Eine Methode, um Insektenzellen vorzubereiten und infizieren sie mit Baculovirus für die Zwecke der Produktion von rekombinanten mCD1d proteinand Erzeugung mCD1d Tetramere.
Abstract
CD1-Proteine bilden eine dritte Klasse von Antigen-präsentierenden Molekülen. Sie sind Zelloberfläche Glykoproteine, wie etwa 50-kDa glykosylierten schweren Ketten, die kovalent mit beta2-Mikroglobulin assoziiert sind Ausdruck. Sie binden Lipide als Peptide. Obwohl die Struktur bestätigt die Ähnlichkeit der CD1-Proteine auf MHC Klasse I und Klasse II Antigen-präsentierenden Molekülen ist die mCD1d Nut relativ schmal, tief und stark hydrophob und hat zwei Bindungstaschen statt der mehrere flache Taschen für die klassische beschriebenen MHC- kodierte Antigen-präsentierenden Molekülen. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, bietet eine solche hydrobphobic Nut ein ideales Umfeld für die Bindung von Lipid-Antigene.
Die Natural Killer T (NKT-Zellen) nutzen ihre TCR an Glykolipide gebunden oder presented by CD1d erkennen. Reaktive T-Zellen, Lipide zu CD1 präsentiert haben in den Schutz gegen Autoimmun-und Infektionskrankheiten sowie in Tumorabstoßung beteiligt. So ist die Fähigkeit zu erkennen, zu reinigen, und verfolgen Sie die Reaktion der CD1-reaktiven NKT Zellen von großer Bedeutung. Die Erzeugung von Tetrameren von alpha Galactosylceramid (a-GalCer) mit CD1d hat einen tiefen Einblick in die Biologie von NKT-Zellen. Tetramere aus anderen CD1-Moleküle konstruiert wurden ebenfalls erzeugt und diese neue Reagenzien haben stark das Wissen um die Funktionen von Lipid-reaktiven T-Zellen erweitert, mit potenziellen Einsatz bei der Überwachung der Reaktion auf Lipid-basierte Impfstoffe und in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und andere Behandlungen.
Protocol
I. auftauen Cells Nehmen Sie das Gefriergut Fläschchen TN5-Zellen und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Fügen Sie 5ml von Insekten Express-Medium (Invitrogen, Katalog-Nummer-10486) in 25cm 2 TC Kolben. Beachten Sie, dass Express fünf, ohne Glutamin kommt; müssen 10ml 100X Glutamin Stift Strep oder Glutamin allein zu 1 lt Medien hinzufügen. Add TN5 Zellen hinein und inkubieren für 30 Minuten in ein 27 ° C Inkubator. Dann saugen das Medium mit DMSO vorsichtig, ohne die Zellen…
Discussion
In diesem Verfahren wird gezeigt, wie zu initiieren, zu wachsen, zu infizieren Insektenzellen und wie die Baculovirus Verwendung dieser Zellen Titer. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind Wartung von Zellen und die genaue Titer von Baculovirus wissen. Sobald Sie CD1 Tetramere erzeugt wird, kann sie als ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Glycolipid reaktiven T-Zellen verwendet werden. Baculovirus-Systeme sind ebenfalls weit verbreitet, rekombinante Proteine, darunter MHC-Klasse-II-Tetramere so dieses Verfahren hat eine viel bre…