Summary
Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.
Abstract
Recentes avanços em genética e tecnologias de biologia de sistemas têm promovido a nossa compreensão da biologia dos parasitas da malária no nível molecular. Entretanto, os alvos eficazes do parasita da malária para o desenvolvimento da vacina e da quimioterapia são ainda limitados. Isso se deve, em grande parte, à indisponibilidade de modelos relevantes e práticos de infecção in vivo para espécies humanas de Plasmodium , principalmente para p. falciparum e p. vivax. Portanto, espécies de roedores de malária têm sido amplamente utilizadas como alternativa prática em modelos in vivo para a vacina contra a malária, direcionamento de drogas, resposta imune, e estudos de caracterização funcional de Plasmodiumspp. genes conservados. De fato, modelos de malária por roedores provaram ser inestimáveis, especialmente para explorar a transmissão de mosquitos e a biologia do estágio hepático, e foram indispensáveis para estudos imunológicos. No entanto, existem discrepâncias nos métodos utilizados para avaliar os fenótipos de parasitas transgênicos e selvagens do tipo assexuado e sexual. Exemplos dessas discrepâncias são a escolha de uma infecção intravenosa versus intraperitoneal de roedores com parasitas no estágio sangüíneo e a avaliação do exflagellation masculino do gameta. Neste documento, detalhamos métodos experimentais padronizados para avaliar os fenótipos de estágios de sangue assexuado e sexual em parasitas transgênicos expressando espécies de parasitas da malária do tipo repórter-gene ou de roedores selvagens. Também detalham os métodos para avaliar os fenótipos de estádios de mosquito parasita da malária (gametas, ookinetes, oocistos e esporozoites) dentro de vetores de mosquito Anopheles . Estes métodos são detalhados e simplificados aqui para as cepas letais e não letais de p. berghei e p. de , mas também podem ser aplicados com alguns ajustes para p. chabaudi e p. espécies de malária de roedores de vinckei .
Introduction
Os parasitas da malária causam centenas de milhões de infecções por malária em humanos em todo o mundo, com mais de 600.000 mortes todos os anos1. As infecções humanas são causadas por cinco espécies de parasitas da malária, nomeadamente p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaee p. knowlesi. A maioria das mortalidades clínicas da malária é causada por P. falciparum na África Subsaariana1. Outra espécie de parasita da malária humana que causa grandes morbidades mundiais fora da África Subsaariana é P. vivax2. As outras três espécies são mais restritas geograficamente e causam infecções benignas da malária, exceto a letal P. knowlesi3. A indisponibilidade de modelos in vivo não-humanos relevantes e práticos de infecções sempre foi e ainda é um obstáculo à vacina contra a malária e ao desenvolvimento de fármacos. A segmentação por drogas de malária anterior e estudos metabólicos têm se invocado extensivamente em modelos de malária aviária como p. gallinaceum e p. lophurae, infectando galinhas e patos, respectivamente4. Posteriormente, espécies de roedores foram gradualmente introduzidas em várias vacinas e estudos de segmentação de drogas como modelos in vivo. Ao longo dos anos, as evidências de semelhanças da biologia e interações hospedeiro-parasita de estágios de ciclo de vida de modelos de malária de roedores para espécies de malária humana acumularam.
Em particular, os modelos de malária por roedores foram extremamente importantes para explorar e caracterizar a biologia de mosquitos e estágios pré-eritrocíticos5. No entanto, existem quatro espécies de malária por roedores (p. berghei, p. de, p. chabaudie p. vinckei) que apresentam diferentes características biológicas, sendo as mais notáveis nas etapas do sangue6. Espécies de roedores da malária diferem na sincronia das fases do sangue, onde as fases do sangue de p. chabaudi e p. cepas de vinckei são principalmente síncronas, enquanto os estágios sanguíneos de p. berghei e p. de não são6 , 7. outra diferença notável é a autodepuração de estágios sanguíneos que ocorre em algumas cepas (por exemplo, p. de 17x-NL, p. berghei NK65, e p. vinckei eubacterium), enquanto a infecção sanguínea de outros cepas da mesma espécie pode ser letal se não tratada (p. de 17x-L, p. berghei Anka, e p. chabaudi as). Além disso, p. de 17x-nl estirpe e p. berghei Anka estirpe preferem invadirreticulócitos8,9,10,11, embora estas características de p. as cepas de de e P. berghei não são um requisito de crescimento rigoroso12,13,14. Portanto, os camundongos são tratados com fenilhidrazina antes de uma infecção com os estágios sanguíneos desses parasitas para aumentar a parasitemia e gametocitemia necessários para uma infecção de mosquito para a cepa p. berghei Anka e para p. de 17x-nl15,16,17,18,19.
Diferenças no desenvolvimento de estágios de mosquitos também existem entre diferentes espécies de roedores, sendo a mais notável a temperatura e o tempo necessário para o desenvolvimento ideal dos estágios do mosquito e o comprimento de esporozoíta5,6, vinteanos. Em estágios pré-eritrocíticos de espécies de malária por roedores, as diferenças incluem as espécies de roedores e estirpes mais suscetíveis à inoculação de esporozoítos infecciosos, o número de esporozoites necessários para a inoculação em uma cepa de roedores suscetível, a tipos de células de mamíferos necessários para ensaios de desenvolvimento de fase hepática in vitro e o tempo para concluir o desenvolvimento do estágio hepático5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Apesar destas variabilidades, os parasitos da malária do roedor eram os modelos favoráveis cedo sobre para a aplicação de aproximações genéticas inversas, porque eram menos tempo-e consumir recursos com uma probabilidade elevada do sucesso31. Na verdade, os modelos de malária de roedores foram os melhores modelos, e em muitos casos os únicos modelos, disponíveis por vários anos para caracterizar funcionalmente genes expressos em estágios de mosquito e fígado.
À luz da popularidade e amenabilidade das abordagens genéticas reversas em modelos de malária por roedores, várias metodologias diferentes têm sido utilizadas para analisar os fenótipos de estágios do ciclo de vida do parasita transgênico, especialmente estágios sanguíneos. No entanto, algumas dessas metodologias são inconsistentes; por exemplo, comparando infecções de parasitas do estágio sanguíneo após uma injeção de IP (que são possivelmente drenadas para os linfonodos peritoneais e, a partir daí, pode entrar na corrente sanguínea; portanto, os parasitas injetados não acabam igualmente na corrente sanguínea) , comparando a transmissão do mosquito de clones com um número diferente de transferências seriadas de fase sanguínea ou número G (o que poderia afetar a gametocitogênese32,33), ou comparando parasitas transgênicos diretamente ao selvagem-tipo ingênuo (WT) parasitas que nunca foram submetidos a eletroporação e seleção de fármacos positivos e as várias avaliações não padronizadas da exflagelação masculina de gametas. Portanto, é crucial padronizar protocolos que sejam simples de seguir para a análise fenotípica de qualquer tipo de parasitas transgênicos ou de malária por roedores de WT no sangue e no mosquito para acomodar as variabilidades biológicas da malária por roedores espécies de parasitas.
Nisto, nós relatamos em um protocolo experimental padronizado, detalhado para a análise fenotípica dos estágios do ciclo de vida do sangue e do mosquito de parasita transgênicas ou Wild-Type de p. de e de p. berghei . Esses protocolos também são aplicáveis aos parasitas p. chabaudi e p. vinckei .
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Protocol
Todos os experimentos animais aqui descritos foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Tulane e do Comitê de ética em animais da Universidade Bezmialem Vakif. Todos os outros protocolos experimentais e o uso de DNA recombinante foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados do Comitê de biossegurança institucional (IBC) da Universidade de Tulane.
1. infecção de camundongos com parasitas de fase sanguínea para análise de parasitemia e ensaios de infecção de mosquitos
- Dia-3: injeção opcional de fenilhidrazina em camundongos beneficiários
- Injete camundongos de receptor de SW ou CD1 (camundongos que serão usados para ensaios de infecção de mosquito e infecção de mosquito) intraperitonealmente (IP) com 100 μL de fenilhidrazina (50 mg de fenilhidrazina em 5 mL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS)) usando uma agulha de 26 G Seringa.
Nota: Para infecções robustas do mosquito de p. berghei e de p. de, o fenilidrazina é usado para induzir o reticulocitose nos ratos do receptor, que aumenta o parasitemia e, subseqüentemente, a porcentagem dos gametocytes, e significativamente aumenta o exflagellation de gametas masculinos (Figura 5), que conduzirá a uma infecção melhor dos estágios do mosquito para cepas de p. berghei e de p. de 15,16,17, de 18 anos.
- Injete camundongos de receptor de SW ou CD1 (camundongos que serão usados para ensaios de infecção de mosquito e infecção de mosquito) intraperitonealmente (IP) com 100 μL de fenilhidrazina (50 mg de fenilhidrazina em 5 mL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS)) usando uma agulha de 26 G Seringa.
- Dia-2: injeção de estoques de parasitas congelados em camundongos doadores
- Descongelar rapidamente os estoques congelados criopreservados e injetar imediatamente cada mouse doador (tipicamente dois camundongos por genótipo) IP com ~ 200 μL de estoque usando uma seringa de agulha de 26 G.
Nota: Não mais do que cinco camundongos são alojados por gaiola dentro de configurações controladas de biotério. - Comece verific o parasitemia um objetivo do microscópio 100x na mancha fina Giemsa-manchada do sangue após 24 h pós-infecção. Siga a seção 2,1 do protocolo para manchas finas manchadas de sangue de Giemsa.
Nota: Devido à incapacidade de contar precisamente os estágios de sangue viáveis sobreviventes após descongelar rapidamente e injetar sangue infectado criopreservado, os camundongos doadores recebem o sangue criopreservado primeiro. Os eritrócitos infectados do rato doador podem ser precisamente quantificados e utilizados subsequentemente.
- Descongelar rapidamente os estoques congelados criopreservados e injetar imediatamente cada mouse doador (tipicamente dois camundongos por genótipo) IP com ~ 200 μL de estoque usando uma seringa de agulha de 26 G.
- Dia 0: sangramento dos ratos doadores
- Sangrar os camundongos doadores (ver secção 3,1) quando a sua parasitemia está entre 0,1% e 1%, que é geralmente obtido 2-3 dias pós-congelado-infecção de estoque no caso de p. de 17x-nl e p. berghei Anka cepas.
- Use a punção da veia facial (para obter entre 200 e 500 μL), ou sangrar terminalmente os animais por punção cardíaca (para obter entre 600 μL e 1,2 mL) de sangue infectado. Sangrar terminalmente os camundongos por punção cardíaca, conforme descrito detalhadamente na seção 3,1.
Nota: O sangramento da veia facial não é um método rotineiro de obtenção de sangue, pois é muito mais difícil de aplicar e é muito angustiante para os camundongos, em comparação com o sangramento terminal. A parasitemia ideal para o sangramento de camundongos doadores é entre 0,1%-1% porque, nesta faixa de parasitemia, há muito poucos gametócitos (que não podem replicar para produzir estágios assexuados) e há menos eritrócitos infectados por duplo ou triplo (que torna a quantificação menos precisa).
- Dia 0: quantificação do sangue infectado para preparar doses de eritrócitos infectados por diluições seriadas
- Prepare diluições seriadas de sangue de doador adicionando 100 μL de sangue a um tubo de microcentrífuga (tubo de diluição 1). Adicione 900 μL de meio RPMI ao tubo 1 e misture bem pipetando para cima e para baixo com a mesma ponta de pipeta, criando uma diluição de 1:10.
- Tomar 100 μL do sangue diluído do tubo 1 e adicioná-lo a um novo tubo de microcentrífuga (tubo de diluição 2). Adicione 900 μL de meio RPMI ao tubo 2 e misture bem introduzindo a pipeta para cima e para baixo com a mesma ponteira de pipetagem, criando uma diluição de 1:100.
- Repita as etapas 1.4.1 e 1.4.2 para fazer mais duas diluições seriais, criando 1:1000 (tubo de diluição 3) e 1:10000 diluições (tubo de diluição 4).
- Adicionar 12 μL de sangue diluído do tubo 3 e 12 μL de sangue diluído do tubo 4 para lados diferentes de um hemocitômetro e determinar o número médio de eritrócitos em cada lado do hemocitômetro. Multiplique esses números por 10. Multiplicar esses números pelo fator de diluição, 1.000 ou 10.000, respectivamente, para determinar o número de eritrócitos em 1 μL de cada diluição.
- Divida o número desejado de eritrócitos infectados a serem injetados pelo número de eritrócitos em 1 μL de cada diluição para determinar o volume de sangue de doador diluído necessário para a injeção. Escolha a diluição com o volume mais adequado para injeção, adicione o volume a um novo tubo de microcentrífuga e complete-o para 120 μL com meio RPMI.
- Dia 0: injeção intravenosa dos camundongos beneficiários
- Coloc os ratos do receptor uma lâmpada vermelha do calor para dilatar suas veias para a injeção. Carregue as doses de parasita numa seringa de insulina de 27 G e coloque o rato receptor numa contenção.
- Injete 1 milhão ou 10.000 eritrócitos infectados por via intravenosa (IV) usando a seringa de insulina de 27 G em cada rato receptor para ensaios de infecção de mosquito ou para ensaios de crescimento assexuados e sexuais de fase sanguínea, respectivamente. Continue a manter os ratos condições de habitação padrão.
Nota: Uma injeção de IP é um método indireto de introdução de parasitas na corrente sanguínea, pois os eritrócitos parasitados têm que passar pelos linfonodos drenantes da cavidade peritoneal para alcançar o sangue. Isso faz com que uma injeção de IP uma rota de entrega indireta para injetar um número preciso de parasitas na corrente sanguínea. Portanto, a via IV é preferida, pois oferece doses precisas de parasitas diretamente na corrente sanguínea, como mostrado na Figura 3 e descrita nos resultados representativos.
2. determinação da carga parasitária de fase sanguínea para estágios sexuais e assexuais
Nota: Nesta seção, os métodos de avaliação fenotípica padronizados de estágios do sangue do parasita da malária são alistados. Estes métodos são úteis na avaliação de novos candidatos a antimaláricos ou vacinais ou mesmo nocaute genético no desenvolvimento de estágios sexuais e assexuada nos mesmos camundongos experimentais. Nota: p. chabaudi e p. vinckei também são opções alternativas muito racionais e importantes para esses tipos de ensaios, especialmente na triagem de fármacos.
- Determinação da parasitemia de estádios assexuados e gametocitos machos vs. fêmeas por esfregaços de sangue fino manchada por Giemsa para ensaios de crescimento de parasitas
- Usando uma agulha de 26 G ou 27 G, pique a cauda do mouse e colete a gota de sangue em uma lâmina de microscópio. Use a borda curta de uma outra corrediça do microscópio para manchar rapidamente o sangue através da corrediça.
- Fixe o slide com 100% de metanol durante pelo menos 1 min, só depois de o sangue secar completamente na lâmina. Mancha em 10% Giemsa para 10-15 min. Lave a corrediça com água simples ou dupla destilada e deixe-a secar.
- Leia o slide usando um objetivo de 100x e imersão em óleo um microscópio de luz. Para uma medição precisa de parasitemia, verifique pelo menos um total de 6.000 eritrócitos, que podem ser obtidos contando pelo menos 30 ou 40 grades microscópicas com um número médio de 200 ou 150 eritrócitos (RBCs) por grade, respectivamente. Conte o número total de RBCs na primeira e última grades para determinar o número médio de glóbulos vermelhos para todas as grades.
- Conte o número total de eritrócitos infectados por grade. Gametócitos masculinos e femininos podem ser contados separadamente para determinar a gametocitemia, mas também devem ser incluídos na contagem total de parasitemia.
- Determine o percentual total de parasitemia dividindo o número total de eritrócitos parasitados pelo número total de RBCs observados. Multiplique esse número por 100 para determinar a porcentagem de parasitemia.
- Determine a gametocitemia dividindo o número total de gametócitos contados pelo número total de RBCs observados. Multiplique esse número por 100 para determinar a porcentagem de gametocitemia por mouse.
Nota: O único método confiável de diferenciação entre diferentes estágios de sangue assexuado e sexual é o uso de um microscópio para avaliar esfregaços de sangue finos manchados por Giemsa, pois cada um dos estágios tem morfologia diferente, com exceção dos gametocytes imaturos, que são na maior parte indistinguíveis dos estágios assexuada do sangue.
- Determinação da parasitemia de fase sanguínea por citometria de fluxo para cepas de parasitas fluorescentes que expressam proteínas do tipo WT
- Rotule dois tubos do microcentrifugador para cada amostra do rato, designando um tubo para uma diluição 1:1000 e o outro para uma diluição 1:2000. Adicionar 1,5 μL de heparina 1x ao tubo de diluição 1:1000.
- Utilizando uma agulha de 26 G ou 27 G, pique a cauda do rato e transfira 1,5 μL de sangue para o tubo contendo 1,5 μL de heparina 1x (o tubo de diluição 1:1000). Misture o sangue e a heparina 1x suavemente em conjunto pipetando para cima e para baixo.
- Adicione 1.497 μL de meio RPMI ao tubo do microcentrifugador, e pipeta delicadamente acima e para baixo para misturar bem.
- Transferir 500 μL da mistura do tubo de diluição 1:1000 para o tubo de diluição 1:2000. Adicione 500 μL de meio RPMI ao tubo 1:2000 e misture suavemente introduzindo pipetagem para cima e para baixo.
- Siga o protocolo de arranque apropriado do fabricante para o citometro de fluxo. Execute as amostras em uma taxa de fluxo lenta e defina a detecção para pelo menos 20.000 eventos.
Nota: Há um ensaio prático alternativo para medir a parasitemia através da triagem de FACS tricolor, se os parasitas expressam marcadores fluorescentes ou não34. Entretanto, o ensaio descrito aqui oferece uma medida exata da parasitemia em parasitas vivos sem a adição de todos os corantes DNA-Binding e o uso da classificação de FACS.
- Determinação da taxa de exflagelação de gametas masculinas por microlitro de sangue de rato infectado
- Prepare um tubo de microcentrífuga de diluição 1:10 com 40 μL de meio ookinete incompleto (RPMI + bicarbonato de sódio + hipoxantina + ácido xanthurênico) e 5 μL de heparina 1x.
- Usando uma agulha de 26 G ou 27 G, pique a cauda do mouse e transfira 5 μL de sangue (usando uma micropipeta) rapidamente para o tubo contendo a mídia ookinete incompleta + heparina. Misture suavemente e carregue 12 μL do tubo de diluição do sangue 1:10 sobre um hemociômetro e deixe-o à temperatura ambiente (20-24 ° c).
- Comece contando os eventos do exflagellation 9-10 minutos após ter preparado a diluição 1:10. Use um microscópio de luz de contraste de fase com ampliação de 40x.
- Multiplicar o número médio de eventos de exflagellation contados por 10 e, em seguida, multiplicar pelo fator de diluição (10) para determinar o número médio de exflagellation por microlitro de sangue infectado.
Nota: Este ensaio mede o número de eventos masculinos do exflagellation do gameta em um volume de 1 μL de sangue, que possa ser quantificado usando um Hemocytometer. Um meio de ookinete incompleto18 é misturado com o sangue para imitar de perto as condições durante as quais exflagellation ocorre dentro do mosquito do midgut logo após uma refeição de sangue.
3. isolamento e processamento de parasitas de sangue-estágio de eritrócitos infectados e preparação de estoque congelado
- Sangramento terminal de roedores infectados por punção cardíaca
- Prepare uma seringa de agulha de 26 G que contenha aproximadamente ≤ 20 μL de heparina 1x (200 unidades/mL) para recolher o sangue do rato doador por punção cardíaca.
- Use um fluxo lento de CO2 para eutanizar o mouse antes de sangrar. Alternativamente, anestesiar o rato com isoflurano (que tem de ser mantido antes e durante a incisão da pele para expor o coração).
- Coloque o mouse em suas costas e fixar seus apêndices. Faça uma pequena incisão na pele perto da base do esterno puxando a pele com fórceps e cortando-a com tesouras. Puxe a pele para além no local da incisão para expor o diafragma e a parte superior da cavidade abdominal.
- Segure a base da caixa torácica com fórceps e corte através do diafragma para entrar na cavidade torácica; tenha cuidado para não danificar o coração ou os pulmões. Fixar de volta a caixa torácica para expor o coração.
- Perfure suavemente o coração e puxe lentamente para cima no êmbolo da seringa para recolher ~ 1 mL de sangue e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga.
- Preparação de estoques congelados de sangue infectado
- Sangrar os ratos (ver secção 3,1) com parasitemias de sangue que estão entre cerca de 2% e 5%, com uma quantidade significativa de fases do anel e não como muitos gametocytes.
- Misture a porção desejada de sangue com solução de congelamento (10% de glicerol na solução de Alsever) em uma proporção de 1:2 e armazene em frascos criogênicos. Congelar em nitrogênio líquido.
- Isolamento e purificação de parasitas de fase sanguínea para a extração de DNA, RNA e proteínas
- Ratos sangrantes (ver secção 3,1) com parasitemias sanguíneas superiores a 0,5%.
- Prepare uma seringa de 10 mL removendo o êmbolo e inserindo um cotonete de algodão pequeno. Embalar o algodão para o fundo da seringa. Encha-o com celulose até que o nível de celulose atinja a marca de 3 mL, mas não exceda a marca de 4 mL na seringa.
- Fixe a seringa num clip num suporte de anel e coloque um tubo de recolha de resíduos abaixo dele. Adicione 5 mL de PBS à seringa e deixe-o fluir no tubo de resíduos.
- Prepare os estoques congelados, se necessário, usando apenas 100-300 μL de sangue. Adicione o resto do sangue infectado (400-700 μL) à coluna. Coletar fluxo através de um tubo de resíduos até que as gotas começam a ficar vermelho. Uma vez que as gotas começam a girar o vermelho, coloc um tubo de coleção novo de 14 mL a seringa para recolher o fluxo completamente.
- Uma vez que o fluxo começa a abrandar, adicionar PBS para a seringa e recolher o fluxo através do tubo de 15 mL até que um volume total de 14 mL foi atingido. Recolher o fluxo restante através de um tubo de resíduos.
- Centrifugue o tubo de 14 mL com mistura de sangue/PBS durante 8 min a 250 x g sem travões. Retire o sobrenadante e adicione 14 mL de saponina refrigerada (50 mg de saponina em 50 mL de PBS). Para desalojar o pellet, inverta o tubo várias vezes e vórtice, se necessário.
- Centrifugue o tubo durante 8 min a 1.217 x g sem travões. Retire o sobrenadante, deixando cerca de 0,5 mL da solução acima do pellet.
- Suspender o pellet na solução usando uma micropipeta e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 500 μL de PBS ao tubo de 14 mL para lavar quaisquer parasitas residuais deixados no tubo. Adicione isto ao mesmo tubo do microcentrifugador.
- Centrifugar o tubo durante 2 min a 6.010 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem 1 mL de PBS. Centrifugador por 2 min a 9.391 x g.
- Prossiga para extrair DNA genômico, RNA total e proteína.
- Para a extração do ADN de Genomic, remova o sobrenadante e resuma a pelota em 200 ΜL de PBS, e siga então todo o protocolo apropriado da extração de gDNA.
- Para a extração total de RNA, retire o sobrenadante, ressuscitem e vórtice a pelota em 1 ml de qualquer solução à base de isotiocianato de fenol e guanidina ou qualquer outro reagente adequado e, em seguida, siga qualquer protocolo adequado de extração total de RNA.
- Para a extração total de proteínas, retire o sobrenadante, ressuscitem o pellet em um volume apropriado de 6x sódio Dodecil sulfato (SDS)-carga corante ou qualquer outro reagente adequado e, em seguida, siga qualquer protocolo adequado de processamento de proteínas totais.
4. ensaios de infecção do mosquito
Nota: O mosquito é o principal hospedeiro dos parasitas da malária onde a reprodução sexual ocorre. A infecção de camundongos para transmitir parasitas da malária para os mosquitos é conduzida por uma injeção intravenosa de pelo menos 1 milhão estágios sanguíneos, seguido pela alimentação de um rato infectado (de cada genótipo que exibe a maior taxa de exflagellation masculino gameta) para Anopheles mosquitos em uma gaiola no dia 3 post-mouse-infecção. A injeção IV com 1 milhão parasitas de fase sanguínea em camundongos tratados com fenilhidrazina garantirá o desenvolvimento de Gametócito masculino e feminino em uma taxa mais rápida e mais alta. Os mosquitos infectados com p. de e p. berghei são incubados a 24 ° c e 20-21 ° c, respectivamente, para permitir o melhor desenvolvimento possível de estádios de mosquito6.
- Alimentação do mosquito e determinação do número de ookinetes por mosquito
- A fêmea adulta de fome Anopheles Wikipédia ou A. mosquitos de gambiae (4-7 dias velhos) para 8-12 h antes da alimentação. Permitir que os mosquitos adultos se alimentem por pelo menos 15 min nos camundongos anestesiados infectados (injetado com uma dose apropriada de cetamina/xilazina) com a maior taxa de exflagelação (medida na seção 2,3).
Nota: Solução de trabalho de cetamina/xilazina é preparada pela diluição 1:5 da solução de ações em soro fisiológico e IP injetando 100 μL por mouse. Para uma solução de 10 mL, 1 mL de xilazina (100 mg/mL) é adicionado a 9 mL de cetamina (100 mg/mL). - Remova os mosquitos fêmeas jejum e os mosquitos masculinos com um aspirador da boca.
- Em 18-20 h pós-alimentação, coletar 20-30 mosquitos e colocá-los no freezer para não menos de 10 min para garantir a morte. Usando um espaço de dissecção binocular, dissecar 20-30 midguts sangue-enchido com 2 26 G ou 27 G agulhas ou uma agulha e um fórceps no meio da dissecção de RPMI ou de PBS e transferir o midguts a um tubo do microcentrifugador que contem 200 μL de RPMI ou de PBS (para o método da dissecção consulte a secção 4,3).
- Centrifugar o tubo de recolha durante 1 min a 700 x g. Moer o midguts peletizada usando um pilão. Repita este passo.
- Transferir 50 μL do tubo de midguts à terra para um novo tubo de microcentrífuga. Adicionar 200 μL de RPMI ou PBS para criar uma diluição 1:5.
- Transfira 12 μL para um hemociômetro e incubar-o à temperatura ambiente durante 5 min para permitir que o conteúdo se estabeleça.
- Determine o número médio de ookinetes usando um microscópio de luz com um contraste de fase e ampliação de 40x.
- Multiplicar o número médio de ookinetes maduros por 10 e, em seguida, pelo fator de diluição de 5 para determinar o número total médio de ookinetes.
- Divida o número médio de ookinetes pelo número de mosquitos alimentados por sangue dissecados para determinar o número de ookinetes por mosquito alimentado por sangue.
- A fêmea adulta de fome Anopheles Wikipédia ou A. mosquitos de gambiae (4-7 dias velhos) para 8-12 h antes da alimentação. Permitir que os mosquitos adultos se alimentem por pelo menos 15 min nos camundongos anestesiados infectados (injetado com uma dose apropriada de cetamina/xilazina) com a maior taxa de exflagelação (medida na seção 2,3).
- Determinação do número de oocistos precoces para a proteína de repórter fluorescente que expressa tensões do parasita WT-like
Nota: O objetivo deste ensaio é determinar o número de parasitas vivos que expressam a proteína verde fluorescente (GFP) que estabeleceu uma infecção completa do midguts do mosquito e formou oocistos esféricos precoces. Este ensaio determina se os ookinetes (seu desenvolvimento estimado no ensaio anterior) completaram suas funções pelo Traversal através das células epiteliais do do midgut do mosquito e a transformação aos ooocysts adiantados no lado da lâmina basal do do midgut epitélios ou não. Este é um outro ensaio que faz grande uso dos parasitas expressando GFP, como a contagem de oocistos precoces nesta fase será quase impossível sem imunofluorescência tediosa.- Dissecar a midguts (ver secção 4,1) de 20-30 mosquitos alimentados com sangue, no dia 3 ou 4 pós-mosquito-alimentação (PMF) para p. de 17x-NL, e no dia 6 ou 7 PMF para p. berghei Anka, com 2 26 g ou 27 g agulhas ou uma agulha e pinça em RPMI ou PBS dissecção m edium (para o método de dissecção, consulte a secção 4,3).
- Espalhe 40-50 μL de meio de dissecção na linha média horizontal da aresta mais longa da lâmina de vidro. Transfira o midguts a esta linha, um de cada vez, durante a dissecção, e adicione mais meio ao midguts, se necessário, para evitar secar para fora.
- Coloc um lamela delicadamente no midguts dissecado, e sele-o com lustrador de prego.
- Usando o objetivo de 10x ou 20x do microscópio de fluorescência com o filtro verde da fluorescência, conte o número de ooocysts adiantados em cada midgut, pelo menos em 20 midguts.
- Determinação do número de esporozoites oocistos por mosquito
- Dissecar o midguts de pelo menos 20-30 mosquitos com agulhas 2 26-G ou 27-G ou uma agulha e fórceps no meio da dissecção de RPMI ou de PBS e para recolher o midguts dissecados em 200 μL de RPMI.
- Segure os segmentos do abdômen inferior firmemente no lugar com uma agulha (ou fórceps) e empurre levemente o tórax em uma direção ascendente com a outra agulha na junção entre o tórax e o abdômen. Faça com cuidado curto empurra até que o tórax separa do abdômen. Assim que a separação começa o do midgut branco aparecerá esticado, e então o do midgut será cortado da extremidade do esôfago usando a mesma agulha que foi usada para separar o tórax. Se ainda anexado ao abdômen, a mesma agulha pode ser usada para puxar o do midgut longe do abdômen. Transfira o midguts de todos os mosquitos ao tubo da coleção recolhendo os do meio com uma agulha, um de cada vez.
- Centrifugue o tubo da coleção por 1 minuto em 700x g para liquidar o midguts à parte inferior do tubo da coleção e moer-los com um pilão. Repita este passo.
- Transfira 12 μL para um hemociômetro e incubar-o à temperatura ambiente durante 5 min para permitir que o seu conteúdo se estabeleça.
- Conte os esporozoites oocistos usando um objetivo de 40X de um microscópio de luz. Use 1:5 e/ou 1:10 diluições se os restos do mosquito impedem a contagem exata dos esporozoítos ou se o número de esporozoítos é demasiado elevado para contar exatamente.
- Calcule o número médio total de esporozoítos do oocisto multiplicando o número médio de esporozoítos por 10 e, em seguida, multiplicando esse número pelo fator de diluição, se houver, e pelo volume total (200 μL).
- Divida o número médio total de esporozoites pelo número de mosquitos dissecados para calcular o número médio de esporozoítos oocistos por mosquito.
Nota: Um erro comum para medir o sucesso ou a produtividade da infecção dos estágios do mosquito é a contagem do número de ooocysts em umas fases mais atrasadas do desenvolvimento do ooocyst. Isto é devido a alguns oocistos que estão sendo vacuolated em uns pontos mais atrasados do tempo do desenvolvimento do ooocyst, e outro não conseguem desenvolver sporozoites, mesmo no mesmo midgut. O melhor e mais confiável método para determinar a produtividade da infecção dos estágios do mosquito é a contagem do número médio de esporozoítos do oocisto do intestino médio nos dias 10-12 pós-infecção do mosquito para P. de e nos dias 12-14 infecção pós-mosquito para P. berghei.
- Determinação do número de esporozoites da glândula salivar por mosquito
Nota:A avaliação final da conclusão completa do desenvolvimento dos estágios do mosquito é realizada através da estimativa do número de esporozoítos que invadiram a glândula salivar, que são os estágios transmissíveis e infecciosos para os vertebrados. A invasão da glândula salivar é estabelecida após a conclusão do desenvolvimento do esporozoítos do de oocistos, saída na hemolymph, acessório ao lamina básico das pilhas acininar da glândula salivar, e o Traversal das pilhas acináceas para alcangar as glândulas salivares Dutos5. Portanto, este ensaio é também uma avaliação do sucesso de todos esses processos ou não. No entanto, uma estimativa dos números de esporozoítas da hemolinfa permitiria a diferenciação entre defeitos na saída de oocistos e defeitos na invasão de glândulas salivares35. A purificação de esporozoítos da glândula salivar permite a realização de múltiplos ensaios funcionais sobre motilidade esporozoita e fenótipos de invasão. Os esporozoítos da glândula salivar também podem ser usados para a infecção in vivo de camundongos e em estudos de imunização36,37. Além disso, os estágios os mais reprodutíveis disponíveis para estabelecer uma invasão in vitro do estágio do fígado ou um ensaio do desenvolvimento são pelo uso de sporozoites da glândula salivar.- Dissecar as glândulas salivares de 50-100 mosquitos fêmeas, nos dias 14-16 PMF para p. de e nos dias 17-20 PMF para p. berghei, preferencialmente com agulhas de 2 26 g ou 27 g, em meio RPMI ou DMEM mantidos no gelo e suplementados com 5% de soro fetal bovino (FBS) ou/albumina sérica bovina (BSA) para esporozoítos de p. de ou 3% FBS/BSA para esporozoítos de p. berghei . Se os esporozoítos devem ser usados em ensaios in vitro de hepatoma, adicione 1% de penicilina/estreptomicina ao meio de dissecção. Há geralmente dois métodos para a dissecção das glândulas salivares. O primeiro método é demorado, mas leva à dissecção de glândulas salivares com muito pouco ou nenhum tecido contaminante. O segundo método é menos demorado mas conduz à coleção de uma quantidade significativa de contaminar tecidos. O primeiro método é detalhado aqui.
- Segure os segmentos do abdômen superior no lugar com o lado chanfrado de uma agulha e empurre cuidadosamente a cabeça muito levemente (em empurrões muito curtos) na junção entre a cabeça e o tórax em uma direção ascendente até que a cabeça seja cuidadosamente separada do tórax sem rasgando as glândulas salivares glassy, as glândulas salivares expostas são separadas então da cabeça com a mesma agulha que empurrou a cabeça para cima.
- A glândula salivar dissecada será levantada a partir do meio de dissecção usando uma pipeta Pasteur de vidro curto.
- Quando todas as glândulas salivares foram dissecadas e colhidas, o talento colocará o tubo contendo os midguts na centrífuga (1min, 700 x g).
- Contagem de esporozoites usando um hemocitômetro um microscópio de luz definido para fase 2 contraste e 40x ampliação. Se o número de mosquitos dissecados ≥ 40, diluir as glândulas salivares para 1:5 ou 1:10, dependendo do rendimento de infecciosidade esperado (determinado em ensaios anteriores).
- Multiplicar o número médio de esporozoites por 10 e o fator de diluição (se houver). Multiplicar pelo volume total para determinar o número médio de sporozoites da glândula salivar. Divida pelo número de mosquitos fêmeas dissecados para determinar os esporozoítos médios da glândula salivar por o mosquito.
Nota: O problema com a dissecção das glândulas salivares é seu tamanho pequeno e aparência transparente Glassy. Assim, é muito difícil isolar as glândulas salivares e, portanto, eles são geralmente dissecados como um montante fixo com outros tecidos da parte frontal do tórax, o que também é importante para proteger as glândulas salivares da ruptura durante a coleta.
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Representative Results
O sucesso da aplicação de ferramentas e técnicas genéticas reversas para parasitas da malária revolucionou o campo da pesquisa em malária, com a capacidade de adicionar, excluir ou modificar segmentos genóricos específicos de várias espécies de Plasmodium 39. Importante, os loci genomic dispensável foram identificados e usados com sucesso introduzir marcadores da proteína da fluorescência em parasita do roedor e da malária humana pela recombinação homous dobro, para assegurar uma expressão estável em todos os estágios do ciclo de vida40 ,41,42. Um exemplo destes parasitas transgênicos WT-like é Py230p (-) parasitas, que foram gerados em nosso laboratório, e não mostraram nenhum defeito aparente no desenvolvimento de estágios do ciclo de vida do sangue e do mosquito15,16, 17. estes parasitas transgênicos do repórter expressaram o EGFP, o controle do promotor forte e constitutivo de PyHSP70, em estágios sanguíneos (Figura 1a) ookinetes (Figura 1b), oocistos jovens (Figura 1C ) em Anopheles Wikipédia midguts, e em esporozoítos isolados das glândulas salivares de fêmeas de Anopheles Wikipédia (Figura 1D). Assim, os parasitas do sangue expressando o eGFP tornaram muito mais fácil e menos demorado avaliar a parasitemia do estágio sanguíneo usando a citometria de fluxo entre diferentes genótipos de parasitas transgênicos ou entre medicamentos tratados e-não tratados em drogas-alvo ensaios com parasitas de repórter transgênicos.
Para confirmar que não há diferença quantitativa entre o uso de citometria de fluxo e a estimativa mais tediosa de parasitemia por microscopia, o eGFP-expressando Pyp230p (-) foi utilizado para estimar o percentual de eritrócitos parasitados por citometria do fluxo e por Giemsa-mancha fina manchada do sangue em um grupo de ratos suíços de Webster IV-Infected com os 10.000 erythrocytes parastized. Os valores da citometria de fluxo parasitemia% corresponderam diretamente à estimativa de parasitemia% pelo monitoramento de esfregaços de sangue finos manchados por Giemsa, que foram estimados por dois cientistas especialistas (Figura 2). Isto representa uma alternativa mais exata ao método tedioso e propenso-a-humano-erro da microscopia na determinação da taxa de crescimento de parasitas do sangue-estágio.
Uma discrepância importante associada à infecção de roedores com os estágios sanguíneos de parasitas da malária é a escolha da via de infecção, com uma forte preferência na literatura para o IP em comparação com a via de infecção IV, pois é menos demorado. A fim de comparar estas duas vias de infecção, dois grupos de cinco camundongos BALB/c foram infectados com 1.000 eGFP-expressando Pyp230p (-) eritrócitos parasitados por camundongo, seja através de vias IV ou IP. A parasitemia foi monitorada diariamente por meio de citometria de fluxo por um período de 4 dias. Observou-se diminuição estatisticamente significante do grupo infectado por IP parasitemia% em relação ao grupo com infecção por IV em todos os dias testados (Figura 3). Isto fornece a evidência que a rota da infecção do IV é uma rota mais quantitativamente exata da infecção para ensaios com os estágios do sangue do parasita da malária.
No entanto, uma limitação ao uso da citometria de fluxo para avaliar a parasitemia no estágio sangüíneo é a diferenciação entre os estágios sexual e assexuada e entre os gametocitos masculino e feminino. Portanto, a estimativa das porcentagens de cada um dos diferentes estágios assexuados e sexuais (Figura 4) tem que depender de uma avaliação morfológica do esfregaço de sangue fino manchado por Giemsa. Apesar da aparente morfologia diferente de gametócitos machos e fêmeas maduros (Figura 4), estágios sexuais imaturos são muitas vezes indistinguíveis de estágios assexuadas.
Uma função essencial dos gametas masculinos em cima da emergência do Gametócito masculino no do midgut do mosquito é o exflagellation masculino do gameta, que é uma etapa muito crítica na transmissão que deve acontecer dentro de um período de tempo muito curto. Métodos variáveis usados para avaliar isso em muitos sistemas diferentes foram descritos. Aqui, mostramos um método padronizado que pode ser repetido em qualquer configuração de laboratório simples. Foi avaliada a exflagelação do gameta masculino com ou sem injeção de fenilhidrazina em camundongos beneficiários (Figura 5). Pudemos demonstrar que o tratamento com fenilhidrazina significantemente (quatro vezes) aumentou a taxa de exflagelação do gameta masculino, o que, por sua vez, aumentará a taxa de fertilização e o número de todos os estágios subsequentes do mosquito.
Figura 1 : O desenvolvimento de P. de p230p (-) parasitas expressando constitutivamente o EGFP em estágios sanguíneos e mosquitos. (A) imagem de parasitas mistos de fase sanguínea (1, 000x ampliação). (B) imagem de ookinete (ampliação 400x). (C) imagem de um Anopheles Wikipédia mosquito do midgut infectado com dia 4 PMF oocistos precoces de p230p vivos (-) parasitas expressando EGFP (100x ampliação). (D) este painel mostra uma imagem ao vivo de um P. de p230p (-) sporozoite da glândula salivar, dissecado no dia 15 PMF, expressando EGFP (ampliação 400x). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Avaliações de citometria de fluxo e microscopia de parasitemia média de fase sanguínea de P. de p230p (-) os parasitas não são significativamente diferentes. Um grupo de quatro camundongos Swiss Webster foi infectado por via intravenosa com 10.000 eritrócitos parasitados de Pyp230p (-) por camundongo e a média de parasitemias de estágio sangüíneo% foram registradas diariamente por 7 dias por citometria de fluxo e pela avaliação microscópica de Esfregaços de sangue finos manchados de Giemsa de um total de 20.000 e de ~ 6.000 erythrocytes, respectivamente. Os resultados da examinação microscópica são mostrados a média de duas leituras por dois cientistas peritos por a corrediça, e o tempo para avaliar o parasitemia de cada corrediça era pelo menos 10 minutos por cada cientista. Nenhuma diferença significativa pode ser detectada em qualquer um dos dias mostrados aqui. Os valores médios para todas as cepas parasitária foram analisados com o teste tde duas caudas. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Uma injecção intravenosa de P. de p230p (-) parasitas produz parasitemia de fase sanguínea significativamente diferente de uma injeção intraperitoneal. Dois grupos de cinco camundongos BALB/c foram infectados com 1.000 eritrócitos parasitados de Pyp230p (-) por camundongo, seja através da via endovenosa ou intraperitoneal, e a média de parasitemias de estágio sangüíneo% foram registradas diariamente por 4 dias por fluxo citometria de um total de 20.000 eritrócitos. Uma redução estatisticamente significativa (denotada por um asterisco) de parasitemia no estádio sanguíneo pode ser detectada para todos os dias testados no grupo de rotas intraperitoneal em comparação com o grupo de vias intravenosas. Os valores médios para todas as cepas parasitária foram analisados com o teste tde duas caudas. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Morfologia da Gametócitos de P. de em um esfregaço de sangue fino manchado por Giemsa. Uma imagem de um esfregaço de sangue fino manchado por Giemsa (1, 000x ampliação) de um rato suíço Webster infectado com WT P. de 17x-nl estirpe mostra o típico azulado feminino colorido Gametócito no lado esquerdo (denotado por uma flecha) e o macho rosado de cor ( denotado por um asterisco) Gametócito no lado direito da imagem. As outras etapas mostradas são estágios assexuados do sangue. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : O efeito do Fenilidrazina no exflagellation masculino do gameta. O efeito da fenilhidrazina injetada em camundongos destinatários 5 dias antes da estimativa da taxa de exflagelação de gameta masculina de P. de. Phenylhydrazine aumenta significativamente a taxa de exflagellation masculino do gameta, que conduz a uma infecção mais elevada dos estágios do mosquito borne-alimentação do mosquito. Os valores médios para todas as cepas parasitária foram analisados com o teste tde duas caudas. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apesar da semelhança na Biologia geral de seus ciclos de vida com a de parasitas da malária humana, os modelos de malária por camundongo também têm muitas dessemelhanças com as espécies humanas de Plasmodium que limitariam seu uso como modelos confiáveis in vivo . Por exemplo, com exceção de parasitas vivos-atenuados como vacinas, todos os estudos vacinais com subunidade e DNA e outras vacinas deram excelentes resultados no modelo do camundongo, mas em seres humanos que viviam em áreas endêmicas, os resultados estavam longe de serem satisfatórios.
Um outro problema é a diferença da infectividade do estágio do ciclo de vida de uma tensão do rato a outra, e às vezes de um vendedor animal a outro para a mesma tensão do rato. Além disso, as duas principais espécies de malária de roedores que são amplamente utilizadas como modelos preferidos de malária in vivo , p. berghei e p. de, não exibem um ciclo síncrono de estágio sanguíneo, que é completamente diferente de qualquer malária humana Parasita. No entanto, os benefícios do uso de parasitas da malária do mouse como modelos in vivo superam de longe essas dissimilaridades, que também podem ser superadas por análises mais aprofundadas das unidades moleculares dessas limitações. No entanto, essas limitações são exibidas principalmente pelos parasitas da malária em fase de sangue de roedores, mas não tanto para os outros estágios do ciclo de vida do parasita da malária.
Embora os estágios do sangue sejam importantes para a vária vacina, alvejando da droga, imunologia, e estudos genomic funcionais, há uma escassez de métodos e de protocolos estandardizados que se concentram na análise fenotípica e nos ensaios funcionais que envolvem parasitas da malária por roedores, com maior foco nos protocolos de transmissão e transfecção de mosquitos. Portanto, os métodos neste artigo ajudarão a fornecer protocolos padronizados e simplificados para estudar os estágios patogênicos dos parasitas da malária por roedores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Ahmed Aly é apoiado pelo financiamento à Universidade de Bezmialem Vakif do Ministério turco do desenvolvimento Grant 2015BSV036, e pelo financiamento fornecido pela escola da Universidade de Tulane da saúde pública e da medicina tropical, e pelo financiamento de NIH-NIAID para R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
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