Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform
Summary
Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von Faktoren ab, einschließlich Umweltarchitektur, Mitgliedshäufigkeit, Züge und Wechselwirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine synthetische, mikrogefertigte Umgebung für die gleichzeitige Verfolgung von Tausenden von Gemeinschaften, die in Femtoliter-Vertiefungen enthalten sind, wo Schlüsselfaktoren wie Nischengröße und Einschluss angenähert werden können.
Abstract
Die Entwicklung der mikrobiellen Gemeinschaften hängt von einer Kombination von komplexen deterministischen und stochastischen Faktoren ab, die die räumliche Verteilung und die Aktivitäten der Gemeinschaftsmitglieder drastisch verändern können. Wir haben eine microwell-Array-Plattform entwickelt, mit der Tausende von Bakteriengemeinschaften parallel versammelt und verfolgt werden können. Dieses Protokoll unterstreicht den Nutzen der Plattform und beschreibt seine Verwendung zur optischen Überwachung der Entwicklung einfacher, zweiköpfiger Gemeinschaften innerhalb eines Ensembles von Arrays innerhalb der Plattform. Diese Demonstration verwendet zwei Mutanten von Pseudomonas aeruginosa , Teil einer Reihe von Mutanten entwickelt, um Typ VI Sekretion Pathogenität zu studieren. Chromosomale Insertionen von entweder mCherry- oder GFP-Genen erleichtern die konstitutive Expression von fluoreszierenden Proteinen mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, die verwendet werden können, um die Häufigkeit und die Lage des Gemeinschaftsmitglieds innerhalb jeder Mikrovertiefung zu überwachen. Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes methoD zum Zusammenbau von Bakteriengemischen in die Vertiefungen des Arrays und unter Verwendung von zeitraffer Fluoreszenzbildgebung und quantitativer Bildanalyse, um das relative Wachstum jeder Mitgliedspopulation über die Zeit zu messen. Die Aussaat und Montage der Mikrotiterplattform, die bildgebenden Verfahren, die für die quantitative Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des Arrays notwendig sind, und die Methoden, die verwendet werden können, um Wechselwirkungen zwischen mikrobiellen Speziesbereichen zu diskutieren, die alle diskutiert werden.
Introduction
Die mikrobiellen Gemeinschaften sind sowohl durch deterministische Faktoren wie die Struktur der Umwelt und stochastische Prozesse geprägt, die mit dem Zelltod, der Teilung, der Proteinkonzentration, der Anzahl der Organellen und der Mutation verbunden sind. Innerhalb der natürlichen Umgebung kann es fast unmöglich sein, die individuellen Auswirkungen dieser Einflüsse auf die Zusammensetzung und die Aktivität der Gemeinschaft zu analysieren. Von natürlichen Strukturen verdeckt und in einem chemischen und biologischen Milieu begraben, die Mitglieder der Gemeinschaft zu identifizieren und ihre räumlich-zeitliche Verteilung in der natürlichen Umgebung zu lösen, ist äußerst anspruchsvoll. Dennoch haben die jüngsten Bemühungen die Bedeutung der räumlichen Organisation auf die Gemeinschaftsfunktion unterstrichen und auf die Notwendigkeit hingewiesen, sowohl die Mitgliedshäufigkeit als auch die Organisation in den laufenden Studien 2 , 3 , 4 zu berücksichtigen.
EsIst klar, dass die lokale chemische Umgebung ( dh die Verfügbarkeit von Nährstoffen und sekundären Metaboliten), die physikalische Struktur ( zB Bodenarchitektur, Pflanzenwurzeln, Ozeanpartikel oder die intestinalen Mikrovilli), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Sauerstoff und die Einführung von Pathogene Arten alle beeinflussen die Zusammensetzung, die Architektur und die Funktion der mikrobiellen Gemeinschaften 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Nichtsdestotrotz dominieren traditionelle Techniken für Kulturen, die diese Faktoren nicht erfassen. Gemeinschaftszusammensetzung ( z. B. das Vorhandensein von Co-abhängigen Spezies), die physikalische Bindung, die Signalmolekülkonzentration und der direkte Zellzellkontakt sind alle wichtigen Faktoren für die Gestaltung einer mikrobiellen Gemeinschaft und können in c verloren gehenOnventionelle Kulturbedingungen. Diese Eigenschaften sind in einer Bulk-Flüssigkultur oder auf einer Agarplatte schwer zu replizieren. Die Verfügbarkeit von mikrofluidischen, Mikrostrukturen und Nanofabrikationstechniken, die die Replikation der wichtigsten physikalischen und chemischen Eigenschaften natürlicher Umgebungen ermöglichen, hat es vielen Forschern ermöglicht, bakterielle Gemeinschaften zu bauen, um ihre Wechselwirkungen 12 , 13 , 14 zu untersuchen und synthetische Umgebungen zu entwickeln Imitieren natürliche Bedingungen 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung einer Mikrowellen-Array-Vorrichtung und liefert detaillierte experimentelle Verfahren, die verwendet werden können, um Th zu funktionalisierenE Wells in der Array und Bakterien zu wachsen, sowohl als Single-Spezies-Kolonien und in Multi-Mitgliedsgemeinschaften. Diese Arbeit zeigt auch, wie Bakterien modifiziert, um fluoreszierende Reporter-Proteine zu produzieren, können verwendet werden, um das Bakterienwachstum in den Brunnen im Laufe der Zeit zu überwachen. Ein ähnliches Array wurde zuvor vorgestellt und zeigte, dass es möglich ist, das Wachstum von Einzelkolonien von Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) in Mikrovertiefungen zu verfolgen. Durch die Modulation von Well-Size und Seeding-Dichte können die Ausgangsbedingungen von Tausenden von Wachstumsexperimenten parallel variiert werden, um zu bestimmen, wie die anfänglichen Inokulationsbedingungen die Fähigkeit der Bakterien beeinflussen, 21 zu wachsen. Die aktuelle Arbeit verwendet eine leicht modifizierte Version des microwell-Arrays, die auf der vorherigen Arbeit aufbaut, indem sie den gleichzeitigen Vergleich von mehreren Arrays ermöglicht und ein robusteres experimentelles Protokoll verwendet. Das Array, das in dieser Arbeit verwendet wird, enthält mehrere Subarrays oder Array ensemBles, die Brunnen unterschiedlicher Größe enthalten, die von 15 – 100 μm im Durchmesser reichen, die in drei verschiedenen Tonhöhen angeordnet sind ( dh 2x, 3x und 4x der Bohrlochdurchmesser). Die Arrays werden in Silizium geätzt, und das Wachstum der in den Silizium-Arrays ausgesetzten Bakterien wird durch Versiegeln der Arrays mit einem Deckglas ermöglicht, das mit einem Medium-infundierten Agarosegel beschichtet worden ist. P. aeruginosa- Mutanten, die entworfen wurden, um das Typ-VI-Sekretionssystem zu studieren, werden in dieser Demonstration verwendet.
Die hier vorgestellten Ergebnisse bauen auf das ultimative Ziel, Multimember-Communities innerhalb von Mikrowellen-Arrays zu analysieren, so dass Forscher die Fülle und Organisation von Bakterien in situ überwachen können, während sie die chemische Umgebung kontrollieren und untersuchen. Dies sollte letztlich Einblicke in die "Regeln" geben, die die Gemeinschaftsentwicklung und die Nachfolge bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel präsentierte ein microwell-Array-Gerät und experimentelle Protokolle entwickelt, um High-Throughput-und High-Content-Live-Zelle Imaging-basierte Analyse der bakteriellen Community-Entwicklung zu ermöglichen. Während der Schwerpunkt der Demonstration hier war, um die Effekte der kontaktvermittelten Typ-VI-Sekretion auf die Entwicklung der Gemeinschaft zu untersuchen, wurden die Arrays so konzipiert, dass sie flexibel sind und die Untersuchung einer breiten Palette von mikrobiellen Gemeinschaften und Mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microwell Arrays wurden hergestellt und charakterisiert im Zentrum für Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch den Forschungs- und Entwicklungsfonds des Oak Ridge National Laboratory Director Die Autoren danken auch dem J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) für die Lieferung von P. aeruginosa- Stämmen, die in diesen Studien verwendet wurden.
Materials
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U |
| Automated Stage | Prior | ProScan III |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 |
| commercial software | Nikon | NIS Elements |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | |
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
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