rohr, bis ein Gesamtvolumen von 14 ml erreicht ist. Sammeln Sie den verbleibenden Durchfluss mit einem Abfallrohr.
    6. Zentrifugieren Sie das 14 ml-Rohr mit Blut/PBS-Mischung für 8 min bei 250 x g ohne Bremsen. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 14 ml gekühltes Saponin (50 mg Saponin in 50 ml PBS) hinzu. Um das Pellet zu lösen, invertieren Sie das Rohr mehrmals und Wirbel, wenn nötig.
    7. Zentrifugieren Sie das Rohr für 8 min bei 1.217 x g ohne Bremsen. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie etwa 0,5 ml der Lösung über dem Pellet.
    8. Setzen Sie das Pellet in der Lösung mit einer Mikropipette wieder auf und übertragen Sie es in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie dem 14 ml-Rohr 500 l PBS hinzu, um alle Restparasiten zu waschen, die im Rohr verbleiben. Fügen Sie dies in das gleiche Mikrozentrifugenrohr.
    9. Zentrifugieren Sie das Rohr für 2 min bei 6.010 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie 1 ml PBS wieder auf. Zentrifuge für 2 min bei 9.391 x g.
    10. Fahren Sie fort, genomische DNA, gesamte RNA und Protein zu extrahieren.
      1. Für die genomische DNA-Extraktionentfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 L PBS wieder aus, und folgen Sie dann jedem geeigneten Protokoll der gDNA-Extraktion.
      2. Für die gesamte RNA-Extraktion,entfernen Sie den Überstand, resuspendieren und wirbeln Sie das Pellet in 1 ml einer beliebigen Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-basierten Lösung oder eines anderen geeigneten Reagenzes und folgen Sie dann jedem geeigneten Protokoll der gesamten RNA-Extraktion.
      3. Für die gesamte Proteinextraktionentfernen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen von 6x Natriumdodecylsulfat (SDS)-Ladefarbstoff oder einem anderen geeigneten Reagenz wieder auf und folgen Sie dann jedem geeigneten Protokoll der gesamten Proteinverarbeitung.

4. Mosquito Infection Assays

HINWEIS: Die Mücke ist der Hauptwirt der Malariaparasiten, wo die sexuelle Fortpflanzung stattfindet. Die Infektion von Mäusen, Malariaparasiten auf Mücken zu übertragen, wird durch eine IV-Injektion von mindestens 1 Million Blutstufen durchgeführt, gefolgt von der Fütterung einer infizierten Maus (von jedem Genotyp, der die höchste männliche Gameten-Exflagellationsrate anzeigt) Anopheles Mücken in einem Käfig an Tag 3 post-Maus-Infektion. Die IV-Injektion mit 1 Million blutverachtenden Parasiten bei mit Phenylhydrazin behandelten Mäusen wird die Entwicklung von männlichem und weiblichem Gametozyten schneller und höher sicherstellen. Mit P. yoelii und P. berghei infizierte Mücken werden bei 24 °C bzw. 20-21 °C inkubiert, um die bestmögliche Mückenstadien Entwicklung zu ermöglichen6.

  1. Mückenfütterung und Bestimmung der Anzahl der Ookinete pro Mücke
    1. Verhungern Erwachsene weibliche Anopheles stephensi oder A. gambiae Mücken (4-7 Tage alt) für 8-12 h vor der Fütterung. Lassen Sie erwachsene Mücken für mindestens 15 min von den infizierten anästhesierten Mäusen (injiziert mit einer angemessenen Dosis Ketamin/Xylazin) mit der höchsten Exflagellationsrate (gemessen in Abschnitt 2.3) füttern.
      HINWEIS: Die Ketamin/Xylazin-Arbeitslösung wird durch die 1:5-Verdünnung der Stammlösung in Kochstoff- und IP-Injektion von 100 l pro Maus hergestellt. Bei einer 10 ml-Stammlösung werden 1 ml Xylazin (100 mg/ml) zu 9 ml Ketamin (100 mg/ml) hinzugefügt.
    2. Entfernen Sie ungeernährte weibliche Mücken und männliche Mücken mit einem Mundsauger.
    3. Um 18-20 h Nachfütterung, sammeln 20-30 Mücken und legen Sie sie in den Gefrierschrank für nicht weniger als 10 min, um den Tod zu gewährleisten. Mit Hilfe eines binokularen Sesektionsbereichs 20-30 blutgefüllte Mittelguts mit zwei 26 G oder 27 G Nadeln oder einer Nadel und Zange in RPMI- oder PBS-Dissektionsmedium zu sezieren und die Mittelguts in ein Mikrozentrifugenrohr mit 200 l RPMI oder PBS (Für Die Seziermethode) zu übertragen. siehe Abschnitt 4.3).
    4. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr für 1 min bei 700 x g. Schleifen Sie die pelleted Midguts mit einem Stößel. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    5. Übertragen Sie 50 l aus dem Rohr der gemahlenen Mittelguts auf ein neues Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 200 L RPMI oder PBS hinzu, um eine Verdünnung von 1:5 zu erstellen.
    6. Übertragen Sie 12 L auf ein Hämozytometer und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 5 min, damit sich der Inhalt absetzen kann.
    7. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl von Ookineten mit einem Lichtmikroskop mit Phasenkontrast und 40-facher Vergrößerung.
    8. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der reifen Ookinete mit 10 und dann mit dem Verdünnungsfaktor 5, um die durchschnittliche Gesamtzahl der Ookinete zu bestimmen.
    9. Teilen Sie die durchschnittliche Anzahl der Ookinete durch die Anzahl der blutgefütterten Mücken, die seziert werden, um die Anzahl der Ookinete pro blutgefütterter Mücke zu bestimmen.
  2. Bestimmung der Anzahl der frühen Oozysten für fluoreszierende Reporterprotein-exzierende WT-ähnliche Parasitenstämme
    HINWEIS: Das Ziel dieses Assays ist es, die Anzahl der lebenden Parasiten zu bestimmen, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) exdrücken, die eine vollständige Infektion der Mückenmittelguts etablierten und frühe sphärische Oozysten bildeten. Dieser Test bestimmt, ob die Ookinete (ihre Entwicklung im vorherigen Assay geschätzt) ihre Funktionen durch die Durchquerung der Mückenmitteldarm-Epithelzellen und die Umwandlung in frühe Oozysten auf der Basal-Lamina-Seite des Midguts abgeschlossen haben. Epithelie oder nicht. Dies ist ein weiterer Test, der große Verwendung der Parasiten, die GFP ausdrücken, da das Zählen von frühen Oozysten in diesem Stadium wird fast unmöglich sein, ohne mühsame Immunostaining.
    1. Sezieren Sie die Mittelguts (siehe Abschnitt 4.1) von 20-30 blutgefütterten Mücken, an Tag 3 oder 4 nach der Mückenfütterung (pmf) für P. yoelii 17X-NL und an Tag 6 oder 19 Uhrf für P. berghei ANKA, mit zwei 26 G oder 27 G Nadeln oder einer Nadel und Zangen in RPMI oder PBS-Sektion m edium (Für die Seziermethode siehe Abschnitt 4.3).
    2. Verteilen Sie 40-50 l Dessektionsmedium auf der horizontalen Mittellinie der längeren Kante des Glasschlittens. Übertragen Sie die Mittelguts auf diese Linie, eine nach der anderen, während der Zerlegung, und fügen Sie mehr Medium zu den Midguts, wenn nötig, um zu vermeiden, auszutrocknen.
    3. Legen Sie einen Deckelrutsch sanft auf die sezierten Mittelguts und versiegeln Sie ihn mit Nagellack.
    4. Mit dem 10x oder 20x Objektiv des Fluoreszenzmikroskops mit dem grünen Fluoreszenzfilter zählen Sie die Anzahl der frühen Oozysten auf jedem Mittelgut, in mindestens 20 Midguts.
  3. Bestimmung der Anzahl der Oozystensporozoiten pro Mücke
    1. Sezieren Sie die Mittelguts von mindestens 20-30 Stechmücken mit zwei 26-G- oder 27-G-Nadeln oder einer Nadel und Zange im RPMI- oder PBS-Sektionsmedium und sammeln Sie die sezierten Midguts in 200 l RPMI.
    2. Halten Sie die Unteren Bauchsegmente mit einer Nadel (oder Zange) fest an Ort und Stelle und drücken Sie den Thorax leicht nach oben mit der anderen Nadel an der Kreuzung zwischen Thorax und Bauch. Machen Sie vorsichtig kurze Drücke, bis sich der Thorax vom Bauch trennt. Sobald die Trennung beginnt, erscheint das weiße Mittelgut gestreckt, und dann wird das Midgut vom Speiseröhrenende mit der gleichen Nadel geschnitten, die verwendet wurde, um den Thorax zu trennen. Wenn immer noch am Bauch befestigt, kann die gleiche Nadel verwendet werden, um das Mittelgut vom Bauch wegzuziehen. Übertragen Sie die Mittelguts aller Mücken auf das Sammelrohr, indem Sie sie mit einer Nadel nacheinander vom Medium abholen.
    3. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr für 1 min bei 700x g, um die Mittelguts auf den Boden des Sammelrohres zu legen und mit einem Stößel zu mahlen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
    4. Übertragen Sie 12 L auf ein Hämozytometer und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für 5 min, damit sich sein Inhalt absetzen kann.
    5. Zählen Sie die Oozystensporozoiten mit einem 40-fachen Objektiv eines Lichtmikroskops. Verwenden Sie 1:5 und/oder 1:10 Verdünnungen, wenn Mückenreste die genaue Zählung der Sporozoiten verhindern oder wenn die Anzahl der Sporozoiten zu hoch ist, um genau zu zählen.
    6. Berechnen Sie die durchschnittliche Gesamtzahl der Oozystensporozoiten, indem Sie die durchschnittliche Anzahl der Sporozoiten mit 10 multiplizieren und diese Zahl dann mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren, falls vorhanden, und mit dem Gesamtvolumen (200 L).
    7. Teilen Sie die durchschnittliche Gesamtzahl der Sporozoiten durch die Anzahl der sezierten Stechmücken, um die durchschnittliche Anzahl der Oozystensporozoiten pro Mücke zu berechnen.
      HINWEIS: Ein häufiger Fehler bei der Messung des Erfolgs oder der Produktivität von Mückenstadien Infektion ist die Zählung der Anzahl der Oozysten in späteren Stadien der Oozystenentwicklung. Dies ist darauf zurückzuführen, dass einige Oozysten zu späteren Zeitpunkten der Oozystenentwicklung vakuoliert werden, und andere nicht sporozoite entwickeln, sogar auf dem gleichen Mittelgut. Die beste und zuverlässigste Methode zur Bestimmung der Produktivität der Infektion mit Mückenstadien ist die Zählung der durchschnittlichen Anzahl von Mittelgut-Oozystensporozoiten an den Tagen 10-12 nach der Mückeninfektion für P. yoelii und an den Tagen 12-14 Post-Mücken-Infektion für P. berghei.
  4. Bestimmung der Anzahl der Speicheldrüsensporozoiten pro Mücke
    notiz:Die endgültige Bewertung der vollständigen Fertigstellung der Entwicklung von Mückenstadien wird durch die Schätzung der Anzahl der Sporozoiten erreicht, die in die Speicheldrüse eingedrungen sind, die die übertragbaren und infektiösen Stadien für Wirbeltiere sind. Die Invasion der Speicheldrüse wird nach Abschluss der Oozysten-Sporozoit-Entwicklung, Ausgang in die Hämolymphe, Anhaftung an der Basallamina der Speicheldrüsenzellen und Durchquerung der Acinarzellen, um die Speicheldrüsen zu erreichen etabliert Kanäle5. Daher ist dieser Test auch eine Bewertung des Erfolgs all dieser Prozesse oder nicht. Nichtsdestotrotz würde eine Schätzung der Hämolymph-Sporozoit-Zahlen die Unterscheidung zwischen Defekten im Ausgang von Oozysten und Defekten bei der Invasion von Speicheldrüsen ermöglichen.35. Die Reinigung von Speicheldrüsensporozoiten ermöglicht die Durchführung mehrerer funktioneller Tests auf Sporozoit-Motilität und Invasionsphänotypen. Die Speicheldrüsensporozoiten können auch für die In-vivo-Infektion von Mäusen und in Impfstudien verwendet werden36,37. Darüber hinaus sind die reproduzierbarsten Stadien, die zur Verfügung stehen, um eine In-vitro-Leberstadium-Invasion oder einen Entwicklungstest zu etablieren, durch die Verwendung von Speicheldrüsensporozoiten.
    1. Sezieren Sie die Speicheldrüsen von 50-100 weiblichen Mücken, an den Tagen 14-16 pmf für P. yoelii und an den Tagen 17-20 pmf für P. berghei, vorzugsweise mit zwei 26 G oder 27 G Nadeln, in RPMI oder DMEM Medium auf Eis gehalten und ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) oder/bovines Serumalbumin (BSA) für P. yoelii sporozoites oder 3% FBS/BSA für P. berghei sporozoites. Wenn die Sporozoiten in Hepatom-In-vitro-Assays verwendet werden sollen, fügen Sie dem Dissektionsmedium 1% Penicillin/Streptomycin hinzu. Es gibt in der Regel zwei Methoden für die Zerlegung der Speicheldrüsen. Die erste Methode ist zeitaufwändig, führt aber zur Zerlegung von Speicheldrüsen mit sehr wenig oder gar keinem kontaminierenden Gewebe. Die zweite Methode ist weniger zeitaufwändig, führt aber zur Sammlung einer erheblichen Menge an kontaminierenden Geweben. Die erste Methode wird hier ausführlich beschrieben.
    2. Halten Sie die oberen Bauchsegmente mit der abgeschrägten Seite einer Nadel an Ort und Stelle und drücken Sie den Kopf vorsichtig sehr leicht (in sehr kurzen Drücken) an der Kreuzung zwischen Kopf und Thorax in aufwärts gerichteter Richtung, bis der Kopf vorsichtig vom Thorax getrennt wird, ohne Die freiliegenden Speicheldrüsen werden dann mit derselben Nadel, die den Kopf nach oben geschoben hat, vom Kopf getrennt.
    3. Die sezierte Speicheldrüse wird mit einer kurzen Glaspasteurpipette aus dem Seziermedium gehoben.
    4. Wenn alle Speicheldrüsen seziert und geerntet wurden, wird das Talent die Röhre mit den Mittelguts in die Zentrifuge (1min, 700 x g) legen.
    5. Zählen Sie Sporozoite mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop, das auf Phase 2 Kontrast und 40-fache Vergrößerung eingestellt ist. Wenn die Anzahl der Mücken seziert 40, verdünnen Sie die Speicheldrüsen auf 1:5 oder 1:10, abhängig von der erwarteten Infektiositätsausbeute (in früheren Tests bestimmt).
    6. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Sporozoiten mit 10 und den Verdünnungsfaktor (falls vorhanden). Multiplizieren Sie mit dem Gesamtvolumen, um die durchschnittliche Anzahl der Speicheldrüsensporozoiten zu bestimmen. Dividieren Sie durch die Anzahl der sezierten weiblichen Mücken, um die durchschnittlichen Speicheldrüsensporozoiten pro Mücke zu bestimmen.
      HINWEIS: Das Problem mit der Zerlegung der Speicheldrüsen ist ihre geringe Größe und glasiges transparentes Aussehen. Daher ist es sehr schwierig, die Speicheldrüsen zu isolieren und daher werden sie in der Regel als Pauschale mit anderen Geweben aus dem frontalen Teil des Thorax seziert, was auch wichtig ist, um die Speicheldrüsen während der Entnahme vor einem Bruch zu schützen.

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Representative Results

Der Erfolg der Anwendung von reverse genetischen Werkzeugen und Techniken auf Malariaparasiten hat den Bereich der Malariaforschung revolutioniert, mit der Fähigkeit, spezifische genomische Segmente mehrerer Plasmodium-Arten hinzuzufügen, zu löschen oder zu modifizieren39. Wichtig ist, dass entbehrliche genomische Loci identifiziert und erfolgreich zur Einführung von Fluoreszenzproteinmarkern bei Nagetieren und menschlichen Malariaparasiten durch doppelte homologe Rekombination eingesetzt wurden, um eine stabile Expression in allen Lebenszyklusstadien zu gewährleisten40 ,41,42. Ein Beispiel für diese WT-ähnlichen transgenen Parasiten sind Py230p(-) Parasiten, die in unserem Labor erzeugt wurden und keinen offensichtlichen Defekt in der Entwicklung von Blut- und Mückenlebenszyklusstadien15,16, 17. Diese transgenen Reporterparasiten drückten eGFP aus, unter der Kontrolle des starken und konstitutiven Förderers von PyHSP70,in Blutstadien (Abbildung 1A) Ookinete (Abbildung 1B), junge Oozysten (Abbildung 1C ) auf Anopheles stephensi midguts, und in Sporozoiten isoliert aus den Speicheldrüsen der Anopheles stephensi Weibchen (Abbildung 1D). So machten es die eGFP-exemittierten Blutparasiten viel einfacher und weniger zeitaufwändig, die Parasiten im Blutstadium mit Flusszytometrie zwischen verschiedenen Genotypen transgener Parasiten oder zwischen medikamentös behandelten und -unbehandelten Assays mit transgenen Reporterparasiten.

Um zu bestätigen, dass es keinen quantitativen Unterschied zwischen der Verwendung der Durchflusszytometrie und der mühsameren Parasitenschätzung durch Mikroskopie gibt, wurde das eGFP-exektionierte Pyp230p(-) verwendet, um den Prozentsatz der parasitierten Erythrozyten Flusszytometrie und durch Giemsa-gefärbtes dünnes Blutabstrich in einer Gruppe von Schweizer Webster-Mäusen IV-infiziert mit 10.000 parasitierten Erythrozyten. Die Werte für die Durchflusszytometrie Parasiten% entsprachen direkt dem geschätzten Parasiten- %, indem Sie Giemsa-gefärbte dünne Blutabstriche überwachten, die von zwei Experten geschätzt wurden (Abbildung 2). Dies stellt eine genauere Alternative zur mühsamen und anfälligen Methode der Mikroskopie bei der Bestimmung der Wachstumsrate von Blutstadiumparasiten dar.

Eine wichtige Diskrepanz im Zusammenhang mit der Infektion von Nagetieren mit Malariaparasiten Blutstadien ist die Wahl des Weges der Infektion, mit einer starken Präferenz in der Literatur für die IP im Vergleich zu IV-Route der Infektion, da es weniger zeitaufwändig ist. Um diese beiden Infektionswege zu vergleichen, wurden zwei Gruppen von fünf BALB/c-Mäusen mit 1.000 eGFP-exezierenden Pyp230p(-) parasitierten Erythrozyten pro Maus infiziert, entweder über IV- oder IP-Routen. Die Parasitenmia wurde täglich mit Flusszytometrie für einen Zeitraum von 4 Tagen überwacht. An allen getesteten Tagen wurde eine statistisch signifikante Abnahme der IP-infizierten Gruppe Parasitemie% im Vergleich zur IV-infizierten Gruppe festgestellt (Abbildung 3). Dies liefert Beweise dafür, dass der IV-Infektionsweg ein quantitativ genauerer Infektionsweg für Assays mit den Malariaparasiten-Blutstadien ist.

Nichtsdestotrotz ist eine Einschränkung der Verwendung von Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Parasitenims im Blutstadium die Differenzierung zwischen sexuellen und asexuellen Stadien und zwischen männlichen und weiblichen Gametozyten. Daher muss die Schätzung der Prozentsätze der verschiedenen asexuellen und sexuellen Stadien (Abbildung 4) von einer morphologischen Bewertung des Giemsa-gefärbten dünnen Blutabstrichs abhängen. Trotz der offensichtlich unterschiedlichen Morphologie reifer männlicher und weiblicher Gametozyten (Abbildung 4) sind unreife Geschlechtsstadien oft nicht von asexuellen Stadien zu unterscheiden.

Eine wesentliche Funktion der männlichen Gameten bei der Entstehung von männlichen Gametozyten im Mückenmittelgut ist die männliche Gamet-Exflagellation, die ein sehr kritischer Schritt in der Übertragung ist, der innerhalb einer sehr kurzen Zeit geschehen muss. Variable Methoden, die verwendet werden, um dies in vielen verschiedenen Systemen zu bewerten, wurden beschrieben. Hierin zeigen wir eine standardisierte Methode, die in jeder einfachen Laboreinstellung wiederholt werden kann. Wir haben die männliche Gamete-Exflagellation mit oder ohne Injektion von Phenylhydrazin in Empfängermäuse ausgewertet (Abbildung 5). Wir konnten zeigen, dass die Phenylhydrazin-Behandlung deutlich (vierfach) die Rate der männlichen Gamete Exflagellation erhöht, was wiederum die Befruchtungsrate und die Anzahl aller nachfolgenden Mückenstadien erhöhen wird.

Figure 1
Abbildung 1 : Die Entwicklung der P. yoelii p230p(-) Parasiten, die eGFP konstitutiv in Blut- und Mückenstadien exezieren. (A) Bild von gemischten Blut-Stadium-Parasiten (1.000X Vergrößerung). (B) Bild von ookinete (400X Vergrößerung). (C) Bild einer Anopheles stephensi Mücke Midgut infiziert mit Tag 4 pmf frühen Oozysten von lebenden p230p(-) Parasiten, die eGFP (100X Vergrößerung) . (D) Dieses Panel zeigt ein Live-Bild eines P. yoelii p230p(-) Speicheldrüsensporozoit, seziert an Tag 15 pmf, ausdrucken eGFP (400X Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Durchflusszytometrie und Mikroskopie-Auswertungen der durchschnittlichen Blut-Stufen-Parasitemie P. yoelii p230p(-) Parasiten unterscheiden sich nicht signifikant. Eine Gruppe von vier Schweizer Webster-Mäusen wurde intravenös mit 10.000 parasitierten Erythrozyten von Pyp230p(-) pro Maus infiziert, und die durchschnittlichen Parasitemias im Blutstadium% wurden täglich 7 Tage lang durch Durchflusszytometrie und durch die mikroskopische Giemsa-gefärbtes dünnes Blut schmiert von insgesamt 20.000 bzw. 6.000 Erythrozyten. Die gezeigten mikroskopischen Untersuchungsergebnisse sind der Durchschnitt von zwei Messwerten von zwei Experten pro Dia, und die Zeit für die Bewertung der Parasitemie jedes Dias betrug mindestens 10 Minuten von jedem Wissenschaftler. An den hier gezeigten Tagen konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die Mittelwerte für alle Parasitenstämme wurden mit dem zweischwänzigen t-Test analysiert. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Eine intravenöse Injektion von P. yoelii p230p(-) Parasiten ergeben signifikant unterschiedliche Parasiten im Blutstadium aus einer intraperitonealen Injektion. Zwei Gruppen von fünf BALB/c-Mäusen wurden mit 1.000 parasitierten Erythrozyten von Pyp230p(-) pro Maus infiziert, entweder über den intravenösen oder intraperitonealen Weg, und die durchschnittlichen Parasitemias im Blutstadium wurden täglich 4 Tage durch Fluss aufgezeichnet. Zytometrie aus insgesamt 20.000 Erythrozyten. Eine statistisch signifikante Reduktion (bezeichnet durch ein Sternchen) der Parasitenims im Blutstadium konnte für alle Tage nachgewiesen werden, die in der intraperitonealen Routengruppe im Vergleich zur intravenösen Routengruppe getestet wurden. Die Mittelwerte für alle Parasitenstämme wurden mit dem zweischwänzigen t-Test analysiert. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Morphologie von P. yoelii gametozyten in einem Giemsa-befleckten dünnen Blutabstrich. Ein Bild eines Giemsa-gefärbten dünnen Blutabstrichs (1.000X Vergrößerung) einer Schweizer Webster-Maus, die mit WT P. yoelii 17X-NL-Stamm infiziert ist, zeigt die typische blau gefärbte weibliche Gametozyten auf der linken Seite (bezeichnet durch einen Pfeil) und das rosafarbene Männchen ( durch ein Sternchen) Gametozyten auf der rechten Seite des Bildes gekennzeichnet. Die anderen gezeigten Stadien sind asexuelle Blutstadien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Die Wirkung von Phenylhydrazin auf männliche Gamete Exflagellation. Die Wirkung von Phenylhydrazin in EmpfängerMäuse injiziert 5 Tage vor dem männlichen Gamete Exflagellation Rate Schätzung von P. yoelii. Phenylhydrazin erhöht signifikant die Rate der männlichen Gamete Exflagellation, was zu einer höheren Mückenstadien Infektion nach der Mückenfütterung führt. Die Mittelwerte für alle Parasitenstämme wurden mit dem zweischwänzigen t-Test analysiert. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Trotz der Ähnlichkeit in der allgemeinen Biologie ihrer Lebenszyklen mit denen menschlicher Malariaparasiten haben Maus-Malaria-Modelle auch viele Unterschiede zu menschlichen Plasmodium-Arten, die ihre Verwendung als zuverlässige In-vivo-Modelle einschränken würden. Mit Ausnahme von lebend abgeschwächten Parasiten als Impfstoffe lieferten beispielsweise alle Impfstoffstudien mit Untereinheit und DNA und anderen Impfstoffen hervorragende Ergebnisse im Mausmodell, aber bei Menschen, die in endemischen Gebieten lebten, waren die Ergebnisse alles andere als zufriedenstellend.

Ein weiteres Problem ist der Unterschied der Lebenszyklus-Stadium-Infektion von einer Maus-Stamm zu einem anderen, und manchmal von einem Tierverkäufer zum anderen für die gleiche Maus-Stamm. Darüber hinaus weisen die beiden wichtigsten Nagetier-Malaria-Arten, die als bevorzugte in vivo-Malaria-Modelle weit verbreitet sind, P. berghei und P. yoelii, keinen synchronen Blutstadiumszyklus auf, der sich völlig von jeder menschlichen Malaria unterscheidet. parasit. Die Vorteile der Verwendung von Maus-Malaria-Parasiten als In-vivo-Modelle überwiegen jedoch bei weitem diese Unterschiede, die auch durch eingehendere Analysen der molekularen Antriebe dieser Einschränkungen überwunden werden können. Dennoch werden diese Einschränkungen meist von den Blutparasiten des Nagetiers im Blutstadium angezeigt, aber nicht so sehr für die anderen Lebenszyklusstadien des Malariaparasiten.

Obwohl Blutstadien für verschiedene Impfstoffe, Wirkstoff-Targeting, Immunologie und funktionelle Genomstudien wichtig sind, gibt es eine Knappheit an standardisierten Methoden und Protokollen, die sich auf die phänotypische Analyse und funktionelle Assays konzentrieren, die Nagetier Malaria Parasiten Blut-Stadium Parasiten, mit mehr Fokus auf Mückenübertragung und Transfektion Protokolle. Daher werden die Methoden in diesem Artikel dazu beitragen, standardisierte und vereinfachte Protokolle für die Untersuchung der pathogenen Stadien der Nagetier-Malariaparasiten bereitzustellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Ahmed Aly wird durch Fördermittel der Bezmialem Vakif Universität aus dem Stipendium des türkischen Entwicklungsministeriums 2015BSV036, durch Fördermittel der Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine und durch Fördermittel von NIH-NIAID für R21Grant unterstützt. 1R21AI111058-01A1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien
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Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).More

Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

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