Summary
בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות הגנטיקה והביולוגיה של המערכות קידמו את הבנתנו את הביולוגיה של טפילי המלריה ברמה המולקולרית. עם זאת, יעיל מלריה טפיל מטרות עבור החיסון ופיתוח כימותרפיה עדיין מוגבלים. הדבר נובע במידה ניכרת מחוסר הזמינות של הרלוונטיים והמעשיים במודלים של זיהום vivo למינים של הפלמודניום האנושי, בעיקר עבור p. falciparum ו p. vivax. לכן, מינים מלריה מכרסמים כבר בשימוש נרחב כמו חלופה מעשית במודלים vivo עבור חיסון נגד מלריה, סמים מיקוד, התגובה החיסונית, ולימודי אפיון פונקציונלי של שימור הגנים הפלסטיות. אכן, דגמי מלריה מכרסמים הוכיחו להיות יסולא בפז, במיוחד עבור חקר שידור יתושים וביולוגיה שלב הכבד, והיה חיוני למחקרים אימונולוגיים. עם זאת, ישנם אי-התאמות בשיטות המשמשות כדי להעריך את פנוטיפים של הטרנסגניים והפראי, מיני ומינית טפילים בשלב הדם. דוגמאות לסתירות אלה הן הבחירה של זיהום בתוך הצפק לעומת הדלקת פנים של מכרסמים עם טפילים בשלב הדם ואת ההערכה של הגבר להלקאה. בזאת, אנו פירוט שיטות ניסיוני סטנדרטית כדי להעריך את פנוטיפים של שלבים מיני ומינית דם בטפילים טרנסגניים ביטוי הכתב-גן או פראי סוג מלריה מכרסם טפיל מינים. כמו כן אנו מפרטים את השיטות כדי להעריך את פנוטיפים של מלריה טפיל שלבים נגד יתושים (gametes, ookinetes, oocysts, ו sporozoites) בתוך אנופלס וקטורים יתושים. שיטות אלה מפורטות ופשוטים כאן עבור זנים קטלניים ולא קטלניים של p. ברגניי ו p. yoelii אבל יכול להיות גם להחיל עם כמה התאמות p. שאבו ו p. ויניקיי מכרסם מיני מלריה.
Introduction
טפילים מלריה לגרום למאות מיליוני דלקות מלריה בבני אדם ברחבי העולם, עם יותר מ 600,000 מקרי מוות מדי שנה1. זיהומים אנושיים נגרמים על ידי חמש מינים טפיל מלריה, כלומר p. falciparum, p. vivax, p. ovale, פ. מלאריאה, ו p.ה,. רוב מלריה קלינית נגרמת על ידי P. falciparum באפריקה שמדרום לסהרה1. נוסף מלריה אנושית טפיל מינים הגורמת morbidities נרחב ברחבי העולם מחוץ לאפריקה שמדרום לסהרה הוא P. vivax2. שלושת המינים האחרים מוגבלים יותר מבחינה גיאוגרפית וגורמים לדלקות מלריה שפירים, למעט הקטלניים הקטלנית3. אי-הזמינות של מודלים רלוונטיים ומעשיים שאינם אנושיים בvivo של זיהומים היתה תמיד ועדיין הוא מכשול חיסון נגד מלריה ופיתוח התרופה. מוקדם יותר תרופות מלריה פילוח מחקרים מטבולית סמכו בהרחבה על דגמי מלריה העופות כמו p. אבירים ו p. lophurae, הדבקת תרנגולות וברווזים, בהתאמה4. לאחר מכן, מינים מלריה מכרסמים הוכנסו בהדרגה חיסונים שונים ומיקוד הסמים מחקרים כמו במודלים vivo. במהלך השנים, עדויות של קווי הדמיון של הביולוגיה ואינטראקציות מארח-טפיל של שלבים מחזור החיים של מודלים מכרסמים מכרסם למינים מלריה בני אדם צברו.
בפרט, דגמי מלריה מכרסמים היו חשובים מאוד כדי לחקור ולאפיין את הביולוגיה של יתושים ושלבים טרום אריתרופויזיים5. עם זאת, ישנם ארבעה מינים מלריה מכרסמים (p. ברגניי, p. yoelii, p. שאבו, ו P. vinckei) כי יש תכונות ביולוגיות שונות, הבולטים ביותר שנמצאים בשלבי הדם6. מינים מלריה מכרסם שונים ב סינכגניות של שלבי הדם, איפה בשלבים דם של p. שאבו ו p. זנים ויניקאי הם בעיקר סינכרוני, בעוד שלבי הדם של p. ברגניי ו p. yoelii אינם6 , 7. עוד הבדל הבולט הוא הסיווג העצמי של שלבי הדם המתרחשת בזנים מסוימים (למשל, p. yoelii 17x-NL, p. ברגניי NK65, ו p. vinckei lentum), בעוד זיהום הדם של אחרים זנים של אותו מין יכול להיות קטלני אם לא מטופל (p. yoelii 17x-L, p. ברגניי אנקה, ו P. שאבו כמו). יתר על כן, p. yoelii 17x-NL המתח ו p ברגמיי מאמץ מאוד לפלוש לעבר רטיקולולוציטים8,9,10,11, למרות תכונות אלה של P. yoelii ו P. בוני זנים הם לא דרישה הצמיחה קפדנית12,13,14. לכן, העכברים מטופלים עם פנילהיהידראזין לפני זיהום עם שלבי הדם של טפילים אלה כדי להגדיל את הקיפוד ואת gametocytemia הצורך לזיהום יתוש עבור הזן p. ברגאיי אנקה עבור p. yoelii 17 x-NL15,16,17,18,19.
הבדלים בשלבי פיתוח של יתושים קיימים גם בין מינים שונים מלריה מכרסמים, הבולטים ביותר להיות הטמפרטורה ואת הזמן הנדרש עבור פיתוח בשלבים מיטביים יתושים ואת אורך sporozoite5,6, . עשריםדולר בשלבים טרום אריתרופויוטיים של מיני מלריה מכרסמים, ההבדלים כוללים את המינים מכרסם ומסננים כי הם רגישים ביותר מדבקת sporozoite זיהומיות, מספר הספוראוזוטים הדרושים לחיסון למאמץ מכרסם רגיש, ה סוגי תא ממגלית הדרושים לפיתוח בכבד מחוץ לתחום, והזמן להשלמת התפתחות הכבד בשלב5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
למרות היכולות הללו, טפילים מלריה מכרסמים היו מודלים חיוביות מוקדם על היישום של גישות גנטיות הפוכה, כי הם היו פחות זמן-ו לצרוך משאבים עם הסתברות גבוהה של הצלחה31. למעשה, דגמי מלריה מכרסמים היו הדגמים הטובים ביותר, ובמקרים רבים את המודלים היחידים, זמין במשך שנים רבות כדי לאפיין את הגנים באופן פונקציונלי הביע בשלבים יתושים ובכבד.
לאור הפופולריות ואת היכולת ההפוכה של גישות גנטיות הפוכה במודלים של מלריה מכרסמים, מספר מתודולוגיות שונות השתמשו כדי לנתח את פנוטיפים של שלבים מחזור החיים טפיל הטרנסגניים, במיוחד שלבי הדם. עם זאת, חלק ממתודולוגיות אלה אינן עקביות; למשל, השוואת זיהומים של טפילים בשלב הדם בעקבות הזרקת IP (אשר עלולים להיות מנוקז לבלוטות הלימפה הצפק, משם, יכול להיכנס למחזור הדם; לכן, טפילים מוזרק לא לסיים באופן שווה בזרם הדם) , השוואת העברת היתוש של שיבוטים עם מספר שונה של העברות הבמה דם סדרתי או מספר G (אשר יכול להשפיע על gametocytogenesis32,33), או השוואת טפילים טרנסגניים ישירות לסוג פראי נאיבי (WT) טפילים שמעולם לא נחשפו לאלקטרופורציה ולבחירת סמים חיוביים ולהערכות השונות הבלתי מתוקננת של ההלקאה הגברית. לכן, זה חיוני כדי לתקנן פרוטוקולים כי הם פשוט לעקוב אחר ניתוח פנוטיפ של כל סוג של הטרנסגניים או הטפילים מכרסם מכרסמים בדם ביתוש כדי להתאים את היכולות הביולוגי של מלריה מכרסמים מין טפיל.
בזאת, אנו מדווחים על פרוטוקול ניסיוני מפורט מפורטים לניתוח פנוטיפ של דם ויתושים בשלבים מחזור החיים של הטרנסגניים או מסוג פראי p. yoelii ו p. ברגניי טפילים. פרוטוקולים אלה חלים גם על p. שאבו ו p. ויניקאי טפילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי בעלי החיים המתוארים כאן נערכו על פי הפרוטוקולים המאושרים של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוליין וועדת האתיקה של בעלי החיים באוניברסיטת בזועלם. כל הפרוטוקולים הניסיוניים האחרים והשימוש ב-DNA רקומביננטי נערכו על פי הפרוטוקולים המאושרים של ועדת Biosafety טיחות מוסדית (IBC) של אוניברסיטת טוליין.
1. זיהום של עכברים עם דם בשלב טפילים עבור Parasitemia ניתוח וזיהום יתוש Assays
- יום 3: הזרקה אופציונלית של פנילהידראזין לעכברי הנמען
- הכנס מוגדל SW או עכברים CD1 הנמען (עכברים שישמשו לזיהום יתושים וזיהום יתוש assays) intraperitoneally (IP) עם 100 μL של פנילהידראזין (50 mg של פנילהידראזין ב-5 מ ל של מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS)) באמצעות מחט G 26 מזרק.
הערה: עבור דלקות יתושים חזקות של p. ברגניי ו -p. yoelii, המשמש פנילהידראזין כדי לגרום לרטיקולוקטוטוסיס בעכברי המטופל, המגביר את הparasitemia ולאחר מכן את אחוז הגיים-ציטים ובאופן משמעותי מגביר את ההלקאה של מגיים זכר (איור 5), אשר יוביל לזיהום בשלבים של יתוש טוב יותר עבור שניהם p. ברגניי ו p. yoelii זנים15,16,17, . שמונה עשרה
- הכנס מוגדל SW או עכברים CD1 הנמען (עכברים שישמשו לזיהום יתושים וזיהום יתוש assays) intraperitoneally (IP) עם 100 μL של פנילהידראזין (50 mg של פנילהידראזין ב-5 מ ל של מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS)) באמצעות מחט G 26 מזרק.
- יום -2: הזרקה של מניות טפיל קפוא לתוך עכברים תורמים
- במהירות הפשרה cryopreserved מניות קפוא ולהזריק מיד כל העכבר תורם (בדרך כלל שני עכברים לכל גנוטיפ) IP עם ~ 200 μL של מלאי באמצעות מזרק מחטים של 26 G.
הערה: לא יותר מחמישה עכברים ממוקמים בכל כלוב בתוך הגדרות יבר מבוקרת. - התחל לבדוק parasitemia תחת מטרה מיקרוסקופ 100x על Giemsa-מוכתם דם דק לאחר 24 שלאחר ההדבקה. בצע את סעיף 2.1 של הפרוטוקול עבור Giemsa-מוכתם ריח דם דק.
הערה: בשל חוסר היכולת לספור בדיוק את השלבים ששרדו דם קיימא לאחר במהירות להפשיר והזרקת הקריובית דם נגוע, עכברים תורמים לקבל את הדם הקריושמורות הראשון. האריתרופוציטים הנגועים של עכבר התורם ניתן לכמת ולהשתמש בדיוק לאחר מכן.
- במהירות הפשרה cryopreserved מניות קפוא ולהזריק מיד כל העכבר תורם (בדרך כלל שני עכברים לכל גנוטיפ) IP עם ~ 200 μL של מלאי באמצעות מזרק מחטים של 26 G.
- יום 0: דימום מעכברי התורם
- לדמם את העכברים התורמים (ראה סעיף 3.1) כאשר הפאראמטים שלהם הוא בין 0.1% ו 1%, אשר מושגת בדרך כלל 2-3 ימים post-קפוא-מלאי זיהום במקרה של P. yoelii 17X-NL ו P. ברגאי אנקה זנים.
- השתמש הניקוב וריד הפנים (כדי להגיע בין 200 ו 500 μL), או לדמם סופני בעלי החיים על ידי ניקוב לב (כדי לקבל בין 600 μL ו 1.2 mL) של דם נגוע. סופני לדמם את העכברים על ידי ניקוב לב כפי שמתואר בפירוט בסעיף 3.1.
הערה: דימום וריד הפנים אינו שיטה שגרתית של קבלת דם כפי שהוא הרבה יותר קשה ליישם והוא מאוד מלחיץ לעכברים, לעומת דימום סופני. Parasitemia אופטימלית עבור דימום של עכברים התורמים הוא בין 0.1%-1% כי, בטווח הזה parasitemia, יש מעט מאוד gametocytes (אשר לא יכול לשכפל כדי לייצר שלבים מינית בדם) ויש פחות כפול או משולש הנגועים אריתרופוציטים (אשר הופך את הקוונפיקציה למדויקת פחות).
- יום 0: כימות של דם נגוע להכין מינונים של אריתרופוציטים נגועים על ידי מדלל סדרתי
- הכינו דילול סדרתי של דם תורם על ידי הוספת 100 μL של דם לצינור מיקרוצנטריפוגה (דילול צינור 1). הוסף 900 μL של RPMI בינוני לצינור 1 ומערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם אותו טיפ פיפטה, יצירת דילול 1:10.
- קח 100 μL של דם מדולל מצינור 1 ולהוסיף אותו צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (שפופרת דילול 2). הוסף 900 μL של RPMI בינוני לצינור 2 ומערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם אותו טיפ פיפטה, יצירת דילול 1:100.
- חזור על שלבים ה1.4.1 וה1.4.2 לבצע שתי הפרשות טוריות נוספות, יצירת 1:1000 (דילול שפופרת 3) ו-1:10000 מדלל (שפופרת דילול 4).
- הוסף 12 μL של דם מדולל מן הצינור 3 ו 12 μL של דם מדולל מצינור 4 לצדדים שונים של הומוציטוטומטר ולקבוע את המספר הממוצע של אריתרופוציטים על כל צד של הומוקיטומטר. . תכפיל את המספרים ב -10 הכפל את המספרים לפי פקטור הדילול, 1,000 או 10,000, בהתאמה, כדי לקבוע את מספר האריתרופוציטים ב 1 μL של כל דילול.
- לחלק את המספר הרצוי של אריתרופוציטים נגועים להיות מוזרק על ידי מספר אריתרופוציטים ב 1 μL של כל דילול כדי לקבוע את הנפח של דם תורם מדולל הדרוש להזרקה. בחר את הדילול עם הנפח המתאים ביותר להזרקה, להוסיף את אמצעי האחסון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, ולהשלים אותו ל-120 μL עם מדיום RPMI.
- יום 0: הזרקה ורידית של עכברי הנמען
- מניחים את עכברי הנמען תחת מנורה אדומה חום כדי להתרחב וורידים להזרקה. לטעון את מינונים טפיל ב 27 גרם אינסולין מזרק ולמקם את העכבר הנמען בתוך הרחקה.
- הכנס 1,000,000 או 10,000 אריתרופוציטים נגועים באופן פנימי (IV) באמצעות 27 מזרק אינסולין בעכבר כל הנמען עבור זיהום יתושים בחני או עבור הצמיחה מינית בשלב דם המין, בהתאמה. המשיכו לשמור על העכברים תחת תנאי דיור סטנדרטיים.
הערה: הזרקת IP היא שיטה עקיפה של החדרת טפילים לתוך הדם, כמו אריתרופוציטים פרזיטים יש לעבור דרך בלוטות הלימפה ניקוז של חלל הצפק כדי להגיע לדם. זה עושה הזרקת IP מסלול משלוח עקיף להזרקת מספר מדויק של טפילים לתוך הדם. לכן, תוואי העירוי מועדף, שכן הוא מספק מינונים מדויקים של טפיל ישירות למחזור הדם, כפי שמוצג באיור 3 ומתואר בתוצאות הנציגים.
2. קביעת העומס בשלב הדם הטפיל עבור שלבים מיניים ומין
הערה: בסעיף זה, הערכה סטנדרטית פנוטימית שיטות של מלריה טפילים שלבים מפורטים. שיטות אלה שימושיות בהערכת מלריה או מועמדים לחיסונים או אפילו הסתרה גנטית על פיתוח שלבים מיניים ומינית באותם עכברים ניסיוניים. של הערה, p. שאבו ו p. vinckei הם גם אפשרויות הגיוניות מאוד חשוב חלופה עבור סוגים אלה של assays במיוחד בהקרנה סמים.
- קביעת הפרתרים של שלבים בעלי מיני וזכר vs מגיים נקבה על ידי Giemsa-מוכתם בריח דם דק לגידול טפיל שאומר
- באמצעות המחט 26 G או 27-G, שמוק הזנב של העכבר ולאסוף את droplet הדם על שקופית מיקרוסקופ. השתמש בקצה הקצר של שקופית מיקרוסקופ אחרת כדי למרוח במהירות את הדם על פני השקופית.
- תקן את השקופית עם 100% מתנול עבור לפחות 1 דקות, רק לאחר שהדם התייבש לחלוטין בשקופית. כתם ב 10% Giemsa עבור 10-15 דקות. רחץ את השקופית במים חד או כפולים מזוקקים ואפשר לו להתייבש.
- לקרוא את השקופית באמצעות מטרה 100x וטבילה שמן תחת מיקרוסקופ אור. עבור מדידה מדויקת של parasitemia, בדוק לפחות סך של 6,000 אריתרופוציטים, אשר ניתן להשיג על ידי ספירת לפחות 30 או 40 רשתות מיקרוסקופיים עם מספר ממוצע של 200 או 150 אריתרופוציטים (RBCs) לכל רשת, בהתאמה. ספירת המספר הכולל של RBCs ברשתות הראשונות והאחרונות כדי לקבוע את המספר הממוצע של תאי דם אדומים עבור כל הרשתות.
- לספור את המספר הכולל של אריתרופוציטים מושפעים לכל רשת. מgametocytes זכר ונקבה ניתן לספור בנפרד כדי לקבוע gametocytemia אבל צריך להיכלל גם את הספירה parasitemia סה.
- קבע את האחוז הכולל של הפאראממיה על-ידי חלוקת המספר הכולל של האריתרופוציטים באמצעות המספר הכולל של RBCs שנצפתה. הכפל מספר זה על ידי 100 כדי לקבוע את אחוז הפאראממיה.
- לקבוע את gametocytemia על ידי חלוקת המספר הכולל של gametocytes שנספר על ידי המספר הכולל של RBCs נצפתה. הכפל מספר זה על-ידי 100 כדי לקבוע את אחוז הgametocytemia לכל עכבר.
הערה: השיטה האמינה היחידה לבידול בין שלבי דם שונים ומיניים מינית, היא השימוש במיקרוסקופ להערכת Giemsa-מוכתם בריח דם דק, כמו כל אחד מהשלבים יש מורפולוגיה שונה, למעט gametocytes בוגר, אשר אינם זהים בעיקר בשלבי דם מינית.
- קביעת בשלב הדם פאראטמיה על ידי זרם cy, לנסות כתבת פלורסנט חלבון-המבטא WT בדומה לזנים של טפיל
- סמן שתי צינוריות מיקרוצנטריפוגה לכל דגימת עכבר, והגדרת צינור אחד במשך 1:1000 דילול והשני עבור דילול של 1:2000. הוסף 1.5 μL של הפארין 1x ל 1:1000 דילול צינור.
- באמצעות המחט 26 G או 27 G, שמוק הזנב של העכבר ולהעביר 1.5 μL של דם לצינור המכיל 1.5 μL של 1 x הפארין (1:1000 דילול שפופרת). ערבב את הדם ואת ה-1x הפארין בעדינות יחד על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
- הוסף 1,497 μL של RPMI בינוני לצינור המיקרוצנטריפוגה, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
- העברת 500 μL של התערובת מ-1:1000 שפופרת דילול לצינור דילול 1:2000. הוסף 500 μL של RPMI בינוני לצינור 1:2000 ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
- בצע את פרוטוקול ההפעלה המתאים של היצרן עבור cytometer הזורם. הפעל את הדגימות בקצב זרימה איטי והגדר את האיתור לפחות 20,000 אירועים.
הערה: יש בחינה מעשית חלופית כדי למדוד parasitemia באמצעות טריקולור מיון facs, אם טפילים לבטא סמנים פלורסנט או לא34. עם זאת, התיקון המתואר כאן מציע מידה מדויקת של parasitemia בטפילים חיים ללא תוספת של כל מימוש בצבעי ה-DNA והשימוש מיון FACS.
- קביעת שיעור ההלקאה של מגיים זכרים למיקרו-ליטר של דם העכבר הנגוע
- הכינו 1:10 מיקרוצנטריפוגה דילול עם 40 μL של בינוני ookinete בלתי מושלם (RPMI + נתרן ביקרבונט + היפוקסלך + החומצה קסת'ותאית) ו-5 μL של הפארין 1x.
- באמצעות המחט 26 G או 27 G, שמוק הזנב של העכבר ולהעביר 5 μL של דם (באמצעות מיקרופיפטה) במהירות לצינור המכיל את הookinete המדיה השלם + הפארין. מערבבים בעדינות ולטעון 12 μL של 1:10 דם דילול שפופרת לתוך הטציטוטומטר ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר (20-24 ° c).
- התחל לספור את אירועי ההלקאה 9-10 דקות לאחר הכנת הדילול ה1:10. השתמש במיקרוסקופ אור בשלב הניגודיות עם ההגדלה של 40x.
- הכפל את המספר הממוצע של אירועים להלקאה שנספרו ב-10 ולאחר מכן הכפל לפי פקטור הדילול (10) כדי לקבוע את המספר הממוצע של הלקקאה למיקרו-ליטר של דם נגוע.
הערה: שיטת הפעולה מודדת את מספר אירועי המשחק הגברי בנפח μL אחד של דם, שניתן לכמת באמצעות התקן הומוציטוטומטר. בינוני ookinete לא שלם18 מעורבב עם הדם כדי לחקות באופן מקרוב את התנאים שבהם מתרחשת ההלקאה בתוך מידת היתושים זמן קצר לאחר ארוחת דם.
3. בידוד ועיבוד של דם-טפילים הבמה של אריתרופוציטים מזוהם הכנה מניות קפוא
- דימום סופני של מכרסמים נגועים על ידי ניקוב לב
- הכן 26 מזרק מחט G המכיל כ ≤ 20 μL של הפארין 1x (200 יחידות/mL) כדי לאסוף את הדם של העכבר התורם על ידי ניקוב לב.
- השתמש בזרימה איטית של CO2 כדי להרדים את העכבר לפני הדימום. לחילופין, מורדם העכבר עם isofלאנה (אשר צריך להישמר לפני ובמהלך החתך העור כדי לחשוף את הלב).
- הנח את העכבר על גבו ולהצמיד את התוספות שלו. לעשות חתך קטן בעור ליד הבסיס של עצם החזה על ידי משיכת העור עם מלקחיים וחותכים אותו עם מספריים. משוך את העור לגזרים באתר של החתך כדי לחשוף את הסרעפת ואת החלק העליון של חלל הבטן.
- להחזיק את הבסיס של הצלעות עם מלקחיים וחותכים דרך הסרעפת כדי להיכנס לחלל החזה; להיזהר לא לפגוע בלב או בריאות. הצמד חזרה את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
- מנקבים בעדינות את הלב ומושכים באיטיות את המזרק כדי לאסוף ~ 1 מ ל של דם ולהעביר אותו לשפופרת מיקרוצנטריפוגה.
- הכנת מניות קפואות מהדם הנגוע
- לדמם את העכברים (ראה סעיף 3.1) עם שבויי דם שאינם בין 2% ו 5%, עם כמות משמעותית של שלבי הטבעת ולא כמו gametocytes רבים.
- מערבבים את החלק הרצוי של דם עם פתרון הקפאה (10% גליצרול בתמיסה של Alsever) ביחס 1:2 וחנות בבקבוקונים קריוגניים. . להקפיא בחנקן נוזלי
- בידוד וטיהור של טפילים בשלב הדם להפקת דנ א, RNA, וחלבונים
- עכברים בליד (ראה סעיף 3.1) עם שבויי דם גבוהים מ-0.5%.
- הכינו מזרק של 10 מ ל על ידי הסרת הבוכנה והכנסת ספוגית כותנה קטנה. . תארוז את הכותנה לתחתית המזרק למלא אותו עם תאית עד רמת התאית מגיע לסמן 3 mL אבל לא עולה על 4 mL על המזרק.
- אבטחו את המזרק לתוך סרטון על דוכן הטבעת והניחו צינור פסולת מתחתיו. הוסיפו 5 מ ל של PBS למזרק והניחו לו לזרום לתוך צינור הפסולת.
- להכין מניות קפוא במידת הצורך, שימוש רק 100-300 μL של דם. הוסף את שאר הדם הנגוע (400-700 μL) לעמודה. לאסוף זרימה באמצעות צינור פסולת עד טיפות להתחיל להפוך אדום. ברגע שהטיפות מתחילות להפוך לאדומות, במקום שפופרת אוסף חדש של 14-mL מתחת למזרק כדי לאסוף את הזרימה.
- לאחר שזרימת הזרם מתחילה להאט, הוסיפו את ה-PBS למזרק ואספו את הזרימה בצינור האוורור של 15 מ ל עד לכמות כוללת של 14 מ"ל. לאסוף את הזרימה הנותרת באמצעות צינור פסולת.
- צנטריפוגה את שפופרת 14 מ"ל עם דם/PBS תערובת עבור 8 דקות ב 250 x g עם בלמים לא. הסר את supernatant ולהוסיף 14 מ ל של סאפונין מקורר (50 מ"ג של סאפונין ב 50 ml של PBS). כדי להוציא את הגלולה, להפוך את הצינור מספר פעמים ומערבולת במידת הצורך.
- צנטריפוגה את הצינור עבור 8 דקות ב 1,217 x g ללא בלמים. הסר את supernatant, עוזב כ 0.5 mL של הפתרון מעל הגלולה.
- השהה מחדש את הגלולה בתמיסה בעזרת מיקרופיפטה והעבירו אותו לשפופרת מיקרוצנטריפוגה. הוסף 500 μL של PBS ל 14 מ ל שפופרת לשטוף כל טפילים שיורית שנשארו בצינור. תוסיף את זה. לאותה צינורית מיקרוצנטריפוגה
- צנטריפוגה את הצינור עבור 2 דקות ב 6,010 x g. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש 1 מ ל של PBS. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 9,391 x g.
- המשך לחלץ DNA גנומית, סך RNA, וחלבונים.
- עבור הפקת DNA גנומית, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה ב 200 μl של PBS, ולאחר מכן בצע את הפרוטוקול המתאים של חילוץ gdna.
- עבור החילוץ סך RNA, להסיר את supernatant, להשהות מחדש ומערבולת את הגלולה ב 1 מ ל של כל פנול-ו guanidine isothiocyanate מבוססי פתרון או כל מגיב אחר מתאים, ולאחר מכן, בצע כל פרוטוקול מתאים של החילוץ הכולל RNA.
- להפקת חלבון מוחלט, להסיר את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה בנפח המתאים של 6x נתרן dodecyl סולפט (sds)-העמסה צבע או כל מגיב מתאים אחר, ולאחר מכן, בצע את כל הפרוטוקול המתאים של עיבוד חלבון מוחלט.
4. דלקת יתוש באספלי
הערה: היתוש הוא המארח העיקרי של טפילי מלריה שבו הרבייה המינית מתרחשת. הזיהום של עכברים כדי לשדר טפילים מלריה ליתושים מתנהל על ידי הזרקת IV של לפחות 1,000,000 בשלבים דם, ואחריו האכלה עכבר נגוע (מכל גנוטיפ המציג את שיעור ההלקאה הגברי הגבוה ביותר) כדי ל אנופלס יתושים בכלוב ביום 3 לאחר העכבר זיהום. הזרקת IV עם 1,000,000 דם-בשלב טפילים בעכברים מטופלים פנילהיהידראזין יבטיחו התפתחות של זכר ונקבה gametocyte בקצב מהיר וגבוה יותר. יתושים נגועים p. yoelii ו -p. ברגניי מודבטים ב -24 ° c ו 20-21 ° c, בהתאמה, כדי לאפשר את הטוב ביותר האפשרי בשלבים יתוש פיתוח6.
- האכלה נגד יתושים וקביעת מספר ookinetes לכל יתוש
- אנופלס הנקבה להרעיב את האישה מבוגרת או . gambiae יתושים (4-7 ימים בן) עבור 8-12 h לפני האכלה. אפשר ליתושים מבוגרים להאכיל לפחות 15 דקות על עכברים נגועים מזוהמים (מוזרק עם מנה מתאימה של קטמין/xylazine) עם שיעור ההלקאה הגבוה ביותר (נמדד בסעיף 2.3).
הערה: הפתרון העובד קטמין/xylazine מוכן על ידי הדילול 1:5 של פתרון המניה ב מלוחים ו-IP הזרקת 100 μL לכל עכבר. עבור פתרון מניות של 10 מ ל, 1 מ ל של xylazine (100 mg/mL) מתווסף ל -9 מ ל של קטמין (100 mg/mL). - להסיר יתושים נקבה שאינם מוזנים ויתושים זכרים עם מייבש הפה.
- ב 18-20 h האכלה, לאסוף 20-30 יתושים ולמקם אותם במקפיא עבור לא פחות מ 10 דקות כדי להבטיח מוות. באמצעות היקף הניתוח המשקפת, לנתח את 20-30 דם ממולא מעיים עם 2 26 G או 27 G מחטים או מחט ומלקחיים ב RPMI או PBS בינוני לנתיחה ולהעביר את המעיים מדיום לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 200 μL של RPMI או PBS (עבור שיטת הניתוח אנא ראו סעיף 4.3).
- צנטריפוגה את צינור האיסוף עבור 1 דקות ב 700 x g. לטחון את המעיים. בעזרת מצנח חזור על שלב זה.
- העבר 50 μL מצינור המעיים של הקרקע לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הוסף 200 μL של RPMI או PBS כדי ליצור דילול 1:5.
- העבר 12 μL ל-הומוציטוטומטר ומארג אותו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כדי לאפשר לתוכן להתיישב.
- קבע את המספר הממוצע של ookinetes באמצעות מיקרוסקופ קל עם ניגודיות פאזה ו-40x הגדלה.
- הכפל את המספר הממוצע של ookinetes בוגרים ב-10 ולאחר מכן על-ידי פקטור הדילול של 5 כדי לקבוע את המספר הכולל הממוצע של ookinetes.
- לחלק את המספר הממוצע של ookinetes על ידי מספר היתושים הניזון דם גזור כדי לקבוע את מספר הookinetes ליתוש הזנת דם.
- אנופלס הנקבה להרעיב את האישה מבוגרת או . gambiae יתושים (4-7 ימים בן) עבור 8-12 h לפני האכלה. אפשר ליתושים מבוגרים להאכיל לפחות 15 דקות על עכברים נגועים מזוהמים (מוזרק עם מנה מתאימה של קטמין/xylazine) עם שיעור ההלקאה הגבוה ביותר (נמדד בסעיף 2.3).
- קביעת מספר מוקדם של האוציסטות עבור כתבת הפלורסנט חלבון-המבטא WT בדומה לזנים של טפיל
הערה: מטרת הקביעה הזאת היא לקבוע את מספר הטפילים החי המבטא חלבון פלורסנט ירוק (GFP) כי הקימה זיהום מלא של המעיים היתושים ויצרו מוקדם כדורי oocysts. שיטת הפעולה קובעת אם הookinetes (התפתחותם המשוערת בתוך המנה הקודמת) השלימה את תפקודם על-ידי החציית התאים הסרטניים באמצעות מידולי היתושים והפיכתו לציסטות מוקדמות על צד הבסיס של המעי התיכונה אפיליה או לא זהו עוד שיטת פעולה אשר עושה שימוש גדול של טפילים המבטא gfp, כמו ספירת מוקדם אאוציסטות בשלב זה יהיה כמעט בלתי אפשרי ללא כתמים חיסונית מייגע.- לנתח את המעיים (ראה סעיף 4.1) של 20-30 דם הניזונה יתושים, ביום 3 או 4 לאחר יתוש האכלה (pmf) עבור p. yoelii 17X-NL, וביום 6 או 7 pmf עבור p. ברגניי אנקה, עם 2 26 g או 27 מחטים g או מחט ומלקחיים ב RPMI או PBS לנתח m edium (לשיטת הניתוח אנא ראו סעיף 4.3).
- התפשטות 40-50 μL של בינוני לחיתוך על קו האמצע האופקי של הקצה הארוך של שקופית הזכוכית. העבירו את הקרביים לקו זה, אחד בכל פעם, במהלך הניתוח, ולהוסיף בינוני יותר למעיים, אם יש צורך, כדי למנוע ייבוש.
- , הניחו שמיכות בעדינות על המעיים. ואטמו אותו בלק
- באמצעות מטרת 10x או 20x של מיקרוסקופ פלואורסצנטית עם מסנן הזריחה ירוק, לספור את מספר האוציסטות המוקדמות על כל בינוני, לפחות 20 מידות.
- קביעת מספר הספנוזוענים לכל יתוש
- לנתח את המעיים של לפחות 20-30 יתושים עם 2 26-G או 27-G מחטים או מחט ומלקחיים ב RPMI או PBS בינוני לאסוף את המעיים לגזור ב 200 μL של RPMI.
- החזיקו את מקטעי הבטן התחתונה בחוזקה במקום עם מחט אחת (או מלקחיים) ובעדינות דחפו את בית החזה בכיוון כלפי מעלה עם המחט השנייה בצומת שבין בית החזה לבטן. יש לחיצות קצרות בזהירות עד שהחזה מפריד בין הבטן. ברגע שההפרדה מתחילה המעי הלבן יופיע מתוח, ואז באמצע הבטן יהיה לחתוך את סוף הוושט באמצעות אותה מחט ששימש כדי להפריד את החזה. אם עדיין מחוברים לבטן, אותו מחט יכול לשמש כדי למשוך את המעיים הרחק מן הבטן. להעביר את המעיים של כל היתושים לצינור האוסף ידי איסוף אותם מן המדיום עם מחט, אחד בכל פעם.
- צנטריפוגה את צינור האוסף עבור 1 דקות ב 700x g כדי ליישב את המעיים לחלק התחתון של הצינור האוסף ולטחון אותם עם pestle. חזור על שלב זה.
- העבר 12 μL ל-הומוציטוטומטר ומארג אותו בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כדי לאפשר לתוכנו להתיישב.
- שימוש במטרה 40X של מיקרוסקופ אור. השתמש 1:5 ו/או 1:10 דילול אם פסולת יתושים מונעת את ספירת מדויק של הספוראוטים או אם מספר הספוראוזוטים גבוה מדי כדי לספור במדויק.
- לחשב את המספר הכולל הממוצע של הספנואים sporozoites על ידי הכפלת המספר הממוצע של sporozoites על ידי 10 ולאחר מכן, הכפלת מספר זה על ידי פקטור הדילול, אם בכלל, ועל ידי הנפח הכולל (200 μL).
- לחלק את המספר הכולל הממוצע של sporozoites על ידי מספר היתושים לגזור כדי לחשב את המספר הממוצע של הספאוציסטה sporozoites לכל יתוש.
הערה: טעות נפוצה למדידת ההצלחה או הפרודוקטיביות של זיהום בשלבים של יתושים היא ספירת מספר אאוציסטות בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות אאוציסטות. זה בגלל כמה אאוציסטות להיות ונקוו בנקודות זמן מאוחרות יותר של פיתוח אאוציסטות, ואחרים אינם מצליחים לפתח sporozoites, אפילו על אותו אמצע המעיים. השיטה הטובה ביותר והאמינה ביותר כדי לקבוע את הפרודוקטיביות של זיהום בשלבים היתושים היא ספירת המספר הממוצע של מידת הנבגים של המעיים של המעי התיכונה בימים 10-12 פוסט-יתוש-זיהום עבור P. yoelii ובימים 12-14 שלאחר-יתוש-זיהום עבור P. ברגניי.
- קביעת מספר הספורטים של בלוטת הרוק לכל יתוש
הערהההערכה האולטימטיבית של השלמת מלא של התפתחות שלבי היתושים מושגת על ידי הערכת מספר הספוראוזוטים שפלשו לבלוטת הרוק, שהם השלבים הדבקות והזיהומיות של בעלי חוליות. הפלישה של בלוטת הרוק היא הוקמה לאחר השלמת התפתחות sporozoite של oocyst, היציאה לתוך המוליקמ, המצורף הבסיסי לאמה של תאים בלוטת הרוק בלוטות, וחציית התאים השכבתית להגיע בלוטות הרוק צינורותמיכל 5. לפיכך, שיטת החישוב הזאת היא גם הערכה של הצלחת כל התהליכים הללו או לא. עם זאת, הערכה של המוליקמ מספרים sporozoite יאפשר הבידול בין פגמים ביציאה מ אאוציסטות ופגמים בפלישה של בלוטות הרוק35. טיהור של בלוטת הרוק sporozoites מאפשר ניצוח מספר רב של תפקודי פונקציונלי על התנועתיות sporozoites ופנוטיפים פלישה. בלוטת הרוק sporozoites יכול לשמש גם עבור זיהום vivo של עכברים במחקרים חיסונים36,37. יתר על כן, השלבים הניתנים לשימוש ביותר הזמינים להקמת הפלישה בכבד מבחנה או שיטת הפיתוח היא על ידי השימוש של הרוק בלוטת sporozoites.- לנתח את בלוטות הרוק של 50-100 נשים יתושים, בימים 14-16 pmf עבור p. yoelii ובימים 17-20 pmf עבור p. ברגניי, רצוי עם 2 26 g או 27 מחטים g, ב RPMI או dmem דיום בינונית שמרו על הקרח ושיושלם עם 5% סרום שור עוברי (fbs) (BSA) בעבור p. yoelii מספורטים או 3% FBS/bsa עבור p. ברגניי ספורזוטים. אם יש להשתמש בספזומה ב-hepatoma בתוך מבחנה, להוסיף 1% פניצילין/סטרפטומיצין למדיום הניתוח. יש בדרך כלל שתי שיטות לניתוח של בלוטות הרוק. השיטה הראשונה היא גוזלת זמן אבל מוביל את הניתוח של בלוטות הרוק עם מעט מאוד או ללא רקמות מזהם. השיטה השנייה פחות גוזלת זמן, אך מובילה לאיסוף כמות משמעותית של רקמות מזהם. השיטה הראשונה מפורטת כאן.
- החזיקו את מקטעי הבטן העליונים במקום עם הצד השופע של מחט אחת ובזהירות דחפו את הראש בקלילות רבה (בדחיפה קצרה מאוד) בצומת שבין הראש לבית החזה בכיוון כלפי מעלה עד שהראש מופרד בזהירות מבית החזה ללא קורע את בלוטות הרוק מזוגגות, בלוטות הרוק חשוף מופרדים לאחר מכן מהראש עם מחט זהה כי דחף את הראש כלפי מעלה.
- בלוטת הרוק לגזור יהיה לגדל מתוך בינוני הניתוח בעזרת זכוכית קצר פסטר.
- כאשר כל בלוטות הרוק כבר גזור וקצרו, כישרון יהיה למקם את הצינור המכיל את המעיים לתוך הצנטריפוגה (1min, 700 x g).
- לספור ספוראוזוטים באמצעות הומוציטוטומטר תחת מיקרוסקופ אור המוגדר לשלב 2 ניגודיות ו 40x הגדלה. אם מספר היתושים לגזור ≥ 40, לדלל את בלוטות הרוק ל 1:5 או 1:10, בהתאם לתשואה הנגועים צפוי (נקבע בתחילת assays).
- הכפל את המספר הממוצע של הספורזוטים ב -10 ואת גורם הדילול (אם בכלל). הכפל לפי אמצעי האחסון הכולל כדי לקבוע את המספר הממוצע של מספורטים בלוטת הרוק. לחלק לפי מספר היתושים בגזור לקבוע את הממוצע בלוטת הרוק sporozoites לכל יתוש.
הערה: הבעיה עם הניתוח של בלוטות הרוק הוא גודל קטן שלהם מראה שקוף מזוגגות. כך, קשה מאוד לבודד את בלוטות הרוק, ולכן, הם בדרך כלל לגזור כסכום כולל עם רקמות אחרות מהחלק הקדמי של בית החזה, אשר חשוב גם כדי להגן על בלוטות הרוק מן הקרע במהלך האוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההצלחה של החלת כלים גנטיים הפוכה וטכניקות לטפילים מלריה יש מהפכה בתחום של מחקר מלריה, עם היכולת להוסיף, למחוק, או לשנות מגזרים גנומית ספציפיים של כמה מינים פלמודניום 39. חשוב מכך, גנומית מקבל לוויתור זוהו והשתמשו בהצלחה כדי להחדיר סמנים חלבון הפלואורסצנטית מכרסמים וטפילים מלריה האדם על-ידי שילוב מחדש של הומוולוגי כפול, כדי להבטיח ביטוי יציב בכל מחזור החיים בשלבים40 ,41,42. דוגמה לטפילים אלה שנוצרו בדומה ל-WT הPy230p (-) טפילים, שהופקו במעבדה שלנו, ולא הראו פגם ברור בהתפתחות של דם ומחזור חיים של יתושים בשלבים15,16, 17. אלה טפילים כתב טרנסגניים הביעו egfp, תחת שליטתה של היזם חזק ומחוקה של PyHSP70, בשלבי דם (איור 1a) ookinetes (איור 1a), הצעיר אאוציסטות (איור 1a) ) על מידעיים אנופלס סטפני , ובתוך הספורזוטים מבודדים מבלוטות הרוק של הנקבות אנופלס סטפני (איור 1d). לפיכך, הטפילים המביעים את ה-eGFP שגרמו לזה להיות הרבה יותר קל ופחות זמן להעריך את ההערכה של שימוש בשלב הדם באמצעות הזרימה cy, לנסות בין גנוסוגים שונים של טפילים טרנסגניים או בין סמים מטופלים לבין מטופל באמצעות סמים שימוש בטפילים כתבת טרנסגניים
על מנת לאשר כי אין הבדל כמותי בין השימוש של cy, הזרמת הזרם ואת הערכה מייגע יותר של פאראמטמיה על ידי מיקרוסקופ, eGFP ביטוי Pyp230p (-) שימש להערכת אחוז האריתרופוציטים פרזיטוניים על ידי הזרמת cy, על ידי Giemsa-מוכתם דם דק בקבוצה של עכברים וובסטר שוויצרי הרביעי נגוע 10,000 פרזיטציטים. הזרימה cy, מנסה פאראטמיה% ערכים התכתב ישירות לparasitemia% המשוער על ידי ניטור Giemsa-מוכתם דם דק, אשר הוערך על ידי שני מדענים מומחים (איור 2). הדבר מייצג חלופה מדויקת יותר לשיטת המיקרוסקופיה מייגעת ומועדת לאדם של מיקרוסקופ בקביעת קצב הצמיחה של טפילים בשלב הדם.
פער חשוב הקשורים לזיהום של מכרסמים עם מלריה טפילים בשלבים דם היא הבחירה של תוואי של זיהום, עם העדפה חזקה בספרות עבור ה-IP בהשוואה לתוואי IV של זיהום, כפי שהוא פחות זמן צורכת. על מנת להשוות בין שני נתיבי הזיהום, שתי קבוצות של חמישה עכברים BALB/c נדבקו 1,000 eGFP-הביע Pyp230p (-) אריתרופוציטים לעכבר, או דרך העירוי או מסלולים IP. הparasitemia היה תחת פיקוח יומיומי באמצעות הזרימה cy, try לתקופה של 4 ימים. ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית בקבוצה הנגועה IP parasitemia% לעומת הקבוצה המודבקת IV צוין בכל הימים נבדק (איור 3). זה מספק ראיות כי המסלול זיהום IV הוא נתיב מדויק יותר כימות של זיהום עבור בחני עם מלריה בשלבים דם טפיל.
למרות זאת, מגבלה אחת לשימוש של הcy, לנסות להעריך את השלב דם parasitemia היא הבידול בין השלבים המיניים והלא מיניים ובין מגיים וזכר. לכן, הערכת האחוזים של כל אחד מהשלבים השונים מינית ומיניים שונים (איור 4) צריך להיות תלוי בהערכת מורפולוגיה של Giemsa-מוכתם דם דק. למרות המבנה השונה לכאורה של המשחק זכר ונקבה בוגרת gametocytes (איור 4), שלבים מיניים בלתי התבגרות זהים לעתים קרובות משלבים מינית.
אחד הפונקציה החיונית של המשחק הגברי על הופעתה של מגיים הגברי ב מידעיים היתוש הוא לההלקאה הגברי, שהוא צעד מאוד קריטי בשידור זה חייב לקרות בתוך תקופה קצרה מאוד של זמן. שיטות משתנה המשמשות להערכת הדבר במערכות רבות ושונות תוארו. להלן, אנו מראים שיטה סטנדרטית שניתן לחזור עליה בכל מעבדה פשוטה. הערכנו הערכה גברית הלקאה עם או בלי הזרקת פנילהידראזין לתוך עכברים הנמען (איור 5). אנו יכולים להראות כי הטיפול פנילהידראזין באופן משמעותי (ארבעה קיפול) הגדיל את שיעור ההלקאה הגברי, אשר בתורו יגדיל את שיעור הדישון ואת מספר כל שלבי היתושים הבאים.
איור 1 : התפתחות ה P. yoelii p230p (-) טפילים באופן מכונן המבטא egfp בדם ובשלבים יתוש. (א) דימוי של טפילים מעורבים בשלב הדם (1, 000x הגדלה). (ב) תמונה של Ookinete (400 x הגדלה). (ג) התמונה של יתוש אנופלס סטפני מידגוט נגוע ביום 4 pmf מוקדם של הp230p לחיות (-) טפילים ביטוי egfp (100x ההגדלה). (ד) לוח זה מציג תמונה חיה של P. yoelii p230p (-) בלוטת הרוק sporozoite, גזור ביום 15 pmf, ביטוי Egfp (400x הגדלה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הערכות לזרימה של הcy, ומיקרוסקופיה של בשלב הדם הממוצע parasitemia של P. yoelii p230p (-) טפילים אינם שונים באופן משמעותי. קבוצה של ארבעה עכברים וובסטר שוויצרי היה נגוע באופן שגרתי עם 10,000 פרזיטציטים של Pyp230p (-) לכל עכבר ו הממוצע בשלב דם שבויי מזון% נרשמו מדי יום עבור 7 ימים על ידי הזרמת cy, על ידי הערכה מיקרוסקופית של Giemsa-מוכתם בריח דם דק מסכום כולל של 20,000 ו-~ 6,000 אריתרופוציטים, בהתאמה. תוצאות הבדיקה המיקרוסקופית המוצגות הן ממוצע של שתי קריאות על-ידי שני מדענים מומחים בכל שקופית, והזמן להערכת הparasitemia של כל שקופית היה לפחות 10 דקות על ידי כל מדען. לא ניתן לזהות הבדלים משמעותיים בכל אחד מהימים המוצגים כאן. הערכים מרושע עבור כל הזנים הטפיל נותחו עם דו-זנבית t-test. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הזרקה ורידית של P. yoelii p230p (-) טפילים תשואות באופן משמעותי בשלב דם שונים parasitemia מתוך הזרקה של הצפק. שתי קבוצות של חמישה עכברים BALB/c נדבקו 1,000 פרזיציטים הטפיל של Pyp230p (-) לכל עכבר, או דרך הדרך לעירוי או בתוך הצפק, ו הממוצע בדם בשלב שבויי% נרשמו מדי יום עבור 4 ימים על ידי זרימה cy, לנסות מתוך סך של 20,000 אריתרופוציטים. הפחתה משמעותית מבחינה סטטיסטית (מסומן על-ידי כוכבית) של parasitemia בדם יכול להיות מזוהה לכל הימים נבדק בקבוצת התוואי בתוך הצפק לעומת הקבוצה הנתיב ורידי. הערכים מרושע עבור כל הזנים הטפיל נותחו עם דו-זנבית t-test. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : מורפולוגיה של P. yoelii gametocytes ב giemsa-מוכתם דם דק. תמונה של giemsa-ויטראז ' דם דק (1, 000x הגדלה) של עכבר וובסטר שוויצרי נגוע ב-WT P. yoelii 17x-NL מראה את המשחק הנשי האופייני כחלחל בצבע בצד שמאל (מסומן על ידי חץ) ו זכר בצבע ורדרד ( מסומן על ידי כוכבית) gametocyte בצד ימין של התמונה. השלבים האחרים המוצגים הם בשלבים דם מינית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : השפעת פנילהידראזין על הלקקאה גברית. השפעת פנילהידראזין הוזרק לעכברי הנמען 5 ימים לפני הערכת הלקאה הגברית של P. yoelii. פנילהיהידראזין מגבירה באופן משמעותי את קצב ההלקאה הגברית, המובילה לדלקות יתושים גבוהות יותר, שלאחר האכלה נגד יתושים. הערכים מרושע עבור כל הזנים הטפיל נותחו עם דו-זנבית t-test. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הדמיון בביולוגיה הכללית של מחזורי החיים שלהם זה של טפילים מלריה אנושית, מודלים מלריה העכבר גם יש הרבה וני מינים הפלסטיניום האנושי כי היה להגביל את השימוש שלהם אמין במודלים vivo . למשל, למעט טפילים חיים החליש כמו חיסונים, כל לימודי החיסונים עם יחידת ו-DNA וחיסונים אחרים נתן תוצאות מצוינות במודל העכבר, אבל בבני אדם החיים באזורים אנדמיים, התוצאות היו רחוקים משביע רצון.
בעיה נוספת היא ההבדל בין מחזור חיים בשלב הנגועים מתוך זן אחד של העכבר למשנהו, ולפעמים מספק אחד בעלי חיים למשנהו עבור מאמץ העכבר אותו. יתר על כן, שני המינים העיקריים של מלריה מכרסמים שנמצאים בשימוש נרחב כמועדף בדגמי מלריה vivo , p. ברגניי ו P. yoelii, לא מפגין סינכרוני מחזור שלב הדם, אשר שונה לחלוטין מכל מלריה אנושית טפיל. עם זאת, היתרונות של שימוש טפילים מלריה העכבר כמו במודלים vivo עולים על ידי הרבה וני אלה, אשר ניתן גם להתגבר על ידי ניתוחים יותר מעמיק של הכוננים המולקולריים של מגבלות אלה. אף על פי כן, מגבלות אלה מוצגות בעיקר על ידי טפילים מלריה בשלב דם, אבל לא הרבה עבור השלבים האחרים מחזור החיים של הטפיל מלריה.
למרות בשלבים דם חשובים עבור חיסונים שונים, מיקוד התרופה, אימונולוגיה, ומחקרים גנומית פונקציונלי, יש מחסור של שיטות סטנדרטיות פרוטוקולים להתרכז בניתוח פנופנאני ופונקציונלי מוסר כי כרוכים מלריה מכרסמים טפיל דם-שלב טפילים, עם דגש רב על שידור יתושים ופרוטוקולים העברת החצייה. לכן, השיטות במאמר זה יסייעו לספק פרוטוקולים סטנדרטיים ופשוטים ללימוד שלבים פתוגניים של טפילים מלריה מכרסם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אחמד אלי נתמך על ידי מימון וכלו באוניברסיטת משרד התחבורה התורכי 2015BSV036, ועל ידי מימון שסופקו על ידי בית הספר לבריאות של טוליין של בריאות הציבור ורפואה טרופית, ועל ידי מימון NIH-NIAID עבור R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
