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Bioengineering

एक Microwell Array प्लेटफॉर्म के भीतर विधानसभा और माइक्रोबियल सामुदायिक विकास का ट्रैकिंग

Published: June 6, 2017 doi: 10.3791/55701
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

Summary

माइक्रोबियल समुदाय का विकास कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है, जिनमें पर्यावरणीय वास्तुकला, सदस्य बहुतायत, लक्षण, और बातचीत शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में सिंथेटिक, माइक्रोफैब्रिकेटेड माहौल का वर्णन है, जिसमें फेट्टोलिटर कुओं में निहित हजारों समुदायों के साथ-साथ ट्रैकिंग शामिल हैं, जहां प्रमुख कारक जैसे कि आला आकार और कैद को अनुमानित किया जा सकता है।

Abstract

माइक्रोबियल समुदाय का विकास जटिल नियतात्मक और स्टोचस्टिक कारकों के संयोजन पर निर्भर करता है जो नाटकीय रूप से स्थानिक वितरण और समुदाय के सदस्यों की गतिविधियों को बदल सकते हैं। हमने एक माइक्रोवेल्ल सरणी प्लेटफार्म विकसित किया है जो समानांतर में हजारों बैक्टीरियल समुदायों को तेजी से इकट्ठा और ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल मंच की उपयोगिता को हाइलाइट करता है और मंच के भीतर सरणियों के एक टुकड़े के भीतर सरल, दो-सदस्यीय समुदायों के विकास की ऑप्टिकली निगरानी के लिए इसके उपयोग का वर्णन करता है। यह प्रदर्शन स्यूडोमोनस एरुजिनोसा के दो म्यूटेंट का उपयोग करता है, जो एक प्रकार की म्यूटेंट का हिस्सा है, जो कि टाइप वीस स्राक्रेशन पैथोजेनिकता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। एमकेरी या जीएफपी जीन के क्रोमोसोमल सम्मिलन फ्लोरोसेंट प्रोटीनों की अलग-अलग अभिव्यक्ति की सुविधा प्रदान करते हैं, जिनके साथ अलग-अलग उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य होते हैं जिनका उपयोग समुदाय के सदस्य की बहुतायत और प्रत्येक माइक्रोवेवेल में स्थान की निगरानी के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक विस्तृत मेथो का वर्णन करता हैसमय के साथ-साथ प्रत्येक सदस्य आबादी के सापेक्ष विकास को मापने के लिए समय-विलंब प्रतिदीप्ति इमेजिंग और मात्रात्मक छवि विश्लेषण का उपयोग करके बैरक्टीरिया के मिश्रण को सरणी के कुएं में एकत्रित करने के लिए और घ। Microwell प्लेटफार्म के बीजिंग और विधानसभा, सरणी के भीतर माइक्रोबियल समुदायों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक इमेजिंग प्रक्रियाएं, और उन तरीकों का उपयोग किया जा सकता है जो सूक्ष्मजीव प्रजातियों के क्षेत्र में बातचीत के बारे में सभी चर्चा करते हैं।

Introduction

माइक्रोबियल समुदायों का निर्धारण दोनों नियतात्मक कारकों से होता है, जैसे पर्यावरण की संरचना, और स्टेचैस्टिक प्रक्रियाएं, जो कोशिका मृत्यु, विभाजन, प्रोटीन एकाग्रता, ऑर्गेनेल की संख्या और उत्परिवर्तन 1 के साथ जुड़ी हुई हैं। प्राकृतिक वातावरण के भीतर, समुदाय संरचना और गतिविधि पर इन प्रभावों के व्यक्तिगत प्रभाव को पार्स करना लगभग असंभव हो सकता है। प्राकृतिक संरचनाओं द्वारा अदृश्य और रासायनिक और जैविक परिवेश में दफन किया गया, समुदाय के सदस्यों की पहचान करने और प्राकृतिक वातावरण के भीतर अपने आंतकमीय वितरण को हल करने के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है। फिर भी, हाल के प्रयासों ने सामुदायिक कार्यों पर स्थानिक संगठन के महत्व को रेखांकित किया है और वर्तमान में 2 , 3 , 4 के अध्ययन में सदस्य बहुतायत और संगठन दोनों के लिए खाते की आवश्यकता की ओर इंगित किया है।

यहयह स्पष्ट है कि स्थानीय रासायनिक पर्यावरण ( यानी पोषक तत्वों और माध्यमिक चयापचयों की उपलब्धता), भौतिक संरचना ( जैसे, मिट्टी वास्तुकला, पौधे की जड़ें, सागर कणों, या आंतों में माइक्रोवेलीली), ऑक्सीजन की मौजूदगी या अनुपस्थिति, और इसकी शुरूआत रोगजनक प्रजातियां, माइक्रोबियल समुदाय 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 के संयोजन, वास्तुकला और कार्य को प्रभावित करती हैं। फिर भी, संस्कृतियों के लिए परंपरागत तकनीकें जो इन कारकों पर कब्जा करने की उपेक्षा करते रहें हैं। सामुदायिक संरचना ( उदाहरण के लिए, सह-निर्भर प्रजातियों की उपस्थिति), शारीरिक लगाव, संकेत अणु एकाग्रता, और प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क एक माइक्रोबियल समुदाय को आकार देने के लिए सभी महत्वपूर्ण कारक हैं और सी में खो जा सकता हैअनौपचारिक संस्कृति की स्थिति इन गुणों को थोक तरल संस्कृति में या एक एगर प्लेट पर दोहराना मुश्किल है। प्राकृतिक वातावरणों की मुख्य भौतिक और रासायनिक सुविधाओं की प्रतिकृति के लिए अनुमति देने वाले माइक्रोफ़्लुइडिक, माइक्रोप्रेट्रिंग और नैनोफैब्रिकेशन तकनीकों की उपलब्धता हालांकि, कई शोधकर्ताओं ने बैक्टीरियल समुदायों को उनके 12 , 13 , 14 इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सिंथेटिक वातावरण विकसित करने के लिए सक्षम बनाया है प्राकृतिक परिस्थितियों की नकल 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 , 20

यह प्रोटोकॉल एक माइक्रोवेल्ल सरणी डिवाइस को तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं को प्रदान करता है जो कि फ़ंक्शन चालू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसरणी में ई कुओं और जीवाणु बढ़ने के लिए, दोनों एकल-प्रजाति के उपनिवेशों और बहु-सदस्यीय समुदायों में। यह काम यह भी दर्शाता है कि समय समय पर कुओं के भीतर बैक्टीरिया की वृद्धि को मॉनिटर करने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए बैक्टीरिया को संशोधित किया जा सकता है। एक समान सरणी को पहले प्रस्तुत किया गया था और दिखाया गया कि सूक्षोवालों में स्यूडोमोनस एरुगिनोसा ( पी। एरुजिनोसा) की एकल-प्रजाति के उपनिवेशों के विकास को ट्रैक करना संभव है। अच्छी तरह से आकार और सीडिंग घनत्व को संशोधित करके, हजारों विकास प्रयोगों की शुरुआती स्थितियों को समानांतर में अलग किया जा सकता है ताकि निर्धारित किया जा सके कि शुरुआती टीकाकरण की स्थिति 21 जीवाणुओं के बढ़ने की क्षमता को कैसे प्रभावित करती है। वर्तमान कार्य में माइक्रोवेल्ल सरणी का एक थोड़ा संशोधित संस्करण उपयोग होता है जो पिछले अरसे से कई सरणियों की तुलना करके और अधिक मजबूत प्रायोगिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके सक्षम बनाता है। इस कार्य में उपयोग किए गए सरणी में एकाधिक सबरायर्स, या सरणी प्रतीत होता हैBles, विभिन्न आकार के कुओं युक्त, 15 से 100 मीट्रिक व्यास तक, जो कि तीन अलग पिचों ( यानी 2x, 3x और 4x बराबर व्यास) पर व्यवस्थित होता है। Arrays सिलिकॉन में etched हैं, और सिलिकॉन सरणियों में वरीयता वाले जीवाणुओं की वृद्धि एक माध्यमिक-युक्त agarose जेल के साथ लेपित किया गया है जो एक coverslip के साथ arrays सील द्वारा सक्षम किया गया है। पी। एरगिनोसा म्यूटेंट, जो कि टाइप VI स्राव प्रणाली का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इस प्रदर्शन में उपयोग किया जाता है।

यहां प्रस्तुत परिणाम माइक्रोवेल्ल सरणियों के भीतर बहुसंख्यक समुदायों के विश्लेषण के अंतिम लक्ष्य की ओर बढ़ते हैं, जिससे शोधकर्ताओं ने रासायनिक पर्यावरण के नियंत्रण और जांच के दौरान बहुतायत और जीवाणुओं के संगठन की निगरानी कर सकी। अंत में "नियम" में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए जो कि सामुदायिक विकास और उत्तराधिकार को नियंत्रित करता है।

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Protocol

1. सिलिकॉन माइक्रोवेल्ल-सरणी निर्माण

  1. पर्लिन कोटिंग
    1. निर्माता के विनिर्देशों और निर्देशों (सेटिंग्स: vaporizer सेट बिंदु = 160 डिग्री सेल्सियस; भट्टी सेट प्वाइंट = 650 डिग्री सेल्सियस) के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पर्लिन कोटिंग सिस्टम का उपयोग करके सिलिकॉन वेफर्स पर 1-1.5 माइक्रोन के पेरीलेन एन पर जमा करें।
      नोट: पारालीन एन के लगभग 6 ग्राम एक चैम्बर पैदावार कोटिंग्स 1-1.5 माइक्रोन मोटी में लोड किया गया।
  2. photolithography
    1. 45 एस के लिए 3,000 आरपीएम पर आसंजन प्रमोटर, 20% हेक्सामेथिल्डिसेलाज़ेन (एचएमडीएस) और 80% प्रोपलीन ग्लाइकॉल मोनोमेथाइल ईथर एसीटेट (पीजीएमईए) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पिरलाइन एन-लेपित वेफर्स स्पिन कोट। आसंजन प्रमोटर के साथ 2 एमएल ट्रांसफर विंदुक भरें और इसे पूरे वफ़र पर छिड़क दें। वफ़र को सूखा लगाने से पहले लगभग 10 एस तक बैठने की अनुमति दें।
    2. सकारात्मक-से 2 एमएल ट्रांसफर विंदुक भरेंNe फोटो्रेसिस्ट (सामग्री की सारणी देखें) और वेफर के बीच में फोटोसिसिस्ट का वितरण करें। 45 एस के लिए 3,000 आरपीएम पर स्पिन को कोटिंग का प्रतिरोध करने के लिए स्पिन जो लगभग 1.5 माइक्रोन मोटी है।
    3. 1 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्ले पर नमूनों को नरम सेंकना
    4. नमूनों को पराबैंगनी प्रकाश में उजागर करने के लिए वांछित अच्छी तरह से एक संपर्क एल्ग्नर और फोटोमास्क का उपयोग करें। छद्म फोटोमास्क के माध्यम से 6 एस के लिए स्पिन-लेपित वफ़र का खुलासा करें, 365 एनएम पर मापा गया 60-80 एमजे / सेंटीमीटर की लगभग खुराक दे।
    5. 2 मिनट के लिए डेवलपर (<3% टेट्रामिथिल अमोनियम हाइड्रॉक्साइड पानी में, सामग्री की तालिका देखें) में नमूना को डुबकी करके पैटर्न विकसित करना डि पानी के साथ कुल्ला और साफ, शुष्क नाइट्रोजन के साथ सूखी।
      नोट: विकास के दौरान यूवी के संपर्क में आने वाले फोटो्रेसिस्ट के क्षेत्र को साफ किया जाना चाहिए।
  3. रिएक्टिव आयन नक़्क़ाशी
    1. उजागर पैरीलेन को हटाने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करेंसिलिकॉन सब्सट्रेट के लिए सभी तरह
      नोट: नुस्खा को पारालेन की नक़ल दर बदलने के लिए संग्राहक किया जा सकता है। 1 और 5 सुक्ष्ममापी के बीच पेरीलेन मोटाई के लिए, रिएक्टिव आयन एच्चिंग (आरआईई) उपकरण पर 60 मीटर टन, 20 डिग्री सेल्सियस, 100 एससीएम ओ 2 , 10 डब्ल्यू आरएफ, और 2,000 डब्ल्यू आईसीपी के साथ एक नुस्खा का उपयोग करें। उजागर पैरीलेन परत को छीलने और हटाने के बाद, नमूनों वाले क्षेत्र ( यानी उजागर सिलिकॉन) चमकदार और चांदी दिखना चाहिए
    2. सिलिकॉन में खोदने के लिए एक गहरी RIE (DRIE; जैसे, बॉश ड्रा) का उपयोग करें
      नोट: खोदना दर और अवधि अच्छी गहराई का निर्धारण करेगा। बॉश प्रक्रिया का एक पूर्ण चक्र (3 एस जमाण चरण: 20 मीटर, 15 डिग्री सेल्सियस, 140 एससीएम सी 4 एफ 8 , 10 डब्ल्यू आरएफ, और 1,750 डब्ल्यू आईसीपी 10 एस एख़्रिक प्रक्रिया के बाद: 20 मीटर टन, 15 डिग्री सेल्सियस , 120 एससीएम एसएफ़ 6 , 8 डब्ल्यू आरएफ, और 1,750 डब्ल्यू आईसीपी) लगभग 1 माइक्रोन का खोदना गहराई से मेल खाती है। इस प्रदर्शन सीमा में 3 - 3.5 माइक्रोन गहराई से इस्तेमाल किए गए कुओं।
    3. वीभौतिक प्रोफिलोमेट्री के द्वारा खोदने की गहराई को मिटाना
      1. नमूना को भौतिक प्रोफाइलमीटर में लोड करें (सामग्री की तालिका देखें)।
      2. नमूना वैक्यूम चालू करें और मैन्युअल लोड बटन दबाएं।
      3. "फ़ोकस" बटन दबाकर सिस्टम पर नमूना पर ध्यान केंद्रित करें दृश्य स्क्रीन पर माप के लिए एक उपयुक्त सुविधा की स्थिति।
      4. नमूना स्कैन करें प्रोफ़ाइल का स्तर और फीचर गहराई को मापें।
      5. नक़्क़ाशी की दर को रिकॉर्ड करें और वांछित गहराई को प्राप्त करने के लिए बाद के नलिकाओं को विनियमित करें।
        नोट: माप में सिलिकॉन की गहराई अच्छी तरह से शामिल है, जमा किए जाने वाले पिरलाइन की मोटाई, और फोटो्रेसिस्ट की मोटाई शामिल होगी। प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक परत की मोटाई की जांच करना सही अच्छी गहराई हासिल करना आवश्यक है।

2. जीवाणु संस्कृति और सीडिंग ( चित्रा 1 ए )

  1. लुरीया ब्रोथ (एलबी) अगर प्लेट ग्लिसरॉल से प्लेटों और दो हफ्तों के भीतर उपयोग करें। एलबी अगर प्लेटों से वांछित उपभेदों की कालोनियों को चुनें और पी। एरुजिनोसा की रातोंरात संस्कृतियां शुरू करें। लगभग 18 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए रातोंरात संस्कृतियों को सेते हैं जबकि आर 2 ए मध्यम में 220 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    नोट: उत्परिवर्तन और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को बनाए रखा गया है यह सुनिश्चित करने के लिए कॉलोनियों को चढ़ाना के दो सप्ताह के भीतर चुना जाना चाहिए। सभी पी। एरुजिनोसा का काम बीएसएल -2 शर्तों के तहत किया जाना चाहिए।
  2. एक हीरे के लेखकों को सिलिकॉन वेफर से अलग-अलग आकार और पिच-अच्छी सरणियों के टुकड़ों वाले व्यक्तिगत चिप्स में उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चिप में अध्ययन के लिए पूर्ण आकार और पिचों का पूरा पूरक होता है।

आकृति 1
चित्रा 1: निर्माण और सेल सीडिंग प्रक्रिया ( ए ) माइक्रोएल्ल arrays aफिर से पारीलेन की एक पतली परत के साथ लेपित सिलिकॉन वेफर्स में खोला हुआ (i) कुओं को गीला करने और / या सतह को कार्यात्मक बनाने के लिए, एक प्रोटीन समाधान एरे के शीर्ष पर एक छोटी बूंद में जोड़ा जाता है (ii)। प्रोटीन समाधान निकाल दिया जाता है, वेफर्स सूख जाते हैं, और वांछित बैक्टीरिया युक्त एक नया समाधान जोड़ा जाता है (iii)। ऊष्मायन अवधि के बाद बैक्टीरिया के समाधान को हटा दिया जाता है, और वेफर्स को सूखने की अनुमति दी जाती है, कुओं में बैक्टीरिया और सतह पर छोड़कर (iv)। सतह से जुड़े बैक्टीरिया को पारालीन लिफ्ट-ऑफ से हटा दिया जाता है, माइक्रोवेल्स में साफ तौर पर जीवाणुओं को छोड़कर और 2% ग्लिसरॉल माध्यम के कारण अभी भी व्यवहार्य होता है, जो कि कुओं को हाइड्रेटेड (v) रखने में मदद करता है। सिलिकॉन चिप्स को एक agarose जेल लेपित कांच के कवर एलिप पर सरणी-तरफ रखा जाता है, जो माइक्रोवेल्ल्स (vi) में जीवाणु वृद्धि को भर देता है। ( बी ) एक एकल सिलिकॉन डिवाइस पर उप-एरे का लेआउट प्रत्येक उप-सरणी में समान कुओं का एक समूह होता है। सभी सब-ए में माइक्रोवेल्स का व्यासरेंज 5-100 माइक्रोन से व्यास में रेंज और 2x, 3x, या 4x अच्छी व्यास पिच पर व्यवस्थित होते हैं, जो नीचे पैनल योजनाबद्ध पर सफ़ेद से काले-भूरे रंग के रूप में चिह्नित हैं। जब अच्छी गहराई उथले (<10 माइक्रोन) होती है, तो 5 और 10 सुक्ष्ममापी अच्छी व्यास शायद ही उपयोगी होते हैं, आमतौर पर इस छोटे से कुओं को वसा रखने वाले कोशिकाओं की कमी के कारण। इस काम में, केवल 15-100 माइक्रोन व्यास वाले कुओं का डेटा का विश्लेषण किया गया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

नोट: जैसा चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, एक पूर्ण चिप में कुओं की उप-सरणियां होती हैं, जिसमें 5 से 100 माइक्रोन तक के व्यास के साथ, तीन अलग पिचों ( यानी 2x, 3x और 4x व्यास) 4 बार दोहराते हैं।

  1. पीबीएस समाधान में 500 μg / mL बोवाइन सीरम अल्बुमिन (बीएसए) की 150 μL छोटी बूंद रखेंमाइक्रोवेल्स को गीला करने के लिए सरणी के शीर्ष पर एक नम कक्ष में आरटी पर चिप पर 1 घंटे के लिए बीएसए समाधान सेते हैं।
    1. फॉस्फेट-बफर्ड सलाईन (पीबीएस) के साथ एक खाली विंदुक टिप बॉक्स के नीचे भरकर कक्ष बनाएं।
      नोट: विशिष्ट पदार्थों जैसे कि अन्य पदार्थ, माइक्रोवेल्स की सतह को कार्यात्मक बनाने के लिए बीएसए के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. बीएसए समाधान के साथ सिलिकॉन चिप्स लगाने से, 5 मिनट के लिए 2,500 आरपीएम (950 xg की औसत से जुड़ी) पर संस्कृतियों को अपकेंद्रित करें और फिर उन्हें 2% ग्लिसरॉल के साथ 500 μL ताजा आर 2 ए माध्यम में फिर से खोलें।
    1. 600 एनएम पर यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके संस्कृति के ओडी को निर्धारित करें। इसे 2% ग्लिसरॉल आर 2 ए माध्यम से 0.02 के एक ओडी में समायोजित करें।
      नोट: ग्लिसरॉल पेरीलेन लिफ्ट-ऑफ के दौरान सूखने से कुओं को रोकने में मदद करता है।
  3. ऊष्मायन के बाद, बीएसए समाधान को निकालें और पीबीएस के साथ तरल ड्रॉप्स को हटाने और हटाने के साथ 3x कुल्लासिलिकॉन माइक्रोवेल्ल सरणी को कवर करने वाला नाइट्रोजन के तहत सूखी
  4. आर्मी चैंबर में रखी प्रत्येक सूखे सरणियों के लिए 0.02 ओडी संस्कृतियों के 150 μL जोड़ें। 1 घ पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते, जिससे बैक्टीरिया अच्छी तरह से दीवारों का पालन कर सकें।
    नोट: ऊष्मायन के लिए प्रशीतन की आवश्यकता नहीं है इमेजिंग शुरू होने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस के ऊष्मायन समय का उपयोग बैक्टीरिया के विकास को रोकने के लिए किया जा सकता है जिससे कि एक विकास के पहले समुदायों के स्थानिक संगठन को कल्पना कर सके। कमरे के तापमान के ऊष्मायन का भी इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों प्रोटोकॉल का परिणाम समान वृद्धि घटता है।

3. माइक्रोस्कोप सेट-अप

  1. सिलिकॉन चिप्स पर जीवाणु ऊष्मायन शुरू करने से पहले चरण-शीर्ष पर्यावरण नियंत्रण कक्ष को चालू करें (सामग्री की तालिका देखें) और नियंत्रण बॉक्स पर सेटिंग्स समायोजित करें ताकि आर्द्रता (~ 100%) और तापमान (30-32 डिग्री सेल्सियस, कदम 3.2 देखें) नमूने जोड़ने से पहले संतुलित कर सकते हैं।
  2. नमूना धारक का स्तर और लाइन मेंपीबीएस-लथपथ प्रयोगशाला पोंछे (सामग्री की सारणी देखें) के नमूने के चारों ओर टेरियर के लिए चैम्बर में नमी बिंदु को बढ़ाएं । इमेजिंग प्लेन पर कंडेनसेशन को कम करने के लिए चैम्बर का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस और चेंबर ढक्कन के 32 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    नोट: स्लाइड धारक एक गैसकेट के साथ लाइव-सेल कक्ष में फिट बैठता है जो लगभग 1 सेमी मोटी है। नमूना धारक एक बबल स्तर की सहायता से लगाया जाता है जो नमूना धारक के ऊपर रखा गया है। नमूना धारक थोड़ा झुका जा सकता है और गैसकेट में स्तर पर बंद रह सकता है।
  3. जबकि संस्कृतियों सिलिकॉन चिप्स पर incubating हैं, मैन्युअली इमेजिंग से कम से कम 30 मिनट पूर्व पारा दीपक के लिए बिजली स्विच चालू करें। मैन्युअल रूप से कैमरा और स्वचालित माइक्रोस्कोप मंच को चालू करें। माइक्रोस्कोप और परिधीय उपकरणों को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर को खोलें और सुनिश्चित करें कि उपकरण सॉफ़्टवेयर द्वारा पहचाने गए हैं।
    नोट: एनए = 0.3 के साथ मैग्निफिकेशन 10 एक्स है।
  1. माइक्रोवेव पहले तैयार एगरोज़ समाधान ( यानी 2% एजेरोज़ आर 2 ए मध्यम) जब तक एक तरल राज्य तक नहीं पहुंच जाता, लगभग 60 एस।
  2. 2 x 3 "(50 x 75 मिमी) ग्लास स्लाइड पर 75 मिमी x 22 मिमी, # 1.5 कांच के आवरण के पीछे गीला और इसे लंबे समय तक, केन्द्रित, कांच की स्लाइड में रखें। दो PDMS spacers रखें (~ 1 मिमी की मोटाई) कंसलिप के लंबे किनारों के साथ और ग्लास कंसलिप को स्थानांतरित करें ताकि करीब 1 मिमी कंसलिप स्लाइड के किनारे पर बढ़ रहे हों।
  3. ग्लास कंसलिप के शीर्ष पर 5 एमएल का तरल एगरोज़ समाधान डालें, यह पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त है, और सैंडविच के लिए एक दूसरे 2 x 3 "ग्लास स्लाइड को सैंडविच पर रखें" और कवरलिप और स्लाइड के बीच द्रव एगर।
    नोट: यह एजोज़ की गहराई को नियंत्रित करता है, जिससे कंडोलिप की कुल मोटाई और पीडीएमएस स्पार्स के मोटाई के बराबर कठोर एगरोज़ बनती है।
  4. Agarose समाधान जमना शुरू होने तक सेट करने के लिए कांच स्लाइड-कवरलिप-एगरोज़ जेल-ग्लास स्लाइड सैंडविच की अनुमति दें; फिर, इसे एक रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित करें 15 मिनट के बाद, अतिरिक्त ठोस एगरोज़ को हटा दें और कांच के कंधों पर काट लें। इसे एक साफ डिश में ले जाएं और जब तक उपयोग न करें तब तक रेफ्रिजरेटर में रखें।

5. एगरोज़ लेपित कवर्सलिप और इमेजिंग के साथ वेल्स को सील करना

  1. बैक्टीरिया ऊष्मायन अवधि पूर्ण होने के बाद, रेग्रिजरेटर से agarose-coated coverslip को हटा दें और निम्नानुसार सिलिकॉन चिप्स तैयार करें।
    1. एक समय में, 10 सेकंड प्रत्येक के लिए, ultrapure पानी में सिलिकॉन चिप्स डुबकी। उन्हें एक प्रयोगशाला के पोंछ या ऊतक पर अपने किनारों पर सेट करें जब तक अधिकतर तरल पदार्थों के किनारे से किनारों से सूखा न जाए।
    2. प्रत्येक सिलिकॉन चिप की किनारे की लंबाई से मिलान करने के लिए टेप का एक टुकड़ा कट। पैरीलेन पर टेप रखें जो सिलिकॉन को कवर कर रहा है और इसे पिरैलिन कोटिंग को तुरंत छीलने के लिए उपयोग करें।
    3. immedप्रत्येक छिलका चिप को बदलकर प्रत्येक चिप को जगह दें जैसे कि माइक्रोवेल्ल-सरणी वाला पक्ष agarose-coated coverslip के agarose-coated पक्ष के सामने (और संपर्क करता है) का सामना करता है। कुओं के बाहर जीवाणुओं के विकास को रोकने के लिए एगरोज़ को छूने के बाद चिप को हिलाने या चिपकाने के लिए ध्यान न दें।
  2. मिस्क्रॉस्कोप पर स्टेज-टॉप पर्यावरणीय नियंत्रण कक्ष के स्लाइड धारक में इकट्ठे हुए माइक्रोवेल्ल सरणी / एगरोज़ कवर एलिप को रखें।
    1. रुचि के सरणियों का पता लगाने के लिए परिवेश प्रकाश या निर्देशित प्रकाश ( जैसे, एक टॉर्चलाइट) का उपयोग करें उन स्थितियों को बचाने के लिए स्वचालित मंच को नियंत्रित करने वाले व्यावसायिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (सामग्रियों की तालिका देखें) स्थिति संग्रहीत के बाद परिवेश या निर्देशित प्रकाश को बंद करें।
    2. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में, "एनडी अधिग्रहण" पैनल खोलें।
      नोट: इस पैनल में एक विशिष्ट निर्देशिका के लिए स्वत: सहेजने के लिए एक मेनू, साथ ही साथ प्रोग्राम इमेज अधिग्रहण भी शामिल है। इन प्रयोगों के लिए, "टाइम," "एक्सवाई," और "λ" मेन्यू का उपयोग किया जाता है।
    3. सॉफ़्टवेयर में स्थानों को बचाने के लिए, "XY मेनू" पर क्लिक करें और फिर प्रत्येक स्थिति के लिए बाईं ओर एक रिक्त बॉक्स को चेक करें, जिसे सहेजना होगा। साथ ही, "शामिल करें" बटन पर क्लिक करें।
  3. वांछित तरंग दैर्ध्यों पर समय के साथ छवियों को प्राप्त करें और उपयुक्त प्रतिदीप्ति फिल्टर क्यूब्स (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 10 बढ़ाई करें।
    1. प्रत्येक सहेजे गए स्थान पर जाने के लिए और कुओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नियंत्रण सॉफ़्टवेयर और सहेजे गए सरणी पदों का उपयोग करें। सहेजी गई सूची में प्रत्येक XY स्थान पर क्लिक करें और ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) फिल्टर का उपयोग करके फ़ोकस समायोजित करें। Z- स्थान पर इंगित करने वाले तीर पर क्लिक करके नई z- स्थिति सहेजें।
      नोट: यह प्रक्रिया समय लेने वाली हो सकती है Photobleaching को रोकने के लिए हल्की तीव्रता को कम करने के लिए लाभ बढ़ाने और तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करने के बारे में सावधानी बरतें।
    2. सरली की सतह पर ध्यान केंद्रित करते समय z- अक्ष स्थिति में अंतर को ध्यान में रखते हुए प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए फोकल विमानों के बीच z- अक्ष की दूरी निर्धारित करें। मिश्रित लाल / हरे रंग की बैक्टीरिया आबादी के साथ सरणी से 2-3 स्थानों का चयन करें और लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) फिल्टर का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित करें।
      1. जीएफपी और आरएफपी प्रतिदीप्ति फिल्टर का उपयोग करते हुए फोकल विमानों के बीच की दूरी को घटाएं और "λ" मेनू के तहत फोकल प्लेन समायोजन जोड़ें
        नोट: उदाहरण के लिए, यदि सरणी GFP चैनल में 50 माइक्रोन के z- स्थान पर ध्यान केंद्रित करती है, और समान सरणी आरएफपी चैनल में 55 माइक्रोन पर केंद्रित होती है, तो आरएफपी ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन के बगल में +5 जोड़ें "λ " मेन्यू।
    3. समय चूक छवि अधिग्रहण शुरू करें
      नोट: यहां दिखाए गए प्रयोगों के लिए, आरएफपी और जीएफ़पी छवियों को प्रत्येक सरणी स्थिति के लिए 30 मिनट के अंतराल पर बहु-आयाम छवि अधिग्रहण का उपयोग करके एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के माध्यम से अधिग्रहण किया गया था जो नियंत्रित करता हैकैमरा, शटर, फिल्टर पहिया, और मोटर चालित मंच।
      1. "अंतराल" को 30 मिनट और "समय" मेनू के तहत 24 घंटे के लिए "प्रयोग की अवधि" निर्धारित करें। "अभी चलाएं" पर क्लिक करें।
        नोट: "टाइम," "एक्सवाई," और "λ" बॉक्स चेक किए गए के साथ, प्रोग्राम चल रहा है, प्रत्येक स्थान ( उदाहरण के लिए सहेजे गए XYZ स्थानों) को चरण में स्थानांतरित करेगा, एक तरंग दैर्ध्य में एक छवि लें, z- स्थिति को स्थानांतरित करें फोकल प्लेन अंतर ( यानी, लैम्ब्डा या तरंग दैर्ध्य नियंत्रण) के लिए खाते में, दूसरी छवि लेते हैं, अगले सरणी स्थान (बहुवर्त) पर चले जाते हैं, और इसे 30 मिनट के अंतराल पर (समय चूक) लूप करते हैं।
  4. रोशनी नियंत्रण छवियों को प्राप्त करें
    नोट: 4 स्थानों, 25x प्रत्येक की छवियों को लेने के लिए "एनडी अधिग्रहण," "समय", और "एक्सवाई" मेनू का उपयोग करें
    1. सभी प्रकाश स्रोतों को बंद करने और ले जाने के द्वारा 100 "अंधेरेफील्ड" चित्रों की श्रृंखला लेंएक मानक स्लाइड के "छवि" ये छवियां कैमरा शोर को कैप्चर करेगा टाइमलास्ट (चरण 5.3.3) के दौरान इस्तेमाल किए गए सबसे लंबे समय तक एक्सपोज़र टाइम का उपयोग करें।
    2. दिए गए प्रायोगिक परिस्थितियों में असमान रोशनी को कैप्चर करने के लिए कुछ अलग स्थानों पर एक मानक स्लाइड ( अर्थात वर्दी आरएफपी या जीएफपी तीव्रता) को इमेजिंग करके 100 "रोशनी फ़ील्ड" चित्रों की श्रृंखला लें। एक एक्सपोजर का समय चुनें जो संतृप्ति तक पहुंचने के बिना संकेत को अधिकतम करता है।

6. विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए छवि स्टैक्स पर प्रक्रिया करें ( उदाहरण के लिए, ImageJ)।
    1. अधिग्रहीत चित्रों को वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके झगड़ा फ़ाइल प्रारूप में कनवर्ट करें। "फाइल"> "आयात"> "छवि अनुक्रम" पर क्लिक करके छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में चित्र अपलोड करें।
    2. सभी "अंधेरेफ़ील्ड" और "रोशनी क्षेत्र" छवियों के औसत से "सुधार छवि" बनाएं Subtrac"प्रक्रिया"> "छवि कैलकुलेटर" चुनकर औसत "रोशनी क्षेत्र" छवि से औसत "अंधेरेफ़ील्ड" छवि। दो चित्र "छवि 1" और "छवि 2" चुनें और फिर "ऑपरेशन" फ़ील्ड में "घटाना" चुनें। ओके पर क्लिक करें।"
      1. औसत के लिए, सुधार (या अंधेरे क्षेत्र) छवियों को लोड करें, "छवि"> "ढेर"> "Z प्रोजेक्ट"> "औसत प्रक्षेपण" पर क्लिक करें।
    3. यदि आवश्यक हो तो छवि पंजीकरण करें फिर, "प्रक्रिया"> "पृष्ठभूमि घटाएं" पर क्लिक करके पृष्ठभूमि घटाएं। "त्रिज्या" फ़ील्ड में त्रिज्या ( जैसे, 125) दर्ज करें और "स्लाइडिंग पैराबोलाइड" चुनें।
    4. "प्रक्रिया"> "कैलकुलेटर प्लस" का उपयोग करके रोशनी सुधार करें। निम्नलिखित पैरामीटर चुनें: ऑपरेशन, डिवाइड; I1, अच्छी छवि; I2, सुधार छवि; K1, सुधार छवि का अर्थ; और के 2, 0. क्लिक करें "Creनई खिड़की खा लिया। "
      नोट: इस डेटा सेट को पंजीकरण की आवश्यकता नहीं थी, लेकिन दूसरे काम में, ImageJ प्लगइन स्टैकरैग "अनुवाद" रूपांतरण के साथ उपयोग किया गया था पृष्ठभूमि घटाव के लिए, प्रत्येक छवि सेट के लिए एक ही स्लाइडिंग पैराबोलाइड त्रिज्या का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि सबसे बड़ा कुएं इमेज किए गए हैं तो 100 का पिक्सेल त्रिज्या है, तो हर छवि सेट के लिए 100 से अधिक त्रिज्या ( जैसे, 125) का उपयोग करें।
  2. माइक्रोवेल्स में प्रत्येक तनाव का विकास निर्धारित करें।
    1. ImageJ "MicroArray" प्लगइन का उपयोग करके वांछित सरणियों में प्रत्येक माइक्रोवेल्ल के आसपास ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें
      1. "मैप" मेनू में, "रीसेट ग्रिड" पर क्लिक करें। पंक्तियां, स्तंभ और व्यास निर्दिष्ट करें (सरणी पर अच्छी तरह से आकार और संख्या के आधार पर, चित्रा 1 बी देखें)। "ROI आकार" मेनू से "सर्कल" चुनें
      2. टी को स्थानांतरित करने के लिए माउस के साथ शीर्ष-बाएं आरओआई चुनते समय "Alt" कुंजी दबाइएवह ROI सरणी सरणी के आकार को बदलने के लिए नीचे-बायां ROI का चयन करते समय "शिफ्ट" कुंजी को दबाए रखें। सरणी के दाहिनी ओर से आरओआई चुनते समय "शिफ्ट" कुंजी दबाए रखें, लेकिन कोनों पर नहीं, ROIs की रिक्ति बदलने के लिए
      3. एक छवि में कुओं पर ROI सरणी फिट करने के लिए ऊपर दिए गए आदेशों का उपयोग करें "उपाय आरटी" पर क्लिक करें।
        नोट: प्लगइन प्रत्येक आरओआई से अपेक्षित माप निर्यात करेगा तीन आरओआई आकारों का प्रयोग करें, कुएं के चारों ओर घूमने वाले रिंग को स्थानीय पृष्ठभूमि संकेत ( यानी बाहरी रिंग से विभाजित बीच की अंगूठी से सिग्नल) और प्रतिदीप्ति माप ( यानी, आंतरिक रिंग से संकेत) एकत्रित करने के लिए उपयोग करें।
    2. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में डेटा लीजिए और पृष्ठभूमि संकेत की गणना करें। इसे आगे के विश्लेषण के लिए कस्टम स्क्रिप्टिंग सॉफ़्टवेयर में आयात करें।
  3. डेटा संगठन और विश्लेषण
    1. डेटा आयात करें और डेटा व्यवस्थित करेंImageJ में प्रत्येक समय के लिए निम्न क्रम में मैट्रिक्स में एकत्र किया गया: स्तंभ 1, उप-सरणी संख्या; स्तंभ 2, अच्छी तरह से पंक्ति; स्तंभ 3, अच्छी तरह से स्तंभ; स्तंभ 4, मतलब तीव्रता; स्तंभ 5, पृष्ठभूमि तीव्रता; और स्तंभ 6, तीव्रता का मतलब - पृष्ठभूमि की तीव्रता।
      1. विभिन्न मैट्रिक्स में एमकेरी और जीएफपी अधिग्रहण के परिणामों को अलग करें। सेल एरे में एक अलग सेल में प्रत्येक उप-सरणी और प्रत्येक रंग से परिणाम स्टोर करें।
        नोट: यह संगठन छवि डेटा और माप परिणामों के बीच आगे और पीछे स्थानांतरित करने के लिए आसान बनाता है, डेटा को साफ करना और यह सुनिश्चित करता है कि माप सही रूप से डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    2. पी। एरुगिनोसा के ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए समायोजित करें
      नोट: जीएफपी और एमचेरी उपभेदों के सह-संस्कृति से जुड़े प्रयोगों में, एमकेरी और ग्रीन ऑटोफ्लोरेसेंस के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए एक एमकेरी-केवल चिप का विश्लेषण किया जाना चाहिए।
      1. सभी एमकेरी से एमकेरी-बनाम-जीएफपी सिग्नल को प्लॉट करें ITRES &एमसीरी सिग्नल और जीएफपी चैनल में ऑटोफ्लोरेसेंस के बीच के रिश्ते को निर्धारित करने के लिए सभी समय-बिंदुओं पर # 916; टीएसई / आई 1-6 कुएं। सह संस्कृतियों से autofluorescence संकेत घटाएं।
    3. ट्रैस्जिटरीओं को प्लॉट करें और संशोधित रसद समीकरण को प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में फिट करें, जो कि स्प्रैडशीट सॉफ़्टवेयर या कस्टम स्क्रिप्टिंग सॉफ़्टवेयर में कम से कम वर्गों का उपयोग करके पैरामीटर निकालने के लिए।
    4. जीएफपी और एमकेरी प्रक्षेपवक्र पैरामीटर के बीच और बीच में सहसंबंध की तलाश करें।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक मंच बैक्टीरिया समुदायों के उच्च-थ्रुपुट और उच्च-सामग्री अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह डिजाइन हजारों समुदायों को सक्षम बनाता है, विभिन्न आकार के कुओं में बढ़ रहा है, साथ ही इसका विश्लेषण किया जा सकता है। इस microwell सरणी डिजाइन के साथ, प्रारंभिक बोने घनत्व, अच्छी तरह से आकार, और रासायनिक पर्यावरण पर अंतिम समुदाय संरचना की निर्भरता निर्धारित किया जा सकता है। यह काम माइक्रोवेल्ल सरणी में एक दो सदस्यीय समुदाय के विकास को दर्शाता है और सामुदायिक संरचना और संगठन का विश्लेषण करने के तरीकों को आगे बढ़ाता है।

यहां इस्तेमाल की जाने वाली मॉडल प्रणाली को पी। एरिनगिनोसा में टाइप वीस स्राक्रशन के अध्ययन के लिए म्यूज लैब में बनाया गया था। प्रणाली कई उत्परिवर्ती उपभेदों से बना है, जिसमें जीएफपी या एमकेरी फ्लोरोसेंट संवाददाता हैं। इस काम में 2 अलग-अलग उपभेदों का इस्तेमाल किया गया था। सबसे पहले एक जीएफपी-लेबल किया गया है जो उत्परिवर्तनीय हैवाई प्रकार VI स्राव से जुड़े विषाक्त प्रभावकारी प्रोटीन को व्यक्त करता है, जिसके परिणामस्वरूप संवेदी कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु के उच्च स्तर होते हैं। दूसरा एक आरएफपी-लेबल वाला ΔretStse / i1-6 तनाव है जो एक विलोपन उत्परिवर्ती है जो सभी छह ज्ञात प्रमोटर प्रोटीन लापता है और यह टाइप VI रोगजननता 22 , 23 , 24 टाइप करने के लिए अतिसंवेदनशील साबित हुआ है। प्रत्येक प्रजातियों के विकास की गति को व्यक्तिगत रूप से और दो सदस्यीय समुदायों के भीतर ट्रैक किया गया था ( अर्थात सरणी मंच में सह संस्कृति)।

ΔretS और ΔretStse / i1-6 म्यूटेंट को तीन सरणियों पर विभाजित किया गया, प्रत्येक अलग से और एक 1: 2 अनुपात में एक साथ मिश्रित किया गया, और फिर 20 घंटे के लिए हर 30 मिनट का चित्रित किया गया। कुओं में जीवाणु वृद्धि 6 और 12 एच पोस्टसिंग के बीच समाप्त हो गई। फ्लोरोसेंट इमेज डेटा के उदाहरण आंकड़े 2 और 3 में दिखाए गए हैं। चित्रा 2 चित्रा 2 में 45 सुक्ष्ममापी व्यास के कुएं में ΔretS और ΔretSttse / i1-6 उपभेदों के समय के विकास को दर्शाता है, और चित्रा 3 विभिन्न आकारों के कुओं में इन दो सदस्यीय समुदायों के बारे में 6 घंटे पोस्टसिंग (एचपीएस) के बारे में पता चलता है।

चित्र 2
चित्रा 2: टाइम-कोर्स सह-संस्कृति विकास प्रयोग से नमूना चित्र। एम। फेरी ( ΔretStsts / i1-6) (लाल) या जीएफ़पी (ΔretS) (हरा) को व्यक्त करते हुए , पी। एरुजिनोसा के दो म्यूटेंट, को 2: 1 एमकेरी में एक साथ सीडित किया जाता है: माइक्रोएवर एरे में जीएफपी अनुपात। यहाँ चित्रित समग्र छवियों को 3 अलग-अलग समय पर 45 माइक्रोन व्यास कुओं में पोस्ट किया जाता है। कृपया एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का

चित्र तीन
चित्रा 3: माइक्रोवेल्स अर्रे डिवाइस में शामिल वेल एक्सट्रैक्स की रेंज। दो सदस्यीय समुदायों की प्रतिनिधि छवियों में वृद्धि के 8 घंटे पर कब्जा कर लिया गया। आम तौर पर, एमकेरी (ΔretStsts / i1-6) (लाल) या जीएफ़पी (ΔretS) (हरा) कालोनियों में छोटे colocalization दिखा, microwells में अलग क्षेत्रों के भीतर शेष। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

मापन के अधिग्रहण से पहले, एक स्लाइडिंग पैराबाइलॉइड पृष्ठभूमि घटाव किया गया था। एक रोशनी सुधार चरण नियोजित किया गया था ताकि किसी दिए गए प्रयोग में इमेज किए गए प्रत्येक माइक्रोवेल्ल से संकेत मात्रात्मक रूप से तुलना की जा सकें। ये विधियां पी हैंजाहिर 25 वर्णित है ImageJ में माइक्रोएरे प्लगइन का उपयोग करना, लाल और हरे रंग के बैक्टीरिया की औसत तीव्रता को स्थानीय पृष्ठभूमि संकेत के साथ, सही चित्रों में मापा गया था। स्थानीय पृष्ठभूमि संकेत को अच्छी तरह से संकेत से घटाया गया था, और पी। एरीगुइनोसा सह- संस्कृतियों के autofluorescence के लिए जीएफपी सिग्नल को सही करने के लिए समायोजित किया गया था (एम-फेरी ΔretStse / i1-6-केवल एरे से निर्धारित आफ़्लोरेसेंस) । एक बार इन सभी सुधारों को पूरा करने के बाद, mCherry- और GFP- व्यक्त बैक्टीरिया की मात्रात्मक वृद्धि trajectories को प्लॉट किया जा सकता है। उदाहरण 20 और 50 सुक्ष्ममापी व्यास के कुओं का विकास चित्रा 4 में दिखाया गया है।

चित्रा 4
चित्रा 4: पी। एरुगिनोसा प्रकार VI सिक्रेशन म्यूटेंट के मोनो- और सह- संस्कृतियों के विकास घटता।( ए और डी ) जीएफपी-ΔretS मोनोकल्चर विकास क्रमशः 20-माइक्रोन और 50-सुक्ष्ममापी कुओं में घटता है। ( बी और ई ) मैकेरी-ΔretStse / i1-6 मोनोकल्चर विकास क्रमशः 20 और 50 सुक्ष्ममापी कुओं में घटता है। (सी और एफ) जीएफपी (हरा) और एमकेरी (लाल) पी। एरगिनोसा उपभेदों के 1: 2 अनुपात मिश्रण की सह संस्कृति। जब छवि अधिग्रहण शुरू हुआ, तब से विकास घटता बना दिया जाता है, लगभग 2 घंटे पोस्टसिंग (एचपीएस)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

पी। एरगिनोसा उपभेदों के मोनो- और सह-संस्कृति से विकास की गति से संकेत मिलता है कि अच्छी तरह से अच्छी तरह से विकास में कुछ परिवर्तनशीलता है और यह परिवर्तन छोटे आयामों के कुएं में बढ़े हैं। हालांकि, मतलब तीव्रता काफी अच्छी तरह से सी प्रभावित नहीं हैZe। अतिसंवेदनशील तनाव (ΔretSttse / i1-6) के विकास पर एक नाटकीय या स्पष्ट नकारात्मक प्रभाव नहीं दिखाई देता है, जब ΔretS तनाव मौजूद है। प्रत्येक तनाव के लिए समग्र तीव्रता में कमी आई है, लेकिन यह कुओं में प्रत्येक तनाव के कम प्रारंभिक एकाग्रता के कारण था, क्योंकि कुल ओडी प्रयोगों में लगातार रखा गया था, न कि प्रत्येक तनाव के व्यक्ति ओडी। हालांकि, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि इन कुओं में जीवाणुओं के विकास को समझने के लिए कौन से कारक सबसे अधिक महत्वपूर्ण हैं, जो कि अकेले वृद्धि के केवल विक्षोभों को देखते हुए। इसलिए, प्रत्येक प्रक्षेपवक्र एक संशोधित रसद फ़ंक्शन 26 ( चित्रा 5 ए ) के साथ फिट था ताकि प्रासंगिक पैरामीटर निकाला जा सके और जीवाणु वृद्धि डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सके। प्रारंभिक संकेत द्वारा विभाजित संकेत के प्राकृतिक लॉग लेकर प्रत्येक प्रक्षेपवक्र को बदल दिया गया था। अधिकतम संशोधित (ए) से संबंधित तीन मापदंडों के साथ एक संशोधित रसद फ़ंक्शन, एक अधिकतमदर (μ), और एक अंतराल समय (τ), प्रत्येक प्रक्षेपवक्र में फिट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

GFP-ΔretS और mCherry-ΔretStsts / i1-6 उपभेदों के बीच ज्ञात बातचीत को देखते हुए, कोई यह अनुमान लगा सकता है कि एमकेरी तनाव का विकास सह-संस्कृतियों में GFP-ΔretS तनाव 22 , 24 के साथ बाधित होगा। निकाले गए मापदंडों का उपयोग करना, जीएफपी और एमकेरी प्रक्षेपिकी से निकाले जाने वाले पैरामीटर के बीच सकारात्मक या नकारात्मक संबंधों को देखने के लिए संभव है। प्रारंभिक पैरामीटर विश्लेषण ने सुझाव दिया कि इन प्रजातियों की सह संस्कृति उनके समग्र विकास पर एक नगण्य प्रभाव पड़ा। विकास घटता में देखा जाने वाला परिवर्तन पर्यावरणीय कारकों की वजह से हो सकता है, जैसे प्रारंभिक बीजों की घनत्व, जो कि छोटी अच्छी व्यास ( चित्रा 5 बी) में अधिक चर हो जाती है। की उपस्थिति के कारण mCherry तनाव पर महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव जीएफपी - ΔretS मनाया नहीं गया। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक GFP-to-RFP सिग्नल के अनुपात की तुलना में अधिकतम mCherry संकेत की साजिश रचने के दौरान, कुओं में जीपीपी-ΔretS का उच्च अनुपात होने पर mCherry अभिव्यक्ति में कोई कमी नहीं मिली थी।

चित्रा 5
चित्रा 5: फ्लोरोसेंट ग्रोथ ट्रैक्जिटरी एक संशोधित उपस्कर समीकरण के साथ फ़िट। ( ए ) उदाहरण वक्र सामान्यीकृत है और फिर तीन पैरामीटर, अधिकतम तीव्रता (ए), अधिकतम दर (μ), और एक अंतराल समय (τ) समायोजित करके संशोधित रसद समीकरण के साथ फिट है। ( बी ) विभिन्न व्यास के व्यक्तिगत कुओं में प्रारंभिक एमकेरी सिग्नल बनाम प्रारंभिक जीएफपी सिग्नल। ( सी ) अधिकतम एमकेरी रिपोर्टर सिग्नल जीएफपी-व्यक्त जीवाणुओं की आरएफपी-व्यक्त बैक्टीरिया की प्रारंभिक तीव्रता के अनुपात बनाम लगाए गए थे।Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

म्यूज लैब में पिछले काम में संकेत मिलता है कि प्रकार VI स्राव के प्रभावों को स्राव और अतिसंवेदनशील कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क की आवश्यकता होती है और यह कि अधिक संपर्क अवधि अधिक कोशिका विश्लेषण 23 में होता है । इसलिए, हम मानते हैं कि इन सरणियों में, दो म्यूटेंटों की घातीय वृद्धि, इस मॉडल प्रणाली में संपर्क-मध्यस्थता वाले रोगजनक प्रभावों को दूर करती है। हालांकि, सभी आकार के कुओं में, जीएफपी- और एमकेरी-व्यक्त जीवाणु अलग पैच ( आंकड़े 2 और 3 ) में बढ़ते हैं। इसलिए, विकास दर पर ध्यान केंद्रित करने के बजाय, संपर्क-मध्यस्थता वाले रोगजनक कलाकारों वाले बैक्टीरिया के समुदायों को स्थानिक विश्लेषण का उपयोग करके बेहतर अध्ययन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फोकस के बजायएकीकृत तीव्रता पर एनजी, जो कि एक अच्छी तरह से लाल या हरे रंग की कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, यह माइक्रोवेय प्रारूप प्रारूपित करने के लिए लाल और / या हरी पिक्सल की संख्या और स्थान की अनुमति देता है। सीमाओं पर ध्यान केंद्रित करते हुए इन कुओं के भीतर अलग-अलग कॉलोनियों या पैचों के विकास का विश्लेषण करना संभव है, जहां लाल और हरे रंग का संकेत ओवरलैप होते हैं ( चित्रा 6 ए )। सह-स्थानीयकरण की घटनाओं और निकटतम पड़ोसी विश्लेषण को बढ़ाकर उसके बाद पैच का आकार, पैच विकास दर और व्यक्तिगत कुओं के भीतर पैच ओवरलैप जैसी संपत्तियों पर अधिक बारीकी से देखने के लिए क्रियान्वित किया जा सकता है। स्थानिक विश्लेषण उच्च-बढ़ाई इमेजिंग और confocal माइक्रोस्कोपी ( चित्रा 6 बी) द्वारा सहायता प्राप्त किया जाएगा।

चित्रा 6
चित्रा 6: विभिन्न प्रजातियों के स्थानिक संगठन का विश्लेषण Epifluorescent और Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकते हैं। ( बी और सी ) 15 माइक्रोन व्यास की कन्फोकल छवियों (20 एक्स बढ़ाई, एनए = 0.8), ~ 7.5 माइक्रोन गहरी कुएं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस लेख में बैक्टीरिया समुदाय के विकास के उच्च-थ्रुपुट और उच्च-सामग्री लाइव-सेल इमेजिंग-आधारित विश्लेषण को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक माइक्रोऑवेल सरणी डिवाइस और प्रायोगिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए थे। यद्यपि यहां प्रदर्शन का फोकस समुदाय के विकास पर संपर्क-मध्यस्थता प्रकार VI के स्राव के प्रभावों का अध्ययन करना था, लेकिन सरणियों को लचीला होना और एक व्यापक श्रेणी के माइक्रोबियल समुदायों और सूक्ष्मजीव-सूक्ष्म जीवों के अंतःक्रियाओं के अध्ययन के लिए डिजाइन किया गया था। यहां काम केवल बैक्टीरिया के उपयोग पर केंद्रित है, जो सदस्यों की बहुतायत और स्थान के सहज ट्रैकिंग की अनुमति देने के लिए निर्विवाद रूप से फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करता है। हालांकि, रासायनिक पर्यावरण को बदलकर विकास या गड़बड़ी के बाद व्यक्तिगत कुओं से जैविक पदार्थों के नमूने के अवसर समुदाय में संरचना और जीन अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रत्येक सिलिकॉन डिवाइस कई अच्छी तरह से माइक्रोवेल्स युक्त दर्जनों एरे से बना हैDiameters, या तो एक 2x, 3x, या 4x व्यास पिच पर आयोजित, और 3 और 3.5 माइक्रोन के बीच गहराई से etched। चूंकि पोषक तत्व और द्वितीयक चयापचयों, एग्रोसे ढक्कन के माध्यम से और आज़ादी से फैले हुए हो सकते हैं, विभिन्न पिच सब-एरेज़ को माइक्रोवेल्स या स्थानीय पौष्टिक कमी के प्रभाव समुदाय के विकास के बीच सिगनलिंग की जांच करने के लिए शामिल किया गया था। इस प्रदर्शन में, विकास और समुदाय के विकास को माइक्रोवेल्ल अंतर या एरे के भीतर स्थान से प्रभावित नहीं हुआ। छवि विश्लेषण को आसान बनाने के लिए उथले गहराई को चुना गया, एक एकल छवि विमान में सभी माइक्रोबियल विकास और विकास को सीमित करना। हालांकि, गहरा कुएं (20 माइक्रोन गहरा) पहले इस्तेमाल किया गया है और आसानी से सिलिकॉन नक़्क़ाशी की प्रक्रिया की अवधि को बदलकर गहराई में परिवर्तित किया जा सकता है। कुओं के पहलू अनुपात को बढ़ाने से कुओं के इंटीरियर में कोशिकाओं द्वारा अनुभवी कारावास की डिग्री को बदलकर आवश्यक रूप से कुल अच्छी मात्रा के अनुपात को प्रभावी ढंग से बदल दिया जाता हैक्षेत्र के माध्यम से जो पोषक तत्वों को अच्छी तरह से ऊपर में फैल जाता है सरणी कॉन्फ़िगरेशन की यह विविधता का उपयोग अच्छी तरह से या इंट्रा-वाइस सिग्नल के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

माइक्रोवेल्स बनाने के लिए सिलिकॉन का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि यह दृश्य प्रकाश के लिए अपारदर्शी है। नतीजतन, नियमित विश्लेषण जो कि प्रकाश के प्रसारण ( जैसे, उज्ज्वलफील्ड, चरण या अंतर हस्तक्षेप विपरीत इमेजिंग) पर भरोसा करते हैं , उनका उपयोग विकास की निगरानी के लिए नहीं किया जा सकता है। हमारे समूह में चल रहे अनुसंधान और विकास ने इस सिलिकॉन माइक्रोवेल्ल विन्यास और पारदर्शी सरणियों के साथ काम करने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल को मॉनिटरिंग और मात्रा का ठहराव के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल फील्ड्स इमेजिंग की अनुमति देने पर ध्यान केंद्रित किया है। फैब्रिकेशन के लिए पारदर्शी सामग्री का उपयोग करके, जैसे कि ग्लास कंसलिप पर एसयू -8 एपॉक्सी, हल्की काम दूरी पर काम करने वाले उद्देश्यों के साथ दोनों उज्ज्वलफील्ड और प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करना संभव है।यह पानी के विसर्जन या तेल के उद्देश्यों के साथ प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, जिसमें एएएपी परत के माध्यम से इमेजिंग की कठिनाई के बिना ≥40X बढ़ाई होती है, जैसा कि सिलिकॉन सरणियों के लिए मामला है।

जैसा कि हमारे पूर्व कार्य में वर्णित है, बीजों की स्थिति और अच्छी ज्यामिति को अच्छी तरह से सरणियों के भीतर कोशिकाओं के बीज लगाने पर प्रभाव पड़ता है। कम बोने वाले घनत्व या छोटे कुओं में, संख्याओं और प्रकार के कोशिकाओं में भिन्नता के उच्च स्तर व्यक्तिगत कुओं में लोड होने से प्रायोगिक पैरामीटर अंतरिक्ष के व्यापक और तेजी से अन्वेषण की अनुमति मिलती है। उच्च बोने वाले घनत्व और / या बड़े कुएं इमेजिंग सेल प्रकारों और कुल इनोकुल्म स्तरों के अधिक सुसंगत अनुपात प्राप्त करते हैं, जिससे बड़ी संख्या में प्रयोगात्मक प्रतिकृतियों के विश्लेषण की अनुमति मिलती है। विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान छवियों को त्वरित रूप से देखने से पता चलता है कि कोशिकाओं को मुख्य रूप से कुओं के किनारों ( चित्रा 5 ए ) के साथ बढ़ते और बढ़ते हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि यह एक कलाकृति है जो एस से संबंधित हैबीज बोने की प्रक्रिया के दौरान सुपाती सूखने या कई किनारों को सेल लगाव के लिए प्राथमिकता का सुझाव देता है। जानबूझकर तरीके से कुओं के स्थलाकृति या सतह के रसायन को जानबूझकर बदलने से पता चलता है कि कौन से कारकों को सेल लगाव और बायोफिल्म गठन पर सबसे अधिक प्रभाव पड़ता है।

इन कुओं में बैक्टीरिया का विकास आर 2 ए माध्यम से संचारित एक agarose जेल-लेपित कांच के आवरण के उपयोग से समर्थित है। इस agarose-coated coverslip बनाने के लिए वर्णित विधियों छवि और एक काफी स्थिर z- स्थिति के माध्यम से एक भी मोटाई सुनिश्चित करने के लिए, एक साथ कई सिलिकॉन चिप छवियों की संभावना के लिए अनुमति देता है। अति-शुद्ध agarose के रूप में gelling एजेंट के रूप में और एक पूर्ण मध्यम परिणाम के बजाय एक न्यूनतम मध्यम, क्लीनर, कम autofluorescent पृष्ठभूमि में, समग्र संकेत-टू-शोर अनुपात में वृद्धि। माइक्रोबियल समुदायों की मात्रात्मक ट्रैकिंग के प्रति प्रतिदीप्ति पर निर्भर होने पर, कल्पना रखना महत्वपूर्ण हैएनजी की शर्तों को सुसंगत और ऑटोफ्लोरेसेंस, फोटोबलीचिंग, और गैर-वर्दी रोशनी से योगदान के बारे में तीव्रता से अवगत होना चाहिए। इसके अलावा, प्रयोगों के लिए लंबे समय से व्यतीत होने वाली छवि अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, यहां का इस्तेमाल किया जाने वाला एगारोज़ की एक मोटी परत वांछित है। उच्च आवर्धन इमेजिंग को सक्षम करने के लिए पतली परतें (~ 100 सुक्ष्ममापी मोटी) बनाई जा सकती हैं। हालांकि, विधानसभा को आर्द्र रखना काफी मुश्किल है ताकि वह पतली परत को सूखने से रोक सकें।

यद्यपि विकास मापदंडों और प्रारंभिक inoculum स्तरों का प्रारंभिक विश्लेषण अभी तक यहां वर्णित सरल प्रणाली के लिए कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं दिखाया है, दिखाया प्रोटोकॉल और डेटा जानकारी की गहराई पर ज़ोर देते हैं जो समय के साथ सामुदायिक विकास की छवियों से निकाला जा सकता है। कुओं के भीतर स्थित स्थानिक संगठन विकसित होता है क्योंकि प्रारंभिक "न्यूक्लेशन" साइटों से एकल-प्रजाति के उपनिवेशों का विस्तार होता है। इस प्रकार, प्रारंभिक लगाव घनत्व से संबंधित कारककिसी अन्य प्रजाति की तुलना में अच्छी तरह से एक प्रजाति की तुलना में पी एस) दूसरे की तुलना में) या व्यक्तिगत पैच की वृद्धि दर नाटकीय रूप से सामुदायिक विकास को प्रभावित कर सकती है। सूक्ष्म अंतःक्रियाएं, जैसे प्रजातियां (पैचेस) के बीच संपर्क द्वारा मध्यस्थता के रूप में विकास की प्रक्रिया में बहुत देर से स्थापित छवि के डेटा के अधिक गहराई से विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है।

यहां प्रस्तुत माइक्रोवेल्ल सरणी मंच और प्रोटोकॉल, सूक्ष्म जैविक समुदाय के विकास और सूक्ष्म-सूक्ष्मजीवों के संपर्कों के तेजी से विधानसभा और उच्च-सामग्री विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं। भविष्य के काम से स्थानीय रासायनिक पर्यावरण के नियंत्रण की अनुमति दी जाती है, अगर माध्यम की ढक्कन के बीच की संरचना को बदलकर या एकीकृत माइक्रोफ्लुइडिक्स के माध्यम से सीधे मॉड्यूलेटिंग और नमूनाकरण से, प्रायोगिक प्रोटोकॉल के लिए अनुमति दी जानी चाहिए जो कि प्राकृतिक कारावास और आला आकार की नकल की ओर बढ़ें और शुरू हो प्रकृति में पाए जाने वाले लोगों के समान गतिशील रूप से बदलते परिवेश के प्रभाव का पता लगाएं। भविष्य के काम में वृद्धि होगीएकीकृत माइक्रोफ़्लुइडिक्स के साथ सरणी डिजाइन का उपयोग स्थानीय रासायनिक पर्यावरण को गतिशील रूप से व्यवस्थित करने के लिए और व्यक्तिगत कुओं से तरल पदार्थ को नमूना करने के लिए किया जा सकता है। ऑप्टिटेक्स्ट स्पष्ट माइक्रोऑवेल सरणियों के विकास पर अतिरिक्त काम जो कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सामुदायिक विकास के उज्ज्वल फील्ड्स ट्रैकिंग का वर्णन कहीं और 27 में किया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

माइक्रोवेल सरणियों को गढ़े और नैनोफस मैट्रिक्स साइंस के लिए सेंटर फॉर यूजर फीचर डिवीजन, बेसिक एनर्जी साइंस का कार्यालय, यूएस डिपार्टमेंट ऑफ एनर्जी इस काम के लिए वित्तीय सहायता ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी डायरेक्टर रिसर्च एंड डेवलपमेंट फंड के जरिए प्रदान की गई थी। लेखक इन अध्ययनों में इस्तेमाल पी। एरुगिनोसा उपभेदों की आपूर्ति के लिए जे। माउगस लैबोरेटरी (वाशिंगटन विश्वविद्यालय, सिएटल, वाशिंगटन) का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

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References

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बायोइन्जिनिअरिंग इश्यू 124 माइक्रोवेयल माइक्रोबियल समुदाय उत्तराधिकार माइक्रोफ्लिडिक्स माइक्रोफैब्रिकेशन नैनोफैब्रिकेशन लिफ्ट-ऑफ सेल सरणी आला कारावास
एक Microwell Array प्लेटफॉर्म के भीतर विधानसभा और माइक्रोबियल सामुदायिक विकास का ट्रैकिंग
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Timm, A. C., Halsted, M. C.,… More

Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

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