Summary
Formålet med denne protokol er at demonstrere forberedelse, kultur, behandling og immunostaining af neonatale murine cochleære eksplantater. Teknikken kan udnyttes som et in vitro- screeningsværktøj til høreforskning.
Abstract
Selv om der har været bemærkelsesværdige fremskridt med at høre forskning i de sidste årtier, er der stadig ingen kur mod Sensorineural Hearing Loss (SNHL), en tilstand, der typisk indebærer beskadigelse eller tab af de delikate mekanosensoriske strukturer i det indre øre. Sofistikeret in vitro- og ex vivo- assays er opstået i de seneste år, hvilket muliggør screening af et stigende antal potentielle terapeutiske forbindelser, samtidig med at ressourcerne minimeres og fremskyndet indsats for at udvikle kurer for SNHL. Selvom homogene kulturer af visse celletyper fortsat spiller en vigtig rolle i den nuværende forskning, er mange forskere nu afhængige af mere komplekse organotypiske kulturer af murine indre ører, også kendt som cochleære eksplanteringsstoffer. Bevarelsen af organiserede cellulære strukturer i det indre øre letter in situevalueringen af forskellige komponenter i den cochleære infrastruktur, herunder indre og ydre hårceller, spiral ganglion neuroner, neurItes og understøttende celler. Her præsenterer vi forberedelsen, kulturen, behandlingen og immunostaining af neonatale murine cochleære eksplanteringsmidler. Den omhyggelige forberedelse af disse eksplanterer letter identifikationen af mekanismer, der bidrager til SNHL, og udgør et værdifuldt værktøj til høreforeningen.
Introduction
Sensorineural Hearing Loss (SNHL) afspejler skader på det indre øre eller stigende auditiv vej. Mens høretab er det mest almindelige sensoriske underskud hos mennesker 1 , findes der ikke kurative terapier 2 . Selvom cochleære eller auditive hjernestammeimplantater kan genoprette en vis grad af hørelse hos patienter med alvorlig til dybden af SNHL, er høreapparatet fra disse enheder stadig meget forskelligt fra "naturlig" hørelse, især under forsøg på at forstå tale i støj eller at høre musik.
Mens hårcelledegenerering længe er betragtet som den primære konsekvens af traumatiske hørelser ( fx eksponering for kraftig støj), er der voksende tegn på, at synapserne, der transmitterer information fra hårceller til auditivnerven, er mindst lige så sårbare overfor akustisk traume 3 , 4 , 5 > , 6 . Da menneskelige audiometriske tærskler, den nuværende guldstandard til evaluering af hørefunktion, ikke forudsiger specifik cellulær skade i det indre øre, er der brug for mere raffinerede værktøjer til at detektere cellulær degenerering så hurtigt som muligt og at indlede en passende behandling 7 .
Lovende farmaceutiske behandlinger til høretab testes ofte på homogene cellekulturer in vitro , men sådanne systemer modelker ikke nøjagtigt det cochleære mikromiljø. Cochleære celler er kendt for at secernere trofiske faktorer, som påvirker andre celletyper i cochlea 8 , 9 , en afgørende in vivo- proces, der går tabt, når orginet fra Corti 10 , 11 eller Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 dyrkes isoleret eller når Molekylære markører analyseresEf "> 13. Imidlertid kræver in vivo- undersøgelser, der kan være nødvendige for validering af in vitro- data til etablering af nye, personlige behandlinger for høretab i forfølgelsen af" præcisionsmedicin "betydelige ressourcer og tid. Dette er især relevant, når man overvejer Hvor meget indsats der kræves for at perfektere og udføre mellemøre eller runde membranindsprøjtninger med høretest og efterfølgende dissektering af cochleære helmuffer. Den effektive screening af lovende forbindelser i organotypiske ex vivo kulturer, der kaldes cochleære eksplanteringsmidler, giver et økonomisk og pålideligt alternativ 14 , 15 , 16 , 17 .
Denne artikel beskriver en protokol, hvormed der genereres, vedligeholdes og evalueres behandlede cochleære eksplanteringsstoffer. Specifikke anvendelser til denne model understreges, herunder dens anvendelse i screeningenAf potentielt terapeutiske forbindelser og den sammenlignende evaluering af virale vektorer til genterapi. En ex vivo eksplosiv tilgang giver forskere mulighed for at visualisere virkningerne af en given behandling på forskellige cellepopulationer in situ , hvilket letter identifikationen af celletypespecifikke mekanismer og efterfølgende forbedring af målrettede terapeutiske midler.
Samlet set giver denne teknik en model til at studere cochlea ex vivo og samtidig bevare vital krydspredning mellem de meget forskellige celletyper, som eksisterer i cochlea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brugskomité (IACUC) i Massachusetts Eye and Ear. Eksperimenter blev udført i henhold til Verdensmedicinske Forenings Code of Ethics.
1. Forberedelse af Dissection
- Forberedelse af kirurgisk bord
- Brug 70% ethanol til at desinficere det kirurgiske bord.
- Placer to ikke-sterile præparater ved siden af mikroskopet.
- Klargør instrumentbrættet, herunder varmestiliseret betjeningssaks, et skalpelshåndtag, en mikrokniv og tang (to hver af # 4 & # 55). Placer instrumentbrættet og en 50 mm, klargjort, glasbundet petriskål på en ikke-steril pude.
- Hent en steril # 15 skalpelsblad; En forsegelig plastpose eller beholder (for at bortskaffe slagtekroppen i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer) Is i en spand; Og kold, steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Placer disse varer påAnden nonsterile pad.
- Overfør HBSS i et 50 ml plast laboratorierør og læg det på is.
- Forberedelse af kulturen
- Forbered alle materialer i en laminær strømningshætte. For hver fjerde prøve anbringes fire autoklaverede 10 mm runde glasdækslister i de fire indlæg i 35 mm 4-brønds petriskål.
- For hver 4 præparater blandes et totalt volumen på 300 μL bestående af følgende i et mikrocentrifugerør: 10 μl vævslimiddel, 285 μl NaHC03 og 5 μl NaOH.
- Sæt 45 μL af den resulterende opløsning på hvert dækslip og lad den være der i mindst 20 minutter ved stuetemperatur; Denne løsning kan efterlades på dækslet i flere timer, men kan ikke efterlades O / N.
- Placer en eller to 35 mm 4-brønds petriskål (e) i en 10 cm petriskål for at skabe to barrierer mod forurening.
- Forbered kulturmedium indeholdende 98% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 og 1% ampicillin (65 μl pr. Brønd i et (mikro) centrifugerør). Opvarm opløsningen til 25 ° C inden brug.
2. Murine Cochlear Explant Dissection
- Dekapitation af den neonatale mus
- Hent en 60 mm plast petriskål og sprøjt 70% ethanol i låget, så overfladen er våd.
- Hæld kold HBSS fra plastlaboratorierøret ind i bunden af 60 mm plastik og den 50 mm klare vægglassede petriskål med glasbund. Opbevar plastlaboratorierøret og begge petriskåle på is for at holde vævet koldt, når det ikke bliver dissekeret.
- Placer en P3 - P5-alderen neonatalmus på is i en cutx-finger af en latexhandske og vent til hypotermien fremkalder bevidsthedstab (ca. 1-3 minutter).
- Dekapitér musen hurtigt med opererende sakse og kassér kroppen i den forseglede plastpose. Sæt det afskårne neonate hoved i70% ethanol i låget på 60 mm plast petriskålen.
- Makroskopisk dissektion af den tidsmæssige knogle
- Fjern huden på kraniet ved at lave et overfladisk snit fra anterior til den bakre ende (direkte oven på sagittal suturen) ved hjælp af skalpelbladet.
- Skær begge ydre auditive kanaler med skalpelbladet og fold huden forfra for at eksponere hele kranen.
BEMÆRK: Selv om der ikke er brug for et dissektionsmikroskop til dette trin, kan det bruges til forbedret visualisering. - Åbn kranen langs sagittal suturen ved hjælp af # 15 skalpelbladet. Sørg for at skære kranen ved forsigtigt at flytte bladet op og ned fra forreste til bakre for at undgå kompression af cochleae.
BEMÆRK: Kraniet bør ikke nedbrydes i denne alder og skal let skære. - Fjern og kassér snuten ved at lave et lodret snit direkte bagved banerne ved hjælp af # 15 skalpelklinge.
BEMÆRK: Den bageste del af kraniet skal stadig indeholde hjernen og cochleae. - Kassér forhjernen, cerebellum og hjernestammen gennem stump dissektion med # 4 tang.
- Mikroskopisk ekstraktion af cochleae
- Juster mikroskopet (6.5X forstørrelse) og lyskilden ved at placere tang under anvendelsesområdet og optimere belysning og fokus.
- Placer de to halvdele af kranen i 60 mm plast petriskål fyldt med kold HBSS.
- Udsæt fuldstændigt cochlea / e, som kan identificeres som tilstødende den omgivende stapediale arterie (en tortuøs arterie inden for den tidsmæssige knogle) og adskilt organet fra den tidsmæssige knogle ved hjælp af # 4 tang.
- Overfør cochlea i 50 mm, klargjort, glasbundet petriskål, og anbring skålen under mikroskopet.
- Placer 60 mm plast petriskålen med den anden halvdel af kranen på is. Fjern cochlea fra vestibulærsystemet og omhyggeligt dissekere den cochleære otiske kapsel (typisk brusk i denne alder) med # 4 tang. Brug # 55 tang for alle yderligere trin.
- Endelige trin i vævsbehandling
- Fortsæt med behandlingen af det indre ørevæv ved omhyggeligt at adskille spiralbåndet, der er vedhæftet til Corti-organet, fra resten af cochlea og modiolus ved hjælp af mikrokniven eller to tang.
- Skær ind i det mørkere, gennemskinnelige område ved spalten mellem spiralbåndet og hårcelleområdet og fortsæt til den efterfølgende fjernelse af spiralbandet ved at gribe det på det mest basale aspekt og forsigtigt afvikle det, mens det bevæges apikalt.
- Placer prøven for at opnå et langsgående, sagittalt billede af cochleaen og skær cochleaet i to til tre sektioner ved hjælp af mikrokniven, idet disse sektioner klassificeres som apikale, (midterste) og bAsal drejninger. Fjern vævet overlegen og ringere end det faktiske lag af hårceller og neuritter for at opnå et cochlear eksplanterende stykke, der kan ligge horisontalt på petriskålen.
BEMÆRK: En passende størrelse til stabil vedhæftning til dyrkningsskålen er ca. halvdelen af en cochleær tur. - Fjern tectorial membranen, et meget tyndt gennemskinneligt lag umiddelbart overlegen til Corti-organet, ved forsigtigt at skille det væk med tang.
- Fjern Reissners membran, umiddelbart overlegen SGN'erne, ved at røre den med tang på begge sider og skrælle den væk.
BEMÆRK: Fjern eventuelle sideværts beskadigede hårcelleområder ved at skære dem væk med mikrokniven.
- Fortsæt med behandlingen af det indre ørevæv ved omhyggeligt at adskille spiralbåndet, der er vedhæftet til Corti-organet, fra resten af cochlea og modiolus ved hjælp af mikrokniven eller to tang.
3. Overførsel af prøver til kulturpladerne
- Fjern 45 μL vævslimidopløsning fra de fire dækslips. Vask hvert låg med 50 μL sterilt H 2 O. Aspirer vandet.
- Hæld 1 ml pipetten op. Våd pipette spidsen med ca. 120 μL DMEM for at forhindre prøven i at klæbe til indersiden af spidsen.
- Overfør prøverne individuelt ved hjælp af 1 ml pipetten. Pipetter højst 70 μL fra den HBSS-fyldte, små, vægvægte glasbundede petriskål, og læg prøven sammen med væsken på en af de 4 indlæg (fremstillet med dæklister) i 4-brønds petriskålen .
- Kontrollér under mikroskopet (50X forstørrelse), at prøven er i korrekt orientering. Sørg for, at det område af hårceller, hvorfra den tektoriale membran blev fjernet, vender opad. Sørg for, at basillemembranen, sammen med den trimmet, basale del af modiolus, vender nedad og klæber til dækslet.
- Hvis prøven er orienteret op og ned under inspektion, skal du deponere den HBSS, der forbliver i pipettespidsen i indlæg og genplacere stykket, indtil den er korrekt orienteret.
INGENTE: Dette forhindrer hårceller i at flyde i dyrkningsmediet uden strukturel støtte fra dækslet, hvilket kan føre til degenerering.
- Hvis prøven er orienteret op og ned under inspektion, skal du deponere den HBSS, der forbliver i pipettespidsen i indlæg og genplacere stykket, indtil den er korrekt orienteret.
- Aspirer overskydende HBSS ved hjælp af 1 ml pipetten. Vent i 15 s.
- Pipetter 60 μl af det fremstillede varme dyrkningsmedium (98% DMEM, 1% N-2 og 1% ampicillin) direkte på prøven. Pas på ikke at røre prøven med pipetten. Udskift de indre og ydre petriskåldæksler og inkubér O / N ved 37 ° C.
- Sæt alle lageropløsningerne tilbage på deres rette pladser, kassér slagtekroppe og resterende affald, dekontaminerer kirurgisk bord i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer ( f.eks. Ved brug af ethanol eller hypochlorit), rengør og autoklaver instrumenterne og kassér skærpene i den rette beholder .
4. Tilføjelse af endelige kulturmedier og interessante stoffer
BEMÆRK: Cochlear eksplanterer vil være klar til brug 10-16 timer senere.
- Forbered en blandingRe 97% DMEM, 1% føtalt bovint serum (FBS), 1% N-2 og 1% ampicillin (65 μl pr. Brønd i et mikrocentrifugerør, opvarm opløsningen til 25 ° C inden brug).
- Tilsæt andre stoffer af interesse for opløsningerne for de respektive behandlingsgrupper. Hvis fluorescerende stoffer tilsættes ( fx grønne fluorescerende proteiner (GFP) -expresserende vira, i en nylig offentliggørelse blev en koncentration på 10 10 GC adeno-associerede virus (AAV'er) anvendt i 48 timer i 50 μl) 18 , beskytter mod lys.
- Overfør de cochleære eksplanteringsholdige petriskåle fra inkubatoren og læg dem under den laminære strømningshætte.
- Aspirere det gamle dyrkningsmedium (w / o FBS) med pipetten fra indløbene.
- Tilsæt 60 μl pr. Brønd af det fremstillede varmkultur (behandlingsmedium) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillin og de pågældende stoffer).
- Placer petriskålen tilbage i inkubatoren (37 ° C).
- Se rEgulært under mikroskopet for at identificere tegn på forurening, cellulær migration eller frigørelse af det cochleære eksplantat og udføre farvning efter maksimalt 7 dage.
5. Immunofluorescens - Dag 1
- Forbered blokerende opløsning (94% phosphatbufferet saltvand (PBS), 5% normalt gede- eller hesteserum (NGS / NHS afhængigt af sekundære antistoffer) og 1% ikke-ionisk overfladeaktivt stof (se Materialebordet ) Antistofopløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk overfladeaktivt middel med de respektive antistoffer).
BEMÆRK: Antistoffer indbefatter kanin anti-Myo7A i en koncentration på 1: 400+ (myosin 7A, for indre og ydre hårceller) og mus anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulin til SGN'er) ELLER mus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (c-terminalt bindingsprotein til presynapse), mus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptisk densitet til postsynaps) og kylling anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, For SGN'er og nervefibre). "+" MeaNs "eller højere." - Aspirere dyrkningsmediet ved hjælp af en pipette. Pas på ikke at røre prøven.
- Skyll de cochleære eksplosioner under den laminære strømningshætte to gange med sterilt PBS, og anbring prøverne på en shaker i 5 minutter efter hver vask.
- Fastgør vævet i 4% paraformaldehyd (PFA - FORSIGTIG) i 20 minutter på rysteren (under emhætten). Aspirere PFA.
- Påfør 60 μl PBS på de cochleære eksplanteringsstoffer, og sæt petriskålen på en ryster i 5 minutter. Aspirere PBS. Gentag 3x.
- Placer de cochleære eksplanteringsstoffer i forberedt blokerende opløsning (94% PBS, 5% NHS og 1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel) i 30 minutter på ryster.
- Placer de cochleære eksplanteringsstoffer i en forberedt stamme antistofopløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk tensid) med de respektive primære antistoffer (hvirvel før brug) O / N på en tæller ved RT.
BEMÆRK: Indpak petriskålene med fugtige papirhåndklæder indesluttet i plastfolie (eller aluminiumfolie hvis den tilsatte opløsningIon indeholder fluorescerende materialer såsom GFP-udtrykkende vira) for at holde fadene fugtige og for at forhindre fordampning af antistofopløsningen O / N.
6. Immunofluorescens - Dag 2
- Forbered 4'-, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) pletten (300 nM) og brug stammeantistofopløsningen til opnåelse af de korrekte sekundære antistofblandinger, komplementære til de primære antistoffer i trin 5.1. ( F.eks . Gede-anti-kanin 488 1: 200+ og ged-anti-mus 568 1: 200+ eller gede-anti-mus (IgG1) 568 1: 1000+, gede-anti-mus (IgG2a) 488 1: 500+, Og gede-kylling 647 1: 200+ OR Phalloidin 568 1: 200+ (til indre og ydre hårceller)).
- Aspirer den primære antistofopløsning.
- Påfør 60 μl PBS på de cochleære eksplanteringsstoffer, og sæt petriskålen på en ryster i 5 minutter. Aspirere PBS. Gentag 3x.
- Placer de cochleære eksplanteringsstoffer i forberedt lagerantistofopløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk overfladeaktivt stof) med resternePektive sekundære antistoffer (hvirvel før brug) i 1,5 timer på en tæller og beskyt mod lys.
- Aspirer den sekundære antistofopløsning og skyll de cochleære eksplanterende stoffer med en DAPI-plet (placere på en ryster i 1 minut og derefter aspirere).
- Påfør 60 μl PBS på de cochleære eksplanteringsstoffer, og sæt petriskålen på en ryster i 5 minutter. Aspirere PBS. Gentag 3x.
- Brug tænger til at fjerne dæksler med prøver fra 4-brøndspladen, dypp dem ind i en modtager fyldt med destilleret H 2 O, og tør afdækningerne ved lodret at bringe dem i kontakt med papirhåndklæder.
- Anbring en dråbe antifade monteringsmedium på mikroskopglaset og vend dækslipene ind for at dyppe nedadvendt væv i mediet.
- Tæt dækslet med klar neglelak rundt om kanten (uden at knuse prøven under glasset). Lad gliderne ligge fladt i et overdækket område væk fra lys i 15 - 20 minutter indtil tør og thOg læg dem i en kasse eller undersøge under det konfokale mikroskop.
BEMÆRK: Fluorescerende farvning bevares bedst ved at lagre gliderne ved 4 eller -20 ° C.
7. Confocal Imaging
- Få et overblik og indzoomede billeder til Corti-regionen, herunder neuritter og SGN'er.
BEMÆRK: Standardindstillinger for billedbehandling: Format på 1.024 x 1.024 pixel, hastighed på 400 Hz, ramme gennemsnit på 3, 20% samlet laserintensitet og normalt 20X og 63X objektiv med oliedæmpning (muligvis kombineret med 2X digital zoom). Kanalindstillingerne for DAPI, Myo7A og TuJ1 farvningsprotokollen er beskrevet ovenfor: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% fluoresceinisothiocyanat (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Flett billederne i en z-stack ved hjælp afSoftware til opnåelse af en z-akse projektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens mange protokoller fokuserer på organer af Corti-eksplantater, forsøger denne teknik at bevare anatomien af hele cochlear-svinget, herunder SGN'erne. Dette giver forskere mulighed for at analysere virkningerne af en given behandling på neuritter og somata af SGN'er ud over Corti-organet. Udførelse af en dissektion, der bevarer en del af modiolus, som beskrevet her, er mere teknisk udfordrende end at eksplantere Corti-orgelet alene. Neurit- og SGN-området er imidlertid vigtigt, fordi signifikante patologiske virkninger blev observeret i denne region efter anvendelse af vestibulære schwannom-sekretioner ( figur 1 ) og ekstracellulære vesikler i to nylige publikationer under anvendelse af samme metode 19 , 20 . Sådanne ændringer kunne ikke have været afsløret ved anvendelse af isolerede organer af Corti-eksplantater.
thE kvantificering af beskadigede eller GFP-udtrykkende celler til indre og ydre hårceller, understøttende celler og SGN'er kan udføres ved manuel tælling eller med en automatiseret proces, såsom den indbygget i ImageJ-pluginet NeuronJ. Repræsentative områder for disse tæller kan etableres efter bekræftelse af deres sammenhæng med de samlede tællinger. 3D-rekonstruktioner er særligt nyttige for at udelukke overlejringseffekter i z-akse fremskrivninger af SGN'er. Fiberorganisation, antal SGN'er pr. Givet område og SGN soma-område kan vurderes. Farvningen og tællingen af synapser, hårceller og neuritter er afbildet i figur 2 ; Den samme protokol kan også bruges til cochlear hele fester og har vist sig at være en pålidelig model til disse formål 17 , 21 , 22 . Andre forskere har etableret elegante alternative metoder, der også kan indarbejdes i eksperimentelle paradigmer 23 </ Sup> , 24 .
Den maksimale længde af kulturen begrænses sædvanligvis ved starten af cellulær migration og afhænger af koncentrationen af FBS i dyrkningsmediet. Når andelen af FBS blev reduceret fra fem procent til tre procent eller en procent, blev tidsperioden for opretholdelse af en anatomisk intakt cochleær eksplanteret forlænget til ca. en uge ( figur 3 ).
Figur 4 demonstrerer GFP-positive cochleære eksplantatceller efter transduktion med den syntetiske adenoassocierede virusvektor Anc80 i 48 timer 25 . Indre hårceller, ydre hårceller og understøttende celler kan kvantificeres i denne opfattelse, mens en 3D-rekonstruktion kan hjælpe med at kvantificere GFP-positive celler i SGN-området. Forskellige virale serotyper kan sammenlignes med hensyn til deres transduktionseffektivitet i visse ceLl typer ved hjælp af den skitserede metode 18 .
Figur 1: Repræsentativ konfokal mikroskopi Billeder af cochleære eksplosiver fra de apikale og basale regioner efter inkubation med sekretioner fra store Auricular Nerves eller Vestibular Schwannomas i 48 timer . ( A ) Oversigt billede af en explant. Rektanglet markerer området i nærbilleder. Skalestang = 200 μm. ( B - E ) Zoom-in visninger af hårceller og neuritter. Målestang = 50 μm. Grøn = Myosin 7A (Myo7A), pletter hårceller; Rød = klasse III beta-tubulin (Tuj1), pletter neuronale strukturer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konfoktisk mikroskopi billede af den koglebærende eksplosive hårcellegruppe. ( A ) Inaktive synapser kan vurderes ved mærkning af presynaptisk (C-terminalt bindingsprotein, rødt) og postsynaptisk (postsynaptisk densitet-95, grøn) proteiner sammen med farvning af neuronale strukturer (neurofilament, blå). OHC, ydre hårceller; IHC, indre hårceller. Skalestang = 10 μm. ( B ) Fokuser på det indre hårcelleområde med antallet af indre hårceller (røde pilehoveder) og neuritter (blå pilehoveder). På grund af forgreningen af de neuronale strukturer er det vigtigt at standardisere afstanden fra de indre hårceller under tællingen (fremhævet med den hvide ramme, der er direkte forbundet med synapserne). Målestang = 5 μm. ( C ) Nærbillede af separate synapser (2 præ- og postsynaptiske par mærket med hvide pilehoveder). Skalestang = 1 & # 181; m. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative konfokale mikroskopi Billeder af apikale og basale cochleære eksplanter efter 7 d i kultur med enten 3% eller 1% FBS. ( A og B ) Celler inkuberet i 3% FBS begynder at migrere mellem 4 og 5 dage (lys grå pile til hårceller, røde pile for neuritter), ( C og D ) Explants i 1% FBS opretholder organisatorisk integritet indtil dag 7. Lysegrå: Myosin 7A (Myo7A), pletter alle hårceller; Rød: klasse III beta-tubulin (Tuj1), pletter neuronale strukturer. OHC, ydre hårceller; IHC, indre hårceller. Skalbjælke = 100 μm, på alle paneler.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Konfoktisk mikroskopi billede af en cochlear eksplanter efter eksponering for den syntetiske adenoassocierede virusvektor Anc80 i 48 timer. Transducerede celler udtrykker GFP (grøn). Myosin 7A (Myo7A, blå) pletter Yderhårceller (OHC) og indre hårceller (IHC); Klasse III beta-tubulin (Tuj1, rød) pletter neuronale strukturer. Supp .: område af Sox2-positive bærende celler; SGN, spiral ganglion neuroner. Skalestang: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskere skal perfektere dissektionsteknikken inden udførelse af eksperimenter, der involverer cochleære eksplanteringsstoffer. Hårceller beskadiges almindeligvis under dissekationer, der udføres tidligt i læringskurven, og et særligt problematisk øjeblik for deres integritet er fjernelsen af tectorialmembranen, som kræver stabile hænder, ordentlige værktøjer og erfaring. For at spare tid og ressourcer skal en visuel kontrol udføres under dissektionsmikroskopet, og potentielt beskadigede områder bør noteres. I stedet for at bruge dyre primære og sekundære antistoffer er billigere reagenser som phalloidin mere egnede til foreløbige eksperimenter. Lidt beskadigede eksplantater kan potentielt stadig bruges som kontroller i visse forsøg (analyse af sektioner, der ikke er blevet påvirket) eller til test af nye antistoffombinationer.
Overførsel af prøverne er også særlig vigtig, fordi man skal garantere at stykkerneEr ikke orienteret op og ned ("flydende" hårceller uden vejledning af det overtrukne dækslip ofte degenereret). En central position på dækslet lette alle yderligere pipetteringstrin.
For negative kontrolforsøg, der involverer nye forbindelser (der naturligvis skal være opløselige i dyrkningsmediet), er det vigtigt at anvende det egnede vehikel til eksplantaterne og ikke udelukkende at fokusere på ubehandlede eksplantater. For eksempel, hvis et kommercielt lægemiddel indbefatter natriumcitrat ud over den aktive ingrediens, skal natriumcitrat tilsættes til de negative kontrol-cochleære eksplanteringsstoffer, fordi natriumcitrat selv kan have en virkning.
Begrænsninger til brugen af cochleære eksplanteringsstoffer omfatter det faktum, at disse organotype kulturer typisk er afledt af unge hvalpe, der stadig undergår postnatal udviklingsmæssige ændringer, og at der mangler en iongradient over eksplantanten, hvilket er essentielt for normalHøring in vivo . Protokollens anvendelighed er imidlertid overbevisende vist i en nylig offentliggørelse vedrørende AAV'er 18 . Mens denne gruppe af vektorer er begrænset til ca. 4,7 kb emballagekapacitet, er den blevet en vigtig ressource til behandling af adskillige humane syndromer 26 . Ved anvendelse af cochlear explant-modellen viste ovennævnte publikation, at Anc80-viruset overgik de traditionelle AAV-serotyper i transduktionen af en række cochleære celler, herunder hårceller og SGN'er. Disse in vitro fund blev efterfølgende bekræftet ved at vælge de mest lovende kandidater til injektion gennem runde vinduet hos muspupper in vivo . Ex vivo- modellen giver en måde at succesfuldt rekapitulere cochleas anatomi, hvilket reducerer den tid og de ressourcer, der er nødvendige for at udføre in vivo- arbejde 27 .
En anden fordel ved ex vIvo-modellen er dens potentiale for anvendelse på undersøgelsen af specifikke cellulære mekanismer, der bidrager til SNHL. Ved at anvende forbindelser, der findes i tumormikromiljøet ( f.eks. Humane tumorsekretioner) til et eksplanteringsmiddel, kan effekten af disse forbindelser på cochlea direkte visualiseres og effekten eller toksiciteten af potentielle lægemiddelterapier vurderes. Dette er vigtigt, fordi den humane cochlea ikke kan biopsieres, og cellerne i den kan ikke visualiseres in vivo . For eksempel undersøgte en nylig offentliggørelse det ototoksiske potentiale af proteiner udskilt fra vestibulære schwannomer, som er intrakraniale tumorer, der stammer fra vestibulære nerver og forårsager høretab hos 95% af patienterne. Anvendelse af humane tumorsekretioner til cochleære eksplanterende stoffer sammenlignet med sekreter fra kontrollerede sunde humane nerver bekræftede de toksiske virkninger af disse sekretioner på cochlea 19 . Det samme eksperiment ville være vanskeligt at replikere i en in vivoModel på grund af det immunogene respons mod humane proteiner, der ville opstå i en immunokompetent mus.
Sammenfattende præsenterer dette manuskript en teknik, som muliggør samtidig undersøgelse af cochleære hårceller, synapser, neuritter og neuroner i en ex vivo- model. Denne model kan bidrage til at tilvejebringe indsigt i virkningsmekanismerne af molekyler, der er nye til cochlea 28 , herunder faktorer i humane sekretioner 19 , 20 , medens potentialet accelererer screeningen af kandidat-terapeutiske forbindelser 18 forud for deres test in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dovenhed og andre kommunikationsforstyrrelser tilskud R01DC015824 (KMS) og T32DC00038 (støtte SD), Department of Defense grant W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) og Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Vi takker Jessica E. Sagers, BA for indsigtige bemærkninger til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
