Summary
由于啮齿动物疟原虫的生命周期和生物学与人类疟原虫有着惊人的相似性,啮齿动物疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的一部分。在这里,我们标准化了野生型和转基因啮齿动物疟疾物种的类名分析中使用的一些最重要的技术。
Abstract
遗传学和系统生物学技术的最新进展促进了我们对疟原虫生物学在分子水平上的理解。然而,疫苗和化疗开发的有效疟原虫目标仍然有限。这主要是由于人类疟原虫物种缺乏相关和实用的体内感染模型,最显著的是恶性疟原虫和P.vivax。 因此,啮齿动物疟疾物种在体内被广泛用作疟疾疫苗、药物靶向、免疫反应和保存的疟原虫基因的功能表征研究的实用替代物。事实上,啮齿动物疟疾模型已被证明是无价的,特别是对于探索蚊子传播和肝阶段生物学,并且对于免疫学研究是必不可少的。然而,用于评估转基因和野生类无性及性血期寄生虫的表型的方法存在差异。这些差异的例子包括选择静脉注射与内腹感染啮齿动物与血期寄生虫,以及评估雄性Gamete灭菌。本文详细介绍了标准化的实验方法,以评估转基因寄生虫中无性血和性血阶段的表型,表达报告基因或野生型啮齿动物疟原虫物种。我们还详细介绍了评估疟原虫蚊媒内疟原虫阶段(配子、卵母细胞、卵泡和孢子菌)的表型的方法。 这些方法在这里详细和简化,用于P.berghei和P.yoelii的致命和非致命菌株,但也可用于对P.chabaudi和P.vinckei啮齿动物疟疾物种进行一些调整。
Introduction
疟原虫在全世界造成数以亿计的疟疾感染,每年有60多万人死于疟疾。人类感染是由五种疟原虫引起的,即恶性疟原虫、疟原虫、疟原虫、疟原虫和疟原虫。 大多数临床疟疾死亡是由撒哈拉以南非洲地区恶性疟原虫引起的。另一种在撒哈拉沙漠以南的非洲地区引起广泛全球病症的人类疟原虫是P.vivax2。其他三个物种都更受地理限制,并引起良性疟疾感染,除了致命的P. 缺乏相关和实际的非人类体内感染模型一直是而且仍然是疟疾疫苗和药物开发的障碍。早期的疟疾药物靶向和代谢研究已经广泛依赖于禽流感模型,如胆汁和P.lophurae,分别感染鸡和鸭,分别4。此后,各种疫苗和药物靶向研究逐渐引入啮齿动物疟疾物种,作为体内模型。多年来,啮齿动物疟疾模型与人类疟疾物种的生物学和宿主-寄生虫相互作用的相似性证据不断积累。
特别是,啮齿动物疟疾模型对于探索和描述蚊子生物学和红细胞前第5阶段极为重要。然而,有四种啮齿动物疟疾物种(P.berghei,P.yoelii,P.chabaudi和P.vinckei)具有不同的生物特征,其中最显著的是血液阶段6。 疟疾的疟疾物种在血液阶段的同步性上有所不同,其中P.chabaudi和P.vinckei菌株的血期大部分是同步的,而P.berghei和P.yoelii的血期不是6,7.另一个显著区别是某些菌株(例如,P. yoelii 17X-NL、P. berghei NK65 和P. vinckei lentum)的血液阶段的自我清除,而其他菌株的血液感染如果得不到治疗,同一物种的菌株可能是致命的(P.yoelii 17X-L,P. berghei ANKA 和P. chabaudi AS)。此外,P.yoelii 17X-NL 菌株和P. berghei ANKA 菌株优先入侵视网膜 8、9、10、11,尽管 P 的这些特征。尤利和宝海菌株不是严格的生长要求12,13,14。因此,在感染这些寄生虫的血液阶段之前,小鼠使用苯乙酰乙酰胺进行治疗,以增加P.berghei ANKA菌株和P.yoelii的蚊子感染所需的寄生虫血症和肌细胞血症17X-NL15,16,17,18,19。
不同啮齿动物疟疾物种之间也存在蚊子阶段发育的差异,其中最显著的是最佳蚊子阶段发育所需的温度和时间以及孢子菌长度5、6 20.在啮齿动物疟疾菌群的红细胞前阶段,差异包括最易感染孢子菌的啮齿动物种类和菌株,易感啮齿动物菌株接种所需的孢子菌数量,体外肝阶段发育测定所需的哺乳动物细胞类型,以及完成肝阶段发育的时间5、21、22、23、24、25 ,26,27,28,29,30.
尽管存在这些变异性,啮齿动物疟原虫在早期是应用反向遗传方法的有利模型,因为它们较少耗费时间和资源,成功概率高31。事实上,啮齿动物疟疾模型是最好的模型,在许多情况下,是唯一的模型,可用于功能特征基因表达在蚊子和肝脏阶段多年。
鉴于反向遗传方法在啮齿动物疟疾模型中的流行性和可得性,已采用多种不同的方法分析转基因寄生虫生命周期阶段的表型,特别是血液阶段。然而,其中一些方法不一致;例如,比较注射IP后血期寄生虫的感染(可能排到围肠淋巴结,从那里进入血液;因此,注射的寄生虫在血液中不会同样地进入),将克隆的蚊子传播与不同数量的序列血阶段转移或G数(可能影响细胞生成32,33)进行比较,或将转基因寄生虫直接与幼稚的野生型(WT)进行比较从未接受电穿孔和阳性药物选择以及各种非标准化的雄性配药除虫评价的寄生虫。因此,对血液和蚊子中任何类型的转基因或WT啮齿动物疟原虫进行类称分析,以适应啮齿动物疟疾的生物变异性,使简单易遵循的协议标准化至关重要。寄生虫物种。
本文报告转基因或野生P.yoelii和P.berghei寄生虫的血液和蚊子生命周期阶段的标准化、详细的实验方案。这些协议也适用于P.chabaudi和P.vinckei寄生虫。
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Protocol
这里描述的所有动物实验都是根据杜兰大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)和贝兹米亚莱姆·瓦基夫大学动物伦理委员会批准的规程进行的。所有其他实验规程和重组DNA的使用都是根据杜兰大学机构生物安全委员会(IBC)批准的规程进行的。
1. 小鼠感染血期寄生虫,用于寄生虫病分析和蚊子感染分析
- 第3天:可选地将苯乙酰胺注射到受体小鼠中
- 使用 26 G 针头注射 100 μL 苯基氢化物(50 mg 苯乙酰胺在 5 mL 中的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中的苯基水胺 50 毫克苯甲酰胺的灭菌性 SW 或 CD1 受体小鼠(将用于蚊子感染和蚊子感染检测的小鼠)内腹 (IP)注射器。
注:对于P.berghei和P.yoelii的强健蚊子感染,苯乙酰胺用于诱导受体小鼠的视网膜细胞增多,从而增加寄生虫血症,进而增加糖体细胞的百分比,并显著增加雄性配子的排泄(图5),这将导致P.berghei和P.yoelii菌株15、16、17的蚊级感染。 18.
- 使用 26 G 针头注射 100 μL 苯基氢化物(50 mg 苯乙酰胺在 5 mL 中的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中的苯基水胺 50 毫克苯甲酰胺的灭菌性 SW 或 CD1 受体小鼠(将用于蚊子感染和蚊子感染检测的小鼠)内腹 (IP)注射器。
- 第2天:将冷冻寄生虫储存注入供体小鼠
- 快速解冻冷冻冷冻库存,并立即使用 26 G 针注射器将每个供体小鼠(通常每个基因型两只小鼠)的 IP 注入 ±200 μL 的库存。
注:在受控的活体环境中,每个笼子的饲养不超过五只。 - 感染后24小时后,开始在100x显微镜下检查吉姆萨染色的薄血涂片上的寄生虫。遵循 Giemsa 染色的薄血涂片协议第 2.1 节。
注:由于无法精确计数存活的活血阶段后,快速解冻和注射冷冻保存的受感染的血液,供体小鼠首先收到冷冻保存的血液。供体小鼠的受感染红细胞可以精确量化,并随后使用。
- 快速解冻冷冻冷冻库存,并立即使用 26 G 针注射器将每个供体小鼠(通常每个基因型两只小鼠)的 IP 注入 ±200 μL 的库存。
- 第0天:供体小鼠出血
- 当寄生小鼠的寄生虫病在0.1%至1%之间时出血(见第3.1节),在P.yoelii 17X-NL和P.berghei ANKA菌株的情况下,通常在冷冻后2-3天获得感染。
- 使用面部静脉穿刺(获得200至500μL),或通过心脏穿刺(获得600μL至1.2 mL)的受感染血液最终出血动物。如第 3.1 节所述,通过心脏穿刺使小鼠最终出血。
注:面部静脉出血不是获得血液的常规方法,因为它更难应用,并且非常痛苦小鼠,与终端出血。供体小鼠出血的最佳寄生虫血症在0.1%-1%之间,因为在这个寄生虫病范围内,有很少的球细胞(不能复制产生无性血阶段),并且有较少的双或三感染红细胞(这使量化不准确)。
- 第0天:定量受感染的血液,通过连续稀释制备受感染的红细胞剂量
- 通过将100μL的血液加入微离心管(稀释管1),制备供体血液的连续稀释。将 900 μL 的 RPMI 介质添加到管 1 中,并通过使用相同的移液器尖端上下移液,形成 1:10 稀释,从而很好地混合。
- 从管1中取100μL的稀释血液,并将其加入新的微离心管(稀释管2)。将 900 μL 的 RPMI 介质添加到管 2 中,并通过使用相同的移液器尖端上下移液,形成 1:100 稀释,从而很好地混合。
- 重复步骤 1.4.1 和 1.4.2 以再进行两次连续稀释,从而产生 1:1,000(稀释管 3)和 1:10,000 稀释(稀释管 4)。
- 将12μL的稀释血液从管3和12μL稀释的血液从管4到血细胞仪的不同侧面,并确定血细胞计两侧红细胞的平均数量。将这些数字乘以 10。将这些数字乘以稀释系数(分别为 1,000 或 10,000),以确定每个稀释的 1 μL 中的红细胞数量。
- 将要注射的受感染红细胞的所需数量除以每个稀释的1μL中的红细胞数量,以确定注射所需的稀释供体血量。选择最适合注射体积的稀释剂,将体积添加到新的微离心管中,并使用 RPMI 介质将其完成至 120 μL。
- 第0天:受体小鼠静脉注射
- 将受体小鼠置于热红灯下,以稀释其静脉以注射。将寄生虫剂量装入27G胰岛素注射器中,并将受体小鼠放入抑制器中。
- 在每个受体小鼠中分别使用27G胰岛素注射器注射100万或10,000名受感染的红细胞(IV),用于蚊子感染测定或无性血期和性血期生长测定。在标准外壳条件下继续保持小鼠。
注:IP 注射是一种将寄生虫引入血液的间接方法,因为寄生红细胞必须通过围腔排出的淋巴结才能到达血液。这使得IP注射成为向血液中注入精确数量的寄生虫的间接输送途径。因此,IV路由是首选,因为它提供准确的寄生虫剂量直接进入血液,如图3所示,并在代表性结果中描述。
2. 性别阶段和无性阶段血期寄生虫负荷的确定
注:本部分列出了疟原虫血期标准化的型板评价方法。这些方法有助于评估新的抗疟或疫苗候选物,甚至基因敲除同一实验鼠的性和非性阶段发育。值得注意的是,P.chabaudi和P.vinckei对于这些类型的检测,特别是在药物筛选方面,也是非常合理和重要的替代选择。
- 确定无性阶段和雄性与雌性球细胞的寄生虫血症,由吉姆萨染色的薄血涂片进行寄生虫生长测定
- 使用26G或27-G针,刺破老鼠的尾巴,并在显微镜幻灯片上收集血滴。使用另一张显微镜幻灯片的短边快速涂抹幻灯片上的血迹。
- 只有在幻灯片上血液完全干燥后,才能用 100% 甲醇固定幻灯片至少 1 分钟。在 10% Giemsa 中染色 10-15 分钟,用单蒸馏水或双蒸馏水清洗幻灯片,使其干燥。
- 在光学显微镜下使用 100x 物镜和油浸,阅读幻灯片。要进行准确的寄生虫病测量,请检查至少 6,000 个红细胞,这些细胞可以通过计算至少 30 或 40 个显微网格,每个网格的平均数量为 200 或 150 个红细胞 (RBCs)。计算第一个和最后一个网格中的 RBC 总数,以确定所有网格的红血球平均数量。
- 计算每个网格受感染的红细胞总数。男性和女性的食细胞可以单独计数,以确定食细胞血症,但也应包括在总寄生虫血症计数。
- 通过将寄生红细胞的总数除以观察到的红细胞总数来确定寄生虫总百分比。将此数字乘以 100 以确定寄生虫百分比。
- 通过将计数的食细胞总数除以观察到的 RBC 总数来确定博弈细胞血症。将这个数字乘以100,确定每只小鼠的球细胞血症百分比。
注:区分不同无性血和性血期的唯一可靠方法是使用显微镜来评估吉姆萨染色的瘦血涂片,因为每个阶段都有不同的形态,除了未成熟的博弈细胞,这与无性血阶段大多无法区分。
- 荧光报告蛋白表达WT样寄生虫菌株的流式细胞测定血期寄生虫病的测定
- 为每个小鼠样品标记两个微型离心管,指定一个管进行 1:1,000 稀释,另一管指定 1:2,000 稀释。将 1.5 μL 的 1x 肝素添加到 1:1,000 稀释管中。
- 使用 26 G 或 27 G 针头,刺破小鼠的尾巴,并将 1.5 μL 的血液转移到含有 1.5 μL 的 1x 肝素(1:1,000 稀释管)的管中。通过上下移液,将血液和1x肝素轻轻混合在一起。
- 将 1,497 μL 的 RPMI 介质添加到微离心管中,然后轻轻上下移液以混合均匀。
- 将 500 μL 的混合物从 1:1,000 稀释管转移到 1:2,000 稀释管。将 500 μL 的 RPMI 介质添加到 1:2,000 管中,通过上下移液轻轻混合。
- 遵循制造商对流式细胞仪的相应启动协议。以慢速运行样本,并设置至少 20,000 个事件的检测。
注:有一种替代的实用测定,通过三色FACS分类测量寄生虫,无论寄生虫表达荧光标记与否34。然而,这里描述的测定提供了对活寄生虫寄生虫的准确测量,无需添加任何DNA结合染料和使用FACS分类。
- 雄性配子每微升受感染小鼠血液的排泄率的测定
- 准备一个1:10稀释微离心管与40μL的不完全ookinete培养基(RPMI + 碳酸氢钠 + 低氧辛酸+ 黄素酸)和5 μL的1x肝素。
- 使用26G或27G针头,刺破小鼠的尾巴,并迅速将5μL的血液(使用微管)转移到含有不完整的奥基内特培养基 - 肝素的管中。轻轻混合,将1:10血液稀释管的12 μL加载到血细胞仪上,将其留在室温(20-24 °C)下。
- 在准备 1:10 稀释后 9-10 分钟开始计数除法事件。使用具有 40 倍放大倍率的相对比光学显微镜。
- 将平均数量计算在10上,再乘以稀释系数(10),以确定受感染血液每微升的平均排泄数。
注:此测定测量了 1 μL 血液中雄性 gamete 脱除事件的数量,可以使用血细胞计进行量化。不完整的ookinete培养基18与血液混合,以密切模仿在血餐后不久在蚊子中古特内发生灭蚊的情况。
3. 从受感染的红细胞和冷冻库存制剂中分离和处理血期寄生虫
- 被心脏穿刺感染啮齿动物的末期出血
- 准备一个26G针注射器,含有约±20 μL的1x肝素(200单位/mL),通过心脏穿刺收集供体小鼠的血液。
- 在出血前,使用缓慢的CO2对小鼠实施安乐死。或者,用肌胶麻醉小鼠(在皮肤切口之前和期间必须保持,以暴露心脏)。
- 将鼠标放在其背面,并固定其附属物。用钳子拉起皮肤,用剪刀切开,在胸骨底部附近的皮肤上做一个小切口。在切口部位将皮肤拉开,露出隔膜和腹腔顶部。
- 用钳子握住肋骨笼的底座,穿过隔膜进入胸腔;小心不要损害心脏或肺部。将肋骨笼固定回以暴露心脏。
- 轻轻刺穿心脏,慢慢拉起注射器柱塞,收集+1 mL的血液,并将其转移到微离心管。
- 从受感染的血液中制备冷冻储存
- 用大约2%至5%的血寄生虫出血小鼠(见第3.1节),具有大量的环级,而不是那么多的球细胞。
- 将所需血液部分与冷冻溶液(阿尔塞弗溶液中的10%甘油)混合,比例为1:2,并储存在低温小瓶中。冷冻在液氮中。
- 分离和纯化用于提取DNA、RNA和蛋白质的血期寄生虫
- 出血小鼠(见第3.1节),血液寄生虫含量高于0.5%。
- 通过取出柱塞并插入小棉签,准备 10 mL 注射器。将棉包到注射器底部。用纤维素填充,直到纤维素水平达到3 mL标记,但不超过注射器上的4 mL标记。
- 将注射器固定在环形支架上的夹子中,并在其下方放置一个废物收集管。将 5 mL 的 PBS 添加到注射器中,使其流进废管。
- 如果需要,仅使用 100-300 μL 的血液准备冷冻库存。将其余受感染的血液(400-700 μL)添加到柱中。用废管收集流水,直到液滴开始变红。一旦液滴开始变红,在注射器下放置一个新的14mL收集管,以收集流过。
- 一旦流量开始变慢,将PBS添加到注射器中,在15 mL管中收集流量,直到达到14 mL的总体积。用废管收集剩余的流量。
- 用血液/PBS混合物将14 mL管离心8分钟,250 x g,无需踩刹车。去除上清液,加入14 mL的冷冻皂苷(50毫克皂苷在50 mL的PBS)。要清除颗粒,如有必要,可多次反转管和涡旋。
- 在 1,217 x g下将管离心 8 分钟,无需踩下制动器。去除上清液,将溶液留在颗粒上方约 0.5 mL。
- 使用微移液器将颗粒重新悬浮到溶液中,并将其转移到微离心管中。将 500 μL 的 PBS 添加到 14 mL 管中,以洗涤管中残留的任何寄生虫。将其添加到同一微离心管中。
- 在 6,010 x g下将管离心 2 分钟。取出上清液,重新悬浮 1 mL 的 PBS。在 9,391 x g下离心 2 分钟。
- 继续提取基因组DNA、总RNA和蛋白质。
- 对于基因组DNA提取,在200μL的PBS中去除上清液并重新悬浮颗粒,然后遵循任何合适的gDNA提取方案。
- 对于总RNA提取,去除任何苯酚和瓜尼丁异体素溶液或任何其他合适的试剂的1 mL中的上清液、重悬浮和涡流颗粒,然后遵循任何适当的总RNA提取方案。
- 对于总蛋白质提取,去除上清液,将颗粒重新悬浮在适当体积的6x硫酸钠(SDS)加载染料或任何其他合适的试剂,然后,遵循任何适当的方案,总蛋白质处理。
4. 蚊子感染检测
注:蚊子是发生性繁殖的疟原虫的主要宿主。小鼠感染疟疾寄生虫到蚊子进行静脉注射,至少100万血期,然后喂养受感染的小鼠(来自显示最高雄性雄性雄性雄性动物的遗传型)以在老鼠感染后第3天,在笼子里灭蚊。在苯乙酰胺处理小鼠中注射100万血期寄生虫,将确保雄性和雌性球细胞以更快、更高的速度发育。感染P.yoelii和P.berghei的蚊子分别在24°C和20-21°C孵育,以允许尽可能最好的蚊子阶段发展6。
- 蚊子喂养和确定每只蚊子的卵虫数量
- 在喂食前,将成年雌性阿诺菲莱斯·斯蒂芬西或A.gambiae蚊子(4-7天大)饿死8-12小时。允许成年蚊子对受感染的麻醉小鼠(注射适当剂量的氯胺酮/木氨酸)至少喂食15分钟,其除草率最高(第2.3节衡量)。
注:氯胺酮/乙酰胺工作溶液由盐水和IP注射100μL每只小鼠的库存溶液的1:5稀释制备。对于10 mL库存溶液,在9 mL氯胺酮(100毫克/升/升)中加入1 mL的木兰素(100 mg/mL)。 - 用口腔吸气器清除未喂食的雌性蚊子和雄性蚊子。
- 在喂食后18-20小时,收集20-30只蚊子,并把它们放在冰箱里不少于10分钟,以确保死亡。使用双目解剖范围,用两根 26 G 或 27 G 针头或 RPMI 或 PBS 解剖介质中的针和钳子解剖出 20-30 个充满血液的中肠,并将中腔转移到含有 200 μL RPMI 或 PBS 的微离心管(用于解剖方法)请参见第 4.3 节)。
- 在700 x g下将收集管离心1分钟。用虫子研磨颗粒中古。重复此步骤。
- 将50μL从地面中端管转移到新的微离心管。添加 200 μL 的 RPMI 或 PBS 以创建 1:5 稀释。
- 将12μL转移到细胞计,并在室温下孵育5分钟,使内容物沉淀。
- 使用具有相色对比和 40 倍放大倍率的光学显微镜,确定奥基尼特的平均数量。
- 将成熟卵母的平均值乘以10,再乘以5的稀释系数,以确定奥基内特的平均总数。
- 将平均数量的卵食被解剖的用血蚊子数除以确定每只用血喂养的蚊子的卵虫数量。
- 在喂食前,将成年雌性阿诺菲莱斯·斯蒂芬西或A.gambiae蚊子(4-7天大)饿死8-12小时。允许成年蚊子对受感染的麻醉小鼠(注射适当剂量的氯胺酮/木氨酸)至少喂食15分钟,其除草率最高(第2.3节衡量)。
- 荧光报告蛋白表达WT样寄生虫菌株早期卵囊数的确定
注:此测定的目的是确定表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的活寄生虫的数量,这些寄生虫完全感染了蚊子的中古人,并形成早期球形卵母细胞。此测定确定 ookinetes(在前一次测定中估计的发育)是否通过蚊子中古特上皮细胞的遍历完成其功能,并在中牙的基底层侧向早期卵母细胞转化上皮利亚或不。这是另一种利用表达GFP的寄生虫的测定,因为如果没有繁琐的免疫染色,在这个阶段计算早期卵囊几乎是不可能的。- 解剖 20-30 只供血的蚊子的中古人(见第 4.1 节),第 3 天或第 4 天,为P. yoelii 17X-NL 进行蚊子后喂养 (pmf),在第 6 天或 7 pmf 为P. berghei ANKA,用两根 26 G 或 27 G 针头或 RPMI 或 PBS 解剖 m 中的针头和钳子关于解剖方法,请参阅第 4.3 节)。
- 将 40-50 μL 的解剖介质铺在玻璃滑动较长边缘的水平中线上。在解剖过程中,一次一个地将中肠转移到这条线上,如果需要,向中古人添加更多的中度,以避免干燥。
- 将盖玻片轻轻放在解剖的中干上,用指甲油密封。
- 使用荧光显微镜的10倍或20倍物镜与绿色荧光过滤器,计算每个中肠上的早期卵泡数,至少20个中肠。
- 确定每只蚊子的卵囊虫数量
- 用两根26-G或27G针头或一针和钳子在RPMI或PBS解剖培养基中解剖至少20-30只蚊子的中肠,并在200μL的RPMI中收集解剖的中肠。
- 用一根针(或钳子)将下腹部段牢牢地固定在原位,并在胸腔和腹部之间的交界处用另一根针轻轻向上推胸。小心短推,直到胸部从腹部分离。一旦分离开始,白色中肠就会出现拉伸,然后中肠将被切断从食道末端使用相同的针,用于分离胸。如果仍然附着在腹部,同一针可以用来将中腹从腹部拉开。将所有蚊子的中肠转移到收集管中,用针头从培养管中收集,一次一个。
- 在 700x g下将收集管离心 1 分钟,将中茎稳定到收集管的底部,然后用虫子研磨它们。重复此步骤。
- 将12μL转移到细胞计,并在室温下孵育5分钟,使其内容物稳定。
- 使用光学显微镜的 40 倍物镜对卵囊孢子石进行计数。如果蚊虫碎片阻止孢子子的精确计数,或者如果孢子石的数量过高而无法准确计数,请使用 1:5 和/或 1:10 稀释。
- 通过将孢子石的平均数量乘以 10,再将该数字乘以稀释因子(如果有)和总体积 (200 μL), 计算卵囊孢子石的平均总数。
- 将孢子虫的平均总数除以解剖的蚊子数量,以计算每只蚊子的平均卵囊孢子虫数量。
注:衡量蚊子阶段感染的成功或生产力的一个常见错误是计算卵母细胞发育后期的卵母细胞数量。这是由于一些卵母细胞在卵小板发育的后期点被真空化,而其他不能开发孢子菌,即使在相同的中肠道。确定蚊子阶段感染生产力的最佳和最可靠的方法是计算在P.yoelii蚊子感染后10-12天和12-14天中肠卵囊虫的平均数量P. berghei的蚊子感染后感染。
- 确定每只蚊子的唾液腺孢子虫数量
注意：通过估计侵入唾液腺的孢子石的数量,即脊椎动物的可传播和传染性阶段,完成蚊子阶段发育的完全完成的最终评估。唾液腺的入侵是在卵母体孢子石发育完成、渗入淋血液、附着于唾液腺细胞的基底层状和环状细胞到达唾液腺后建立的。管道5.因此,此分析也是对所有这些过程是否成功的评估。尽管如此,对淋巴孢子数的估计将允许区分从卵囊细胞排出的缺陷和唾液腺入侵的缺陷35.唾液腺孢子体的纯化允许对孢子球运动和入侵表型进行多种功能测定。唾液腺孢子球也可用于小鼠体内感染和免疫研究36,37.此外,建立体外肝期入侵或发育测定的最可重复的阶段是使用唾液腺孢子球体。- 解剖50-100只雌性蚊子的唾液腺,天14-16pmf为P.yoelii和天17-20pmf为P.berghei,最好用两个26G或27G针,在RPMI或DMEM培养基保存在冰上,并辅以5%的胎儿牛血清(FBS)或/牛血清白蛋白 (BSA) 用于P. yoelii孢子石或 3% FBS/BSA 用于P. berghei孢子石。如果孢子球菌用于体外检测的肝瘤,在解剖介质中加入1%的青霉素/链霉素。通常有两种解剖唾液腺的方法。第一种方法是耗时的,但会导致唾液腺的解剖,很少或没有污染组织。第二种方法省时少,但会导致大量污染组织的集合。此处详细介绍了第一种方法。
- 用一根针的倾斜侧将上腹部段保持到位,并小心地将头部轻柔地(在非常短的推力中)向上方向推到头部和胸部之间的交界处,直到头部与胸部小心分离,没有撕裂玻璃唾液腺,暴露的唾液腺然后从头部分离与相同的针,推动头部向上。
- 解剖的唾液腺将使用短玻璃巴斯德移液器从解剖介质中升起。
- 当所有唾液腺被解剖和收获后,人才会将含有中古的管子放入离心机(1分钟,700 x g)。
- 在设置为第 2 阶段对比度和 40 倍放大倍率的光学显微镜下使用造影仪计数孢子石。如果解剖的蚊子数量为+40,则根据预期的感染率(在早期测定中确定),将唾液腺稀释至1:5或1:10。
- 将孢子石的平均数量乘以10和稀释因子(如果有的话)。乘以总体积,以确定唾液腺孢子体的平均数量。除以解剖雌性蚊子的数量,以确定每只蚊子的平均唾液腺孢子虫。
注:唾液腺的解剖问题是它们体积小,外观透明。因此,很难分离唾液腺,因此,它们通常被解剖为一次性与其他组织从胸的前部,这也很重要保护唾液腺在收集过程中破裂。
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Representative Results
将反向遗传工具和技术应用于疟原虫的成功彻底改变了疟疾研究领域,能够添加、删除或修改几种疟原虫物种39的特定基因组片段。重要的是,可分配基因组位点已被识别并成功用于通过双同源重组在啮齿动物和人类疟原虫中引入荧光蛋白标记物,以确保在所有生命周期阶段具有稳定的表达40 ,41,42.这些类似WT的转基因寄生虫的例子是Py230p(-)寄生虫,它们在我们的实验室中产生,在血液和蚊子生命周期发育方面没有明显的缺陷,17.这些转基因报告寄生虫表示eGFP,在PyHSP70的强和组织促进因子的控制下,在血液阶段(图1A)ookinetes(图1B),年轻的卵母细胞(图1C)) 在阿诺菲莱斯·斯蒂芬西中古,并在从阿诺菲尔斯·斯蒂芬西女性的唾液腺中分离的孢子石(图1D)。因此,eGFP表达的血液寄生虫使得使用转基因寄生虫不同基因型之间的流动细胞测定或药物治疗和未治疗药物靶向中评估血期寄生虫病变得容易得多,也更省时使用转基因报告寄生虫进行检测。
为了确认流动细胞学的使用与显微镜估计更繁琐的寄生虫病之间没有定量差异,使用eGFP表达Pyp230p(-)来估计寄生红细胞的百分比。流动细胞学和由吉姆萨染色的薄血涂片在一组瑞士韦伯斯特小鼠IV感染10,000寄生红细胞。流式细胞测定寄生虫血症百分比值通过监测吉姆萨染色的薄血片直接对应于估计的寄生虫血症百分比,两位专家科学家估计了这些血斑(图2)。在确定血期寄生虫的生长速率时,这是用显微镜的繁琐和容易发生人为错误的方法的更准确的替代方法。
与啮齿动物感染疟原虫血液阶段相关的一个重要差异是选择感染途径,与IV感染途径相比,文献中对知识产权的强烈偏好,因为它耗时较少。为了比较这两种感染途径,两组5只BALB/c小鼠通过IV或IP途径感染了每只小鼠1,000eGFP表达的Pyp230p(-)寄生红细胞。寄生虫病每天使用流细胞测定监测4天。在测试的所有日,IP感染组寄生虫血症%与IV感染组相比,在统计学上显著下降(图3)。这提供了证据,表明IV感染途径是疟原虫血期检测的更准确的感染途径。
然而,使用流细胞学来评估血期寄生虫病的一个限制是性和非性阶段以及男性和女性细胞细胞之间的差别。因此,估计每个不同无性与性阶段的百分比(图4)必须取决于对吉姆萨染色的瘦血涂片的形态评估。尽管成熟的男性和女性的性细胞形态明显不同(图4),但不成熟的性阶段往往与无性阶段无法区分。
雄性配子在蚊子中粒中出现雄性配子球后,其一个基本功能是雄性配子的排泄,这是传播中一个非常关键的一步,必须在很短的时间内发生。介绍了用于在许多不同的系统中评估这一点的可变方法。在这里,我们展示了一个标准化的方法,可以在任何简单的实验室设置中重复。我们评估了雄性gamete脱硫剂,无论是否向受体小鼠注射苯乙酰乙酰胺(图5)。我们可以表明,苯基氢酶治疗显著(四倍)提高了雄性gamete的排泄率,这反过来会增加受精率和所有后续蚊虫阶段的数量。
图 1: 开发 P. yoelii p230p(-) 寄生虫在血液和蚊子阶段构成 eGFP。(A) 混合血相寄生虫的图像(1,000 倍放大)。(B) 奥基尼特图像(400倍放大倍数)。 (C) 图像的阿诺菲莱斯stephensi蚊中肠道感染第4天pmf早期卵泡活p230p(-)寄生虫表达eGFP(100倍放大)。 (D) 此面板显示 P. yoelii p230p(-)唾液腺孢子石的实时图像,在第 15 pmf 时解剖出来,表达 eGFP(400 倍放大倍数)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: 流动细胞学和显微镜评估平均血期寄生虫病 P. yoelii p230p(-) 寄生虫没有显著差异。一组四只瑞士韦伯斯特小鼠静脉注射了每只小鼠的10,000个寄生红细胞,通过流动细胞学和微观评估,每天记录的平均血期寄生虫率为7天。吉姆萨染色的薄血涂片,分别从20,000和€6,000红细胞。显示的微观检查结果是两位专家科学家每张幻灯片平均两次读数,每个科学家评估每张幻灯片的寄生虫病的时间至少为 10 分钟。此处显示的任何日期都未检测到显著差异。使用双尾t-测试分析所有寄生虫菌株的平均值。 误差条表示标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:静脉注射 P. yoelii p230p(-) 寄生虫产生明显不同的血期寄生虫血症从腹内注射。两组5只BALB/c小鼠通过静脉注射或腹管内途径感染了每只小鼠1000只Pyp230p(-)的寄生红细胞,每天通过流量记录平均血期寄生虫百分比细胞学从总共20,000个红细胞。与静脉注射途径组相比,在腹内途径组测试的所有日内,可检测到血期寄生虫病的统计显著减少(以星号表示)。使用双尾t-测试分析所有寄生虫菌株的平均值。 误差条表示标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4: 形态P. yoelii 在吉姆萨染色的薄血涂片中的配子细胞。一张被瑞士韦伯斯特老鼠感染WT P. yoelii 17X-NL 菌株的吉姆萨染色薄血涂片(1,000 倍放大倍数)的图像显示了左侧典型的蓝色女性配型细胞(用箭头表示)和粉红色男性(由图像右侧的星号)博弈细胞表示。显示的其他阶段是无性血阶段。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:苯乙酰乙胺对雄性gamete的除法作用。苯基乙酰胺在接受小鼠中注射的效果,在P.yoelii的雄性gamete脱硫率估计前5天。苯乙酰胺显著地增加了雄性gamete的排泄率,从而导致蚊虫喂食后蚊子感染的较高阶段。使用双尾t-测试分析所有寄生虫菌株的平均值。 误差条表示标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
尽管小鼠疟疾模型在一般生物学中与人类疟原虫的生命周期相似,但鼠疟疾模型与人类疟原虫物种也有许多不同,这将限制其作为可靠体内模型的使用。例如,除了作为疫苗的活减毒寄生虫外,所有带有亚单位、DNA和其他疫苗的疫苗研究在小鼠模型中都取得了优异的结果,但在生活在流行地区的人类中,结果远不能令人满意。
另一个问题是生命周期阶段感染性从一个小鼠菌株到另一种,有时从一个动物供应商到另一个动物供应商为相同的小鼠菌株的差异。此外,在体内广泛用作首选的两种啮齿类疟疾物种,P. berghei和P. yoelii,并不表现出同步的血期周期,这与任何人类疟疾完全不同。寄生虫。然而,使用小鼠疟原虫作为体内模型的好处远远大于这些差异,这些差异也可以通过对这些局限性的分子驱动进行更深入的分析来克服。然而,这些限制主要表现为啮齿动物疟疾血期寄生虫,但疟疾寄生虫的其他生命周期阶段则没有那么多。
虽然血期对于各种疫苗、药物靶向、免疫学和功能基因组学研究都很重要,但缺乏标准化方法和协议,这些方法和协议侧重于表型分析和功能测定,这些方法与功能分析涉及啮齿动物疟原虫血期寄生虫,更注重蚊子传播和转染方案。因此,本文中的方法将有助于为研究啮齿动物疟原虫的致病阶段提供标准化和简化的协议。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
Ahmed Aly 得到土耳其发展部 2015BSV036 赠款给 Bezmialem Vakif 大学的资金支持,以及杜兰大学公共卫生和热带医学学院提供的资金,以及 NIH-NIAID 为 R21Grant 提供的资金1R21AI111058-01A1。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
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