Summary
このプロトコールの目的は、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置および免疫染色を実証することである。この技術は、聴覚研究におけるインビトロスクリーニングツールとして利用することができる。
Abstract
過去数十年間にわたり聴覚研究において顕著な進歩があったが、内耳の繊細な機械感覚構造の損傷または喪失を典型的に伴う状態である感音神経難聴（SNHL）の治療法はまだない。近年、精巧なin vitroおよびex vivoアッセイが出現しており、SNHLの治療法を開発するためのリソースを最小限に抑えながら、潜在的治療化合物のスクリーニングを可能にしています。特定の細胞型の均質な培養物が現在の研究において重要な役割を果たし続けているにもかかわらず、多くの科学者は現在、蝸牛外植片としても知られているより複雑な器官型の内耳細胞培養に頼っています。内耳内の組織化された細胞構造の保存は、内外の有毛細胞、らせん状神経節ニューロン、神経細胞を含む蝸牛インフルエンザの様々な成分のin situ評価を容易にするites、および支持細胞。ここでは、新生仔ネズミの蝸牛外植片の調製、培養、処置、および免疫染色を提示する。これらの外植片の注意深い準備は、SNHLに寄与する機構の同定を容易にし、聴覚研究共同体にとって貴重なツールとなる。
Introduction
感音神経障害（SNHL）は、内耳または上行する聴覚経路への損傷を反映する。難聴はヒトの最も一般的な感覚障害であるが、治癒療法はまだ存在していない2 。蝸牛や聴覚の脳幹インプラントは、重度から重度のSNHLの患者にある程度の聴覚を回復することができますが、これらの装置で提供される聴力は、特に聴覚の発声を理解したり、音楽を聴いたりする試みにおいて、
毛細血管変性は長い間、外傷性聴覚事象（ 例えば、大きな騒音への曝露）の主な結果と考えられているが、有毛細胞から聴神経へ情報を伝達するシナプスは少なくとも音響外傷3 と同様に脆弱であるという証拠が増えている3 、 4,5 > 、 6 。聴覚機能の評価のための現行の金標準である人間の聴力検査閾値は、内耳の特定の細胞損傷を予測しないので、細胞変性をできるだけ早期に検出し、適切な治療を開始するためにより洗練されたツールが必要です。
難聴のための有望な薬学的治療は、しばしば、インビトロでの均一な細胞培養物について試験されるが、このようなシステムは、蝸牛の微小環境を正確にモデル化しない。蝸牛細胞は、Corti 10,11またはSpiral Ganglion Neurons（SGN） 12の臓器を単離培養したときに失われる重要なインビボ過程である蝸牛8,9内の他の細胞型に影響を及ぼす栄養因子を分泌することが知られている分子マーカーを分析するしかしながら、「精密医学」の追求において、難聴のための新たなパーソナライズされた治療法を確立するためのインビトロデータの検証に必要であり得るインビボ研究は、かなりの資源と時間を必要とする。聴力検査とその後の蝸牛全体装着の中耳または円形窓膜注入を完璧に行うためにどれだけの労力が必要ですか？蝸牛外植体として知られている器官型ex vivo培養物の有望な化合物の効率的なスクリーニングは、 14,15,16,17 。
この記事では、治療された蝸牛外植片を生成、維持、評価するためのプロトコルについて詳述します。スクリーニングでの使用を含むこのモデルの特定のアプリケーションが強調されています遺伝子治療のためのウイルスベクターの比較評価を含む。 エクスビボでの外植片アプローチにより、研究者は、異なるタイプの細胞集団に対する所定の治療の効果を現場で視覚化し、細胞型特異的機構の同定およびその後の標的化治療の洗練を容易にすることができる。
全体的に、この技術は、蝸牛内に共存する非常に異なる細胞タイプ間の重要なクロストークを維持しながら、 生体外で蝸牛を研究するモデルを提供する。
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Protocol
この研究プロトコールは、マサチューセッツ州の眼および耳の施設動物管理および使用委員会（IACUC）によって承認された。実験は世界医師会の倫理規定に従って実施された。
1.解剖の準備
- 手術テーブルの準備
- 70％エタノールを使用して外科用テーブルを消毒する。
- 2つの非滅菌準備パッドを顕微鏡の隣に置きます。
- 熱殺菌した手術用ハサミ、メスハンドル、マイクロナイフ、鉗子（＃4と＃55の2つずつ）を含む計器トレイを準備します。器具トレイと50mmの透明壁のガラス底ペトリ皿を1つの非滅菌パッドに置きます。
- 無菌の＃15メス刃を得る。密封可能なプラスチック製の袋または容器（制度上のガイドラインに沿って死体を処分するため）。バケツの氷;冷たい滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を含む。これらのアイテムを他の非滅菌パッド。
- HBSSを50 mLのプラスチック試験管に移し、氷上に置きます。
- 文化の準備
- すべての材料を層流フードで準備する。 4つの標本ごとに、35mm4ウェルペトリ皿の4つのインレーに4つのオートクレーブ処理した10mmの丸いガラスカバースリップを入れる。
- 4つの標本ごとに、以下のものからなる300μLの全量を微量遠心チューブに混合する：組織接着剤10μL、NaHCO 3285μLおよびNaOH5μL。
- 得られた溶液45μLをすべてのカバースリップに入れ、室温で少なくとも20分間放置する。この溶液は数時間カバースリップ上に放置することができるが、O / Nを放置することはできない。
- コンタミネーションに対する2つの障壁を作り出すために、1つまたは2つの35mm 4穴ペトリ皿を10cmのペトリ皿の中に置きます。
- 98％のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％N-2、および1％アンピシリン（（マイクロ）遠心分離管内で1ウェルあたり65μL）で洗浄した。使用前に25℃に加温してください。
2.マウスの蝸牛外植片の解剖
- 新生児マウスの断頭
- 60 mmのプラスチックペトリ皿を用意し、蓋に70％エタノールをスプレーして、表面が濡れるようにします。
- 冷たいHBSSをプラスチック製の実験室チューブから60mmのプラスチックの底部と50mmの透明なガラス底のペトリ皿に注ぎます。解剖されていないときはいつでも組織を冷たく保つために、プラスチック実験室管と両方のペトリ皿を氷上に保管してください。
- P3-P5歳の新生児マウスをラテックス手袋の切れた指の氷上に置き、低体温が意識消失（約1〜3分）を引き起こすまで待つ。
- 操作はさみでマウスをすばやく断頭し、シール可能なビニール袋に体を処分する。切断された新生児の頭を60mmのプラスチックシャーレの蓋の中の70％エタノール。
- 側頭骨の巨視的切開
- メスの刃を使用して、前端から後端（矢状縫合の上に直接）から表面切開を作ることによって、頭蓋骨の皮膚を除去する。
- 外耳道の両方をメスの刃で切って、皮膚を前方に折り畳んで頭蓋全体を露出させます。
注：このステップには通常、解剖顕微鏡は必要ありませんが、視覚化を改善するために使用することができます。 - ＃15メス刃を使用して矢状縫合に沿って頭蓋を開きます。蝸牛の圧迫を避けるために、刃を前方から後方へ静かに上下に動かして頭蓋を切断してください。
注：頭蓋骨はこの年齢で骨化してはならず、簡単に切るべきです。 - ＃15メスを使用して、軌道の直後の垂直カットを作成して、スナウトを取り出して破棄します刃。
注：頭蓋骨の後部にはまだ脳と蝸牛が含まれているはずです。 - ＃4鉗子で鈍的切開を行い、前脳、小脳、および脳幹を処分する。
- 蝸牛の微視的抽出
- スコープの下に鉗子を置き、照明と焦点を最適化することによって顕微鏡（倍率6.5倍）と光源を調整します。
- 冷たいHBSSで満たされた60mmプラスチックペトリ皿に頭蓋の2つの半分を置きます。
- 周囲の静脈動脈（側頭骨内の曲がりくねった動脈）に隣接していると同定できる蝸牛/ eを完全に露出させ、＃4の鉗子を用いて臓器を側頭骨から鈍く分離する。
- 蝸牛を50mmの透明なガラス底のペトリ皿に移し、顕微鏡の下に置く。
- 氷上に頭蓋の他の半分と60ミリメートルのプラスチックシャーレを置きます。 蝸牛を前庭系から取り出し、＃4の鉗子で蝸牛耳の嚢（典型的には軟骨性）を慎重に切開する。それ以降のすべてのステップで＃55鉗子を使用してください。
- 組織処理の最終ステップ
- マイクロナイフまたは2つの鉗子を用いて、コルチ器官に付着した螺旋靭帯を残りの蝸牛および神経節から注意深く分離することにより、内耳組織の処理を続ける。
- 螺旋靭帯と有毛細胞領域との間の隙間のより暗くて半透明な領域に切断し、螺旋靭帯を最も基本的な側面で把握し、尖った方向に動いている間にゆるやかに引き離すことに続く。
- 検体を配置して、蝸牛の長手方向矢状図を取得し、マイクロナイフを用いて蝸牛を2〜3つの切片に切断し、これらの切片を頂端、（中央、）およびbアナルターン。ペトリ皿に水平に横たわることができる蝸牛外植片を達成するために、有毛細胞および神経突起の実際の層と上および下組織を除去する。
注記：培養皿への安定した接着のための適切なサイズは、1つの蝸牛ターンの約半分である。 - 腹膜を静かに剥がして、コルチ器官のすぐ上の非常に薄い半透明の層である房膜を取り除く。
- Reissnerの膜をすぐにSGNよりも優れたものにし、両側に鉗子で触れ、剥がしてください。
注：横に位置する損傷した有毛細胞領域をマイクロナイフで切り取って取り除きます。
- マイクロナイフまたは2つの鉗子を用いて、コルチ器官に付着した螺旋靭帯を残りの蝸牛および神経節から注意深く分離することにより、内耳組織の処理を続ける。
3.検体の培養プレートへの移送
- 4つのカバースリップから45μLの組織接着剤溶液を除去する。各カバースリップを50μLの滅菌H 2 Oで洗浄する。水を吸引する。
- 1 mLのピペットを拾います。試料がチップの内側に付着しないように、約120μLのDMEMでピペットチップを濡らします。
- 1 mLピペットを用いて検体を個別に移す。 HBSSで満たされた、小さくて透明なガラス底のペトリ皿から最大70μLをピペットで取り、4ウェルのペトリ皿に4つのインレイ（カバースリップで調製）の1つに液体と共に試料を置く。
- 標本の向きが正しいことを顕微鏡（倍率50倍）で確認します。胸膜が除去された有毛細胞の領域が上向きであることを確認する。モディベラのトリムされた基底部分と一緒に、基底膜が下向きになり、カバースリップに付着することを確認する。
- 標本が検査の際に上下逆さまになっている場合は、ピペットチップに残っているHBSSをインレイに入れ、正しい方向になるまでピースの位置を変えます。
NOTE：これは、退化につながる可能性のあるカバースリップからの構造的支持なしに有毛細胞が培地中に浮遊することを防止する。
- 標本が検査の際に上下逆さまになっている場合は、ピペットチップに残っているHBSSをインレイに入れ、正しい方向になるまでピースの位置を変えます。
- 1 mLピペットを使用して過剰のHBSSを吸引する。 15秒待ちます。
- 調製した暖かい培地（98％DMEM、1％N-2、および1％アンピシリン）60μLを検体に直接ピペットで加える。ピペットで検体に触れないように注意してください。内側および外側のペトリ皿カバーを交換し、37℃でO / Nをインキュベートする。
- すべてのストック溶液を適切な場所に戻し、死骸や残留廃棄物を処分し、施設ガイドライン（ 例えば、エタノールや次亜塩素酸塩を使用して）に従って手術テーブルを除染し、器具をきれいにしてオートクレーブし、 。
4.最終的な培養培地および対象物質の追加
注：蝸牛外植片は、10-16時間後に使用する準備ができている。
- 混合物を準備する97％DMEM、1％ウシ胎児血清（FBS）、1％N-2、および1％アンピシリン（マイクロ遠心管内のウェルあたり65μL;使用前に溶液を25℃に暖める）。
- 該当する他の物質を、それぞれの治療グループのソリューションに追加します。蛍光物質（ 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現ウイルス;最近の発表では、10 10 GCのアデノ関連ウイルス（AAV）を50μL中48時間使用した） 18 、光。
- 孵卵器から蝸牛外植片を含むペトリ皿を移し、層流フードの下に置く。
- インレーからのピペットで古い培地（FBS無し）を吸引する。
- 調製した温かい培養（処理）培地（97％DMEM、1％FBS、1％N-2,1％アンピシリン、および対象物質）1ウェルあたり60μLを添加する。
- ペトリ皿をインキュベーター（37℃）に戻します。
- ビューr細胞の移動、または蝸牛外植片の剥離の兆候を同定し、最大7日後に染色を実施するために、顕微鏡下で公式に観察する。
5.免疫蛍光 - 1日目
- ブロッキング溶液（94％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、5％正常ヤギまたはウマ血清（2次抗体に応じてNGS / NHS）、および1％非イオン性界面活性剤（ 表の表を参照 ） （98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤をそれぞれの抗体とともに含む）で洗浄した。
注：抗体には、1：400+（ミオシン7A、内外の有毛細胞用）およびマウス抗TuJ1 1：200+（β-チューブリン、SGN用）またはマウス（IgG1）抗マウス抗体（後シナプス密度）、およびニワトリ抗NF-H1：1000 +（ニューロフィラメント（neurofilament））、抗マウスモノクローナル抗体SGNおよび神経線維の場合）。 "+" means "以上である必要があります。 - ピペットを用いて培地を吸引する。検体に触れないように注意してください。
- 層流フードの下で、滅菌PBSで蝸牛外植片を2回すすぎ、各洗浄後に5分間シェイカー上に検体を置く。
- シェーカー（フードの下）で20分間4％パラホルムアルデヒド（PFA - CAUTION）に組織を固定する。 PFAを吸引する。
- 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
- 蝸牛外植片を、シェーカー上で30分間、調製したブロッキング溶液（94％PBS、5％NHS、および1％非イオン性界面活性剤）中に置く。
- 蝸牛外植片をRTでのカウンター上の対応する一次抗体（使用前にボルテックス）O / Nを用いて調製ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）に入れる。
注：ペトリ皿をプラスチック製のラップ（またはアルミ箔）で囲まれた湿ったペーパータオルで包みますGFPを発現するウイルスなどの蛍光物質を含む）を含み、皿を湿潤に保ち、抗体溶液O / Nの蒸発を防止する。
6.免疫蛍光 - 2日目
- ステップ5.1で4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色（300nM）を調製し、ストック抗体溶液を使用して一次抗体に相補的な正しい二次抗体混合物を得る。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギ488 1：200+およびヤギ抗マウス568 1：200+ ORヤギ抗マウス（IgG1）568 1：1000+、ヤギ抗マウス（IgG2a）488 1：500+、およびヤギ抗ニワトリ647 1：200+またはファロイジン568 1：200+（内外の有毛細胞用））。
- 一次抗体溶液を吸引する。
- 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
- 蝸牛外植片を準備ストック抗体溶液（98.6％PBS、1％NHS、および0.4％非イオン性界面活性剤）にres（使用前にボルテックス）をカウンターで1.5時間インキュベートし、光から保護する。
- 二次抗体溶液を吸引し、DAPI染色液（シェーカー上に1分間置いてから吸引する）で蝸牛外植片をすすいでください。
- 60μLのPBSを蝸牛外植片に塗布し、ペトリ皿をシェーカーに5分間入れる。 PBSを吸引する。 3回繰り返します。
- 鉗子を使用して、4ウェルプレートから検体を含むカバーガラスを取り出し、蒸留水で満たされたレシピエントにそれらを浸し、ペーパータオルに垂直に接触させてカバースリップを乾燥させる。
- 顕微鏡スライド上に曇り止め装着媒体の一滴を置き、カバースリップを反転させて、下向きの組織を培地に浸す。
- 周りを覆って透明なマニキュアを使用してカバースリップをシールします（ガラスの下に試料を押しつぶすことなく）。乾燥した状態となるまで15〜20分間明かりから覆った部分にスライドを平らにしておきますそれらを箱に入れたり、共焦点顕微鏡の下で検査したりしてください。
注：蛍光染色は、スライドを4℃または-20℃で保存することで最もよく保存されます。
7.共焦点イメージング
- 神経突起およびSGNを含むCorti地域の器官の概要およびズームイン画像を取得します。
注：イメージングプロセスの標準設定：1,024×1,024ピクセル、400Hzの速度、フレーム平均3、20％の総合レーザー強度、通常20倍および63倍の油浸漬（潜在的に2倍デジタルズームと組み合わせる）。 405 5％DAPI、 "スマートゲイン" 766.8V、 "スマートオフセット" 0.0％〜488 15％のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、 "スマートゲイン" 622.2VのDAPI、Myo7A、およびTuJ1染色プロトコルのチャンネル設定が概説されています。 、 "スマートオフセット" 0.0％ - 561 13％テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、 "スマートゲイン" 562.4V、 "スマートオフセット" 0.0％。 - 画像をZスタックにマージするには、ソフトウェアを使用してz軸投影を得る。
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Representative Results
多くのプロトコルがCorti外植片の器官に焦点を当てていますが、この技法はSGNを含む蝸牛ターン全体の解剖学的構造を保存しようとします。これにより、研究者は、Cortiの器官に加えて、SGNの神経突起および体細胞に対する所与の治療の効果を分析する機会を得ることができる。ここに記載されているように、モディオラスの一部を保存する解剖を行うことは、コルチのみの器官を外植するよりも技術的に困難です。しかし、同じ方法論19,20を用いた2つの最近の刊行物において、前庭シュワン細胞腫分泌物（ 図1 ）および細胞外小胞を適用した後、この領域に有意な病理学的効果が観察されたため、神経突起およびSGN領域が重要である。このような変化は、単離されたCorti外植片の器官を用いることによっては明らかにされなかった。
Th支持細胞およびSGNに対する損傷細胞またはGFP発現細胞の定量化は、マニュアルカウントまたはImageJ Plugin NeuronJに組み込まれているような自動化プロセスによって行うことができる。これらのカウントの代表的な領域は、合計カウントとの相関を確認した後に確立できます。 3D再構成は、SGNのz軸投影におけるオーバーレイ効果を除外するのに特に有用である。ファイバ構成、所与のエリア当たりのSGNの数、およびSGNのソーマエリアを評価することができる。シナプス、有毛細胞および神経突起の染色および計数を図2に示す 。同様のプロトコルは、蝸牛全体マウントにも使用することができ、これらの目的のための信頼できるモデルであることが示されている17,21,22。他の研究者は、実験パラダイムに組み込むこともできるエレガントな代替方法を確立している23 </ sup> 、 24 。
培養の最大長は、通常、細胞移動の開始によって制限され、培養培地中のFBSの濃度に依存する。 FBSの割合が5％から3％または1％に減少すると、解剖学的に無傷の蝸牛外植片を維持する期間が約1週間に延長された（ 図3 ）。
図4は、48時間25の合成アデノ随伴ウイルスベクターAnc80による形質導入後のGFP陽性蝸牛外植片細胞を示す。内側の有毛細胞、外側の有毛細胞、および支持細胞をこの図で定量することができる一方で、3D再構築はSGN領域のGFP陽性細胞の定量化を助けることができる。異なるウイルス血清型は、ある種の細胞におけるそれらの形質導入効率に関して比較することができる説明された方法18を使用しています。
図 1：48時間にわたる大耳神経または前庭神経鞘腫からの分泌物とのインキュベーション後の頂端および基底領域由来の蝸牛外植片の代表的な共焦点顕微鏡画像 。 （ A ）外植片の概要画像。矩形は、クローズアップ画像の領域をマークします。スケールバー=200μm。 （ B - E ）有毛細胞と神経突起の拡大表示。スケールバー=50μm。緑=ミオシン7A（Myo7A）、有毛細胞;赤色=クラスIIIベータチューブリン（Tuj1）は、神経細胞構造を染色する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： Cochlear Explant Hair Cell Regionの共焦点顕微鏡画像。 （ A ）インタクトなシナプスは、シナプス前（C末端結合タンパク質、赤色）およびシナプス後（シナプス密度-95、緑色）タンパク質をニューロン構造（神経フィラメント、青色）の染色と共に標識することによって評価することができる。 OHC、外毛細胞; IHC、内有毛細胞。スケールバー=10μm。 （ B ）内有毛細胞領域（赤矢印）および神経突起（青矢印）の数で内有毛細胞領域に焦点を当てる。ニューロン構造の分断のために、カウント中に内有毛細胞からの距離を標準化することが重要である（白いフレームで強調され、シナプスに直接つながっている）。スケールバー=5μm。 （ C ）別個のシナプスのクローズアップ（2つのプレシナプスおよびシナプス後のペア、白い矢印で示されている）。スケールバー= 1＆ ＃181; m。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3： 3％または1％FBSのいずれかで培養した7日後の頂端および基底蝸牛外植片の代表的な共焦点顕微鏡画像。 （ AおよびB ）3％FBSでインキュベートした細胞は、4日から5日の間に移動を開始する（有毛細胞の明るい灰色の矢印、神経突起の赤色の矢印）、1％FBSのExplantsは7日目まで組織の完全性を維持する。ライトグレー：ミオシン7A（Myo7A）は、すべての有毛細胞を染色します。赤色：クラスIIIベータチューブリン（Tuj1）は、神経細胞構造を染色する。 OHC、外毛細胞; IHC、内有毛細胞。スケールバー=100μm、すべてのパネルに適用。iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図 4：48時間、合成アデノ随伴ウイルスベクターAnc80に暴露した後の蝸牛外植片の共焦点顕微鏡画像。形質導入された細胞はGFP（緑色）を発現する。ミオシン7A（Myo7A、青色）は外毛細胞（OHC）および内毛細胞（IHC）を染色する。クラスIIIβ-チューブリン（Tuj1、赤色）は、ニューロン構造を染色する。 Supp .: Sox2陽性支持細胞の面積; SGN、らせん状神経節ニューロン。スケールバー：100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
研究者は、蝸牛外植物を含む実験を行う前に解剖技術を完璧にしなければならない。有毛細胞は、学習曲線の早期に行われる解剖の間に一般的に損傷を受け、その完全性のための特に問題のある瞬間は、安定した手、適切な道具および経験を必要とする体膜の除去である。時間と資源を節約するために、解剖顕微鏡の下で視覚制御を行うべきであり、潜在的に損傷した領域に注目すべきである。高価な一次および二次抗体を使用する代わりに、ファロイジンのような安価な試薬が予備実験に適しています。わずかに損傷した外植片は、潜在的には、特定の実験（影響を受けていない切片の分析）または新しい抗体の組み合わせの試験において、対照として使用することができる。
標本の移送も特に重要です。標本の移送が保証されなければならないからです逆さまになっていない（被覆されたカバースリップの指針をしばしば縮退させない「浮遊」有毛細胞）。カバースリップ上の中央位置は、さらなるピペッティングステップを容易にする。
新規化合物（明らかに培地に可溶性でなければならない）を含む陰性対照実験では、外植片に適切なビヒクルを適用し、未処理の外植片に専ら焦点を当てないことが重要である。例えば、市販の薬剤が有効成分に加えてクエン酸ナトリウムを含む場合、クエン酸ナトリウム自体が効果を有する可能性があるため、ネガティブコントロールの蝸牛外植片にクエン酸ナトリウムを添加すべきである。
蝸牛外植片の使用の制限には、これらの器官型培養物は、典型的には、未だに生後発育の変化を経験している若い子孫に由来し、外植片を横切るイオン勾配の欠如があるインビボでの聴覚。しかし、プロトコルの有用性は、AAVs 18に関する最近の刊行物にはっきりと示されている。このベクター群は約4.7kbのパッケージング能力に限定されているが、いくつかのヒト症候群の治療のための重要な資源となっている26 。蝸牛外植片モデルを用いて、上記の刊行物は、有毛細胞およびSGNを含む様々な蝸牛細胞の形質導入において、Anc80ウイルスが伝統的なAAV血清型より優れていることを実証した。これらのインビトロでの知見は、インビボでのマウス仔の丸いウィンドウを通して最も有望な注射の候補を選択することによってその後確認された。 エキソビボモデルは、蝸牛の解剖学的構造をうまく再現し、インビボでの作業を行うのに必要な時間とリソースを削減する方法を提供します。
ex vの別の利点インビボモデルは、SNHLに寄与する特定の細胞機構の研究への応用の可能性である。腫瘍微環境（ 例えば、ヒト腫瘍分泌物）に見出される化合物を外植片に適用することにより、これらの化合物の蝸牛に対する効果を直接視覚化し、潜在的な薬物療法の有効性または毒性を評価する。これは、人工蝸牛を生検することができず、その内部の細胞をin vivoで視覚化することができないため重要です。例えば、最近の刊行物は、前庭神経から生じ、95％の患者において難聴を引き起こす頭蓋内腫瘍である前庭神経鞘腫から分泌されるタンパク質の耳毒性を調べた。人の腫瘍分泌物を蝸牛外植片に適用すると、対照健常人の神経からの分泌物と比較して、これらの分泌物の蝸牛への毒性が確認された19 。同じ実験はインビボで複製することが困難であろうこれは、免疫担当マウスにおいて生じるであろうヒトタンパク質に対する免疫原性応答のためである。
要約すると、この原稿は、 ex vivoモデルにおいて、蝸牛有毛細胞、シナプス、神経突起およびニューロンの同時研究を可能にする技術を提示する。このモデルは、 インビボでの試験に先立って潜在的に候補治療化合物18のスクリーニングを加速する一方で、ヒト分泌物19,20における因子を含む、蝸牛28に新たな分子の作用機序についての洞察を提供するのに役立つ。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この作業は、国立難聴者協会のR01DC015824（KMS）およびT32DC00038（SDサポート）、防衛省のW81XWH-15-1-0472（KMS）、Bertarelli財団（KMS）、ナンシーセイレスデー財団（KMS）、ラウアー耳鳴り研究センター（KMS）などがあります。 Jessica E. Sagers氏に感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
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