Summary
इस प्रोटोकॉल छवि निवासी ट्यूमर के लिए एक विधि का वर्णन-सीडी टी मानव फेफड़े के ट्यूमर स्लाइस के भीतर फ्लोरोसेंट युग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल कोशिकाओं घुसपैठ । इस तकनीक सीडी टी सेल प्रवास के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग ।
Abstract
सीडी टी सेल कैंसर के खिलाफ लड़ाई में प्रमुख खिलाड़ी हैं । सीडी टी कोशिकाओं के लिए आदेश में ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए वे ट्यूमर में प्रवेश करने की जरूरत है, ट्यूमर microenvironment के भीतर प्रवास और ट्यूमर एंटीजन के लिए पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया. इस तरह के 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में बेहतर इमेजिंग दृष्टिकोण, के हाल के विकास, और शक्तिशाली माउस ट्यूमर मॉडल के उपयोग के कुछ तंत्र है कि विरोधी ट्यूमर टी सेल गतिविधियों को विनियमित पर प्रकाश डाला है । जबकि ऐसी प्रणालियों मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है, वे हमेशा मानव प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी नहीं है । मानव में, क्षेत्र में हमारे ज्ञान मुख्य रूप से मानव रोगियों से फिक्स्ड ट्यूमर के नमूनों का वर्णन से आता है, साथ ही इन विट्रो अध्ययन में । हालांकि, इन विट्रो मॉडल जटिल तीन आयामी ट्यूमर वातावरण कमी है और इसलिए, vivo टी सेल गतिविधियों में के अपूर्ण सन्निकटन हैं । ताजा स्लाइस explanted ऊतक से बने एक जटिल बहु-सेलुलर ट्यूमर वातावरण है कि सह के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में कार्य कर सकते हैं-संस्कृतिपूर्ण अध्ययन और पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । मूलतः murine लिम्फ नोड्स में1 सेट और पहले एक जौव अनुच्छेद2में वर्णित है, इस दृष्टिकोण अब मानव ट्यूमर के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है दोनों की गतिशीलता की जांच के लिए3 के रूप में अच्छी तरह से निवासी टी कोशिकाओं4मढ़वाया ।
यहां, मानव फेफड़ों ट्यूमर स्लाइस की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल, निवासी सीडी टी और ट्यूमर कोशिकाओं के immunostaining, और सीडी टी लिम्फोसाइटों के ट्यूमर microenvironment के भीतर फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है । इस प्रणाली को विशिष्ट उपंयास immunotherapy ट्यूमर में टी सेल प्रवास एहसान एजेंटों के लिए स्क्रीन के लिए रखा है ।
Introduction
सीडी टी कोशिकाओं को कैंसर के खिलाफ लड़ाई में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हालांकि, कई दमन तंत्र घातक कोशिकाओं की हत्या से टी लिम्फोसाइटों को रोकने के । पिछले वर्षों में, कई होनहार रणनीति है कि टी कोशिकाओं पर ब्रेक जारी किया गया है और विकसित क्लिनिक में5। दो दृष्टिकोण है कि काफी ध्यान रखने प्रतिरक्षा चौकी-विरोधी पीडी-1 और दत्तक टी सेल चिकित्सा के रूप में एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण, कर रहे हैं । फिर भी, हाल ही में सफलता के बावजूद, इन उपचारों से6रोगियों का केवल एक सबसेट लाभ । एक प्रमुख चुनौती कैंसर immunotherapy को प्रतिरोध के तंत्र की पहचान के क्रम में और अधिक कुशल उपचार विकसित करने के लिए है । एक और चुनौती के लिए मॉडल प्रणाली है जिसमें उपंयास चिकित्सा विशेषता और उनकी शक्ति और सुरक्षा के लिए परीक्षण किया जा सकता है विकसित करना है । अब तक, इन परख के अधिकांश इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों कि खराब ट्यूमर ऊतक की जटिलता नकल पर आधारित हैं ।
पूर्व vivo ऊतक स्लाइसें एक होनहार तकनीक है, के रूप में यह मूल ऊतक microenvironment7संरक्षित करता है । इन वर्षों में, हम विभिंन ऊतकों में टी लिम्फोसाइटों की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस दृष्टिकोण की स्थापना की है । हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि फ्लोरोसेंट लेबल टी कोशिकाओं murine लिम्फ नोड के ऊपर जोड़ा स्लाइस ऊतक में विस्थापित और उनके उचित microenvironmental cues1,2का जवाब । इसी तरह, टी लिम्फोसाइटों मानव फेफड़े ट्यूमर स्लाइस पर मढ़ा तेजी से ट्यूमर में भर्ती कर रहे है स्ट्रोमा3। इस तकनीक का प्रयोग, हम वितरण और मानव ट्यूमर के भीतर टी कोशिकाओं के प्रवासन3,4को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में extracellular मैट्रिक्स की पहचान की है । क्योंकि पूर्व vivo का व्यवहार शुद्ध और मढ़वाया टी कोशिकाओं जरूरी निवासी intratumoral टी लिम्फोसाइटों के व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करता है, हम हाल ही में इस दृष्टिकोण4परिष्कृत किया है ।
यहां हम ताजा मानव फेफड़ों के ट्यूमर से बने स्लाइस के भीतर निवासी टी लिम्फोसाइटों ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । अलग कदम मानव फेफड़े के ट्यूमर स्लाइस की तैयारी से मिलकर बनता है (agarose embedding और एंबेडेड ऊतक के vibratome अनुभाग सहित), ताजा ट्यूमर स्लाइस में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ अंतर्जात टी कोशिकाओं के दाग, और की निगरानी एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इन कोशिकाओं ।
Protocol
मानव ट्यूमर फ्रांसीसी नैतिक समिति के समझौते के साथ और सहायता Publique-Hôpitaux de पेरिस (एपी-अश्वशक्ति) के साथ आवेदन में फ्रेंच कानून के अनुच्छेद एल 1121-1 के साथ प्राप्त किया गया । अध्ययन में शामिल होने से पूर्व रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई ।
1. मानव फेफड़ों ट्यूमर प्राप्त करने
- चरण I-III गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों से ताजा फेफड़ों के ट्यूमर के नमूने प्राप्त करें जो अपने फेफड़ों के ट्यूमर की एक पूरी शल्य लकीर4से गुजरा ।
- 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में गैर-फिक्स्ड ताजा ट्यूमर परिवहन आइस कोल्ड रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI १६४०) माध्यम से युक्त । २.७ कदम जब तक 30 मिनट के लिए बर्फ पर अलग सेट करें ।
नोट: जब ट्यूमर दोपहर में प्राप्त कर रहे हैं, उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में जगह और अगले दिन की प्रक्रिया. इस मामले में, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ RPMI-१६४० मीडिया का पूरक ।
2. Agarose embedding और मानव फेफड़ों के ट्यूमर की टुकड़ा करने की क्रिया vibratome
नोट: बाँझ शर्तों के तहत २.१० तक सभी चरणों का पालन करें ।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 20 मिलीलीटर बाँझ में 1 जी कम पिघलने बिंदु agarose भंग करके embedding के लिए 5% agarose समाधान तैयार करें । माइक्रोवेव इस घोल को तब तक agarose जब तक कि पूरी तरह घुल न जाए । agarose के लिए 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में समाधान रखकर ३७ डिग्री सेल्सियस पर शांत करने की अनुमति दें ।
- एक ऊतक संस्कृति हुड में, पूरा RPMI-१६४० मध्यम (phenol लाल बिना) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 4 मिमी एल glutamine और 1x पेनिसिलिन और streptomycin युक्त तैयार करते हैं ।
- जोड़ें १.१ एमएल पूरा RPMI-१६४० मध्यम प्रति अच्छी तरह से एक 6-well सेल संस्कृति प्लेट और जगह एक 30 मिमी सेल संस्कृति प्रत्येक कुआं में डालें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली एक तरफ निर्धारित 30 मिनट के लिए २.१२ कदम तक ।
- प्लेस निष्फल स्टेनलेस स्टील फ्लैट वाशर (5 मिमी के भीतरी व्यास, 10 मिमी के व्यास के बाहर और 1 मिमी की मोटाई) एक ३५ मिमी प्लास्टिक RPMI पूरा माध्यम से भरा पकवान में । वाशर आगे vibratome पर एंटीबॉडी-काट टुकड़ा ध्यान इस्तेमाल किया जाएगा ।
- एक 10 सेमी प्लास्टिक डिश में ट्यूमर बायोप्सी प्लेस और लगभग 5x5 mm लंबाई के छोटे घन आकार टुकड़े में एक तेज ब्लेड के साथ ट्यूमर में कटौती ।
- बाहर मशीन से agarose ले लो और एक ३५ मिमी प्लास्टिक डिश में समाधान डालना ।
- संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग करें ध्यान से मध्यम के अतिरिक्त हटाने के लिए एक ऊतक पोंछ करने के लिए ट्यूमर टुकड़े हस्तांतरण । agarose में टुकड़े डालें और उन्हें प्लास्टिक डिश के तल पर स्थिति । 5 मिनट के लिए बर्फ पर agarose जेल को जमना के लिए छोड़ दें ।
- एक बार agarose जम, प्लास्टिक पकवान पलटना और एक रंग का उपयोग करने के लिए पूरे जेल जारी ।
- ट्यूमर टुकड़ा आसपास के अतिरिक्त agarose ट्रिम करने के लिए एक तेज ब्लेड का प्रयोग करें, ऊतक के आसपास जेल के 3-5 mm जा रहा है ।
- vibratome के नमूने डिस्क पर गैर विषैले butyl cyanoacrylate ऊतक गोंद की एक बूंद के साथ प्रत्येक agarose ब्लॉक माउंट । बाँझ बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ vibratome बफर ट्रे भरें और ट्रे में नमूना डिस्क स्थापित करें ।
- ३५० µm मोटी स्लाइस में agarose एंबेडेड ऊतक काट । एक धीमी श्रेणी गति (0.2-0.3 mm/s) और एक मध्यम दूरी पर कंपन आवृत्ति (१.५ mm) पर vibratome सेटिंग्स समायोजित करें ।
- ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान से ट्यूमर स्लाइसें इकट्ठा के रूप में वे काट रहा है और उंहें एक 6 के सेल संस्कृति आवेषण पर फ्लैट जगह अच्छी तरह से प्लेट (२.३ कदम) । प्रत्येक संमिलित पर 1 स्लाइस स्थानांतरित करें । महान देखभाल का प्रयोग करें जब स्लाइस हैंडलिंग के रूप में वे आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है ।
- का प्रयोग करें ठीक संदंश प्रत्येक व्यक्ति के स्लाइस पर स्टेनलेस स्टील वाशर जगह है । सुनिश्चित करें कि वाशर अच्छी तरह से ट्यूमर ऊतक आसपास के agarose पर तैनात कर रहे हैं ।
- ३७ ° c में एक 5% सह2 humidified मशीन में 10 मिनट के लिए संस्कृति प्लेट बनाए रखें immunostaining के लिए आगे बढ़ें ।
3. Immunostaining निवासी सीडी टी कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं के
- एंटीबॉडी पतला (अंतिम एकाग्रता 10 µ g/एमएल) और परमाणु डाई (अंतिम एकाग्रता 1 µ g/एमएल) RPMI-१६४० मीडिया में phenol रेड के बिना ।
नोट: उपयोग फ्लोरोसेंट-युग्म विरोधी सीडी (murine आईजीजी, क्लोन SK1) और विरोधी EpCAM (उपकला कोशिका आसंजन अणु) (murine आईजीजी हेा-१२५) एंटीबॉडी लेबल करने के लिए सीडी टी लिम्फोसाइटों और ट्यूमर उपकला कोशिकाओं, क्रमशः. 5E10 और सक्रिय एंटीबॉडी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट-युग्मित anti-CD90/Thy1 (murine आईजीजी, क्लोन fibroblasts) endothelial का प्रयोग करें । उपयोग 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) एक समझौता प्लाज्मा झिल्ली के साथ कोशिकाओं के नाभिक लेबल के क्रम में ऊतक व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए । - मशीन से संस्कृति प्लेटें निकालें और एक पिपेट का उपयोग करने के लिए स्टेनलेस स्टील वाशर के अंदर किसी भी तरल महाप्राण । १.१ एमएल RPMI-१६४० मीडिया सेल संस्कृति आवेषण (चरण २.३) के तहत रखा निकालें मत करो ।
- स्लाइस को छूने और एक पिपेट टिप का उपयोग कर के बिना, प्रत्येक ट्यूमर टुकड़ा पर एंटीबॉडी युक्त समाधान के ४० µ एल जोड़ें ।
- एंटीबॉडी धुंधला होने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर थाली मशीन ।
- ठीक संदंश के साथ, वाशर निकालें, स्लाइसें बाहर ले, और उंहें RPMI में 10 s डुबकी-१६४० मीडिया phenol लाल बिना । सेल संस्कृति आवेषण पर स्लाइसें वापस प्लेस और प्रत्येक व्यक्तिगत स्लाइस पर phenol लाल मुक्त RPMI-१६४० मध्यम की एक बूंद जोड़ें । 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर थाली बनाए रखने के लिए इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें ।
4. इमेजिंग और मानव फेफड़ों के ट्यूमर स्लाइस के भीतर निवासी सीडी टी सेल प्रवास का विश्लेषण
नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त फोकल माइक्रोस्कोप एक 25x जल विसर्जन उद्देश्य (25x/0.95 एनए) के साथ सुसज्जित एक ईमानदार कताई डिस्क है ।
- माइक्रोस्कोप सेटअप की तैयारी
- इमेजिंग सत्र शुरू करने से पहले ३७ ° c पर माइक्रोस्कोप गर्मी चैंबर के तापमान सेट कुछ घंटे ।
- oxygenated (5% कं2, ९५% हे2) phenol रेड-फ्री RPMI मीडियम (figure 1) के साथ लगातार perfuse ट्यूमर स्लाइस करने के लिए एक सिस्टम सेट करें । छिड़काव मीडिया को इमेजिंग चैंबर में प्रवाहित करने के लिए और एक अपशिष्ट संग्रह कुप्पी का समाधान महाप्राण करने के लिए एक सिकुड़नेवाला पम्प का उपयोग करें ।
- भागो सिकुड़नेवाला पंप oxygenated समाधान छिड़काव ट्यूबों के माध्यम से जाने के लिए अनुमति देने के लिए ।
- ठीक संदंश के साथ, 6-अच्छी तरह से प्लेट से स्लाइस निकाल लें और इसे ३५-mm प्लास्टिक डिश को phenol रेड-फ्री RPMI मीडियम से भरा हुआ ट्रांसफर करें । एक १९.७ मिमी व्यास स्लाइस के साथ टुकड़ा स्थिर 2 मिमी के साथ लंगर टुकड़ा-धागे । माइक्रोस्कोप की इमेजिंग स्टेज पर पेट्री डिश लगाएं । प्रवेश और छिड़काव प्रणाली के आउटलेट युक्तियां कनेक्ट । छिड़काव सिस्टम को चालू करें और मीडिया प्रवाह दर को ०.८ मिलीलीटर/
- पानी-विसर्जन उद्देश्य को कम करने के लिए टुकड़ा । चमकीले क्षेत्र प्रकाश के साथ टुकड़ा के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित ।
नोट: एक स्वस्थ स्लाइस में कटौती की सतह से कई माइक्रोन पर DAPI सकारात्मक कोशिकाओं के केवल एक अल्पसंख्यक शामिल हैं ।
- 3 fluorophores की फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता पर निर्भर करता है, ५० से ८०० एमएस और 20 से ४०% के बीच लेजर तीव्रता के बीच जोखिम समय निर्धारित किया है ।
- ट्यूमर स्लाइस के भीतर छवि के लिए जेड स्टैक मोटाई का चयन करें ।
नोट: यहां z आयाम में 60-70 µm की कुल गहराई में फैले 10-12 ऑप्टिकल विमानों को कैप्चर किया गया । - पहले लेबल सीडी T कक्षों के नीचे लगभग 10 µm पर प्रारंभ स्थिति का चयन करें ।
- 10 से 30 s के बीच प्रत्येक z-स्टैक छवि के बीच समय अंतराल और 10 से 30 मिनट के बीच कुल रिकॉर्डिंग समय निर्धारित करें ।
- एक ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के लिए डेटा आयात करने के बाद, क्षेत्र में प्रत्येक सीडी टी सेल के लिए स्पॉट बनाएं । कोशिकाओं के व्यास और पता लगाने की दहलीज छवि फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के अनुसार समायोजित करें ।
- पटरियों का निरीक्षण करें और उन्हें हटाने के द्वारा किसी भी अप्रासंगिक ट्रैक निकालें । अलग पटरियों और एक ही पटरियों के विभिन्न समय अंक को जोड़ने और डिस्कनेक्ट करके सही पटरियों. निर्यात डेटा (ट्रैक गति, ट्रैक विस्थापन लंबाई) एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए ।
Representative Results
मानव फेफड़ों के ट्यूमर आम तौर पर उच्च सीडी टी कोशिकाओं है कि तरजीही में स्ट्रोमा3,4में पाया जाता है में घुसपैठ कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का पालन करके एक मानव फेफड़ों ट्यूमर स्लाइस में immunostained सीडी टी की एक बड़ी संख्या कल्पना की उंमीद करनी चाहिए । विरोधी EpCAM और विरोधी CD90 एंटीबॉडी के साथ एक सह लेबल चित्रित ट्यूमर टाप और stromal क्षेत्रों के लिए अनुमति चाहिए । Fibrillar कोलेजन, प्रचुर मात्रा में ट्यूमर स्ट्रोमा में, एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप3,4पर दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी का उपयोग करके धुंधला exogenous के बिना visualized किया जा सकता है । ध्यान दें कि कुछ मानव फेफड़ों ट्यूमर ट्यूमर टाप और स्ट्रोमा के बीच कोई स्पष्ट अंतर मौजूद है । इस तरह के ट्यूमर के रूप में अच्छी तरह से खारिज किया जाना चाहिए कोशिका परिगलन एंटीबॉडी और DAPI धुंधला के गैर विशिष्ट बंधन द्वारा पहचान के बड़े क्षेत्रों में पेश । मानव फेफड़े और डिंबग्रंथि कार्सिनोमा में प्राप्त प्रकाशित परिणामों के अनुरूप, निवासी सीडी टी कोशिकाओं ट्यूमर टाप4की तुलना में स्ट्रोमा में अधिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । ट्यूमर कोशिकाओं और CD90 के संबंध में सीडी टी सेल वितरण का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है ।
स्लाइस परख अलग ट्यूमर क्षेत्रों में निवासी टी सेल गतिशीलता के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । विभिन्न क्षेत्रों में सीडी टी सेल गतिशीलता की तुलना के लिए उपयोगी मानदंड (समय अवधि नमूना द्वारा विभाजित पथ लंबाई) और विस्थापन लंबाई (एक ट्रैक की शुरुआत और अंत के बीच वेक्टर) औसत वेग शामिल हैं. हालांकि ट्यूमर टाप में दुर्लभ, सीडी टी कोशिकाओं स्ट्रोमा की तुलना में इस डिब्बे में अधिक सक्रिय रूप से पलायन (चित्रा 3) । औसत पर, व्यक्तिगत सीडी टी कोशिकाओं का मतलब वेग उच्च इंट्रा और अंतर के साथ ट्यूमर स्ट्रोमा में 4 µm/मिनट के करीब होना चाहिए-ट्यूमर variabilities4। ट्यूमर स्ट्रोमा में, निवासी टी कोशिकाओं के गतिशीलता दृढ़ता से घनत्व और extracellular मैट्रिक्स फाइबर के उंमुखीकरण से प्रभावित है3,4। एक सफल प्रयोग कम टी ढीली मैट्रिक्स क्षेत्रों की तुलना में घने मैट्रिक्स क्षेत्र में मौजूद कोशिकाओं में परिणाम, प्रकाशित परिणाम3,4के अनुरूप होगा ।
ध्यान दें कि कुछ मानव फेफड़ों ट्यूमर autofluorescence precluding इमेजिंग के निवासी टी कोशिकाओं के एक बहुत ही उच्च स्तर का प्रदर्शन । इस तरह की सुविधा इमेजिंग सत्र की शुरुआत में तेजी से मनाया जाता है । फ्लोरोसेंट ट्यूमर छोड़ दिया जाना चाहिए । एक फ्लोरोसेंट ट्यूमर में निवासी सीडी टी कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4में दिखाया गया है ।
चित्र 1: छिड़काव प्रणाली के फोटोग्राफ. A) phenol रेड-फ्री RPMI सॉल्यूशन 5% C02, ९५% हे2में समृद्ध है । ख) समाधान तो एक सिकुड़नेवाला पंप द्वारा perfused है । ग) RPMI समाधान प्रवेश के माध्यम से संस्कृति डिश में दर्ज है । आउटलेट पर, समाधान पंप द्वारा चैंबर से एक अपशिष्ट कंटेनर में aspirated है । ध्यान दें कि आकांक्षा टिप एक स्तर पर निर्धारित करने के लिए समाधान ऊंचाई निर्धारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: एक मानव फेफड़ों के ट्यूमर में निवासी सीडी टी कोशिकाओं का वितरण । सीडी (हरा), EpCAM (नीला) और CD90 (लाल) के लिए दाग एक मानव फेफड़े के ट्यूमर टुकड़ा की प्रतिनिधि छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: एक मानव फेफड़े के ट्यूमर में निवासी सीडी टी कोशिकाओं के गतिशीलता । stromal (लाल) और ट्यूमर सेल (ब्लू) एक मानव फेफड़े कार्सिनोमा स्लाइस के क्षेत्रों में व्यक्ति निवासी सीडी टी कोशिकाओं का पथ । टुकड़ा संकेत एंटीबॉडी के साथ दाग और एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ 20 मिनट के लिए छवि थी । fibrillary कोलेजन अंत में एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप पर दूसरी सुरीले पीढ़ी (स्वसहायता) का उपयोग करके पाया गया था । पटरियों रंग सीडी टी सेल विस्थापन की लंबाई के अनुसार कोडित रहे हैं । इस छवि को 4से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: एक फ्लोरोसेंट मानव फेफड़ों के ट्यूमर के प्रतिनिधि छवि । ट्यूमर टुकड़ा सीडी (हरा) और EpCAM (नीला) के लिए दाग था । स्वसहायता संकेत लाल रंग में है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
एक सीधा, त्वरित, और मजबूत तकनीक मानव फेफड़े के ट्यूमर के स्लाइस और निवासी सीडी टी कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का आकलन एक संरक्षित ट्यूमर एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वातावरण में पैदा करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल murine लिम्फ नोड पर मढ़वाया टी कोशिकाओं की निगरानी का वर्णन करता है कि पिछले जौव लेख के एक शोधन है2स्लाइस ।
फ्लोरोसेंट रंजक के ब्लीचिंग विशेष रूप से fluorescein isothiocyanate और phycoerythrin जैसे पहली पीढ़ी के रंगों के साथ विचार किया जाना चाहिए । हमने पाया है कि सीधे-युग्मित एंटीबॉडी के एक स्पष्ट photobleaching एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ हुई । इसके विपरीत, न्यूनतम photobleaching फोकल माइक्रोस्कोप के साथ देखा गया था, विशेष रूप से हाल ही में विकसित चमकदार फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग.
एंटीबॉडी अपेक्षाकृत बड़े अणुओं रहे हैं और इसलिए ऊतक में उनकी पैठ मुश्किल हो सकता है । इस कदम से सुधार किया जा सकता है मशीन समय वृद्धि । इसके अलावा, इस तरह के सीधे-एंटीबॉडी के साथ मिलकर फैब टुकड़े एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में एक छोटे दाग रिएजेंट का उपयोग करें ।
सभी एंटीबॉडी इस प्रोटोकॉल में वर्णित पहले से मांय किया गया है और उज्ज्वल धुंधला4उत्पादन के लिए जाना जाता है । इसलिए, isotype नियंत्रणों की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, अगर इस अंय एंटीबॉडी का उपयोग कर विधि में संशोधन वांछित हैं, तो isotype नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है ।
यह प्रायोगिक प्रणाली कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है । काटने की प्रक्रिया ऊतक, जो विशेष रूप से कटौती की सतह के पास सीडी टी कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है नुकसान होगा । इसके अलावा, घुलनशील कारकों की एक संख्या (जैसे chemokines) टी कोशिकाओं के प्रवास को नियंत्रित करने में सहायक खो दिया जा सकता है । इन समस्याओं को बायपास करने के लिए एक तरह से ऊतक के संभवतः स्वस्थ क्षेत्रों में सतह से माइक्रोन के कई दसियों पर स्थित टी कोशिकाओं की निगरानी कर रहा है. प्रकाशित प्रयोगों से पता चलता है कि ऊतकों के भीतर गहरे स्थानीयकृत टी कोशिकाओं को और अधिक सक्रिय रूप से कट सतह के पास स्थानीयकृत टी कोशिकाओं की तुलना में माइग्रेट4. हम अपने अध्ययन के लिए फोकल सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह संभावना है कि दो फोटॉन माइक्रोस्कोप गहराई में स्थानिक संकल्प में वृद्धि होगी ।
यह दृष्टिकोण तटस्थ अणुओं नहीं कर रहे हैं कि फ्लोरोसेंट युग्मित एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है. पूर्ण आकार के एंटीबॉडी विभिंन तरीकों से टी कोशिकाओं के सामांय कामकाज को प्रभावित करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । सबसे पहले, विरोधी सीडी एंटीबॉडी एक intracellular संकेतन झरना लिम्फोसाइट के cytoskeleton को प्रभावित करने में सक्षम ट्रिगर द्वारा टी सेल प्रवास को बदल सकते हैं । दूसरा, विरोधी सीडी एंटीबॉडी सीडी और MHC वर्ग मैं अणुओं, प्रतिजन मांयता प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम के बीच बातचीत मिलाना कर सकते हैं । तीसरा, बरकरार एंटीबॉडी एफसी कई माइलॉयड ट्यूमर में वितरित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त रिसेप्टर्स को बांध और इसलिए गैर विशिष्ट संकेत बढ़ाने के लिए अतिसंवेदनशील कर सकते हैं । हम कोई संकेत नहीं है कि इस तरह के एक समस्या हमारे डेटा को प्रभावित किया है, शायद क्योंकि निवासी माइलॉयड कोशिकाओं के एफसी रिसेप्टर्स हैं, संस्कृति में कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर वातावरण के भीतर मौजूद इम्युनोग्लोबुलिन के साथ संतृप्त । दरअसल, लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान सीरम के अलावा, एक मुक्त एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए जाना जाता प्रक्रिया, bliss-धुंधला नहीं बदल गया । फिर भी, एंटीबॉडी के फैब टुकड़े, एफसी क्षेत्र से रहित, साथ ही एंटीबॉडी उनके एफसी क्षेत्र और camelid में रूपांतरित-व्युत्पंन एंटीबॉडी टुकड़े8 अंय वैकल्पिक रणनीतियों फ्लोरोसेंट अनुरेखकों के साथ निवासी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं ।
पिछले दशकों में, कई मॉडल सिस्टम विकसित किया गया है और टी लिम्फोसाइटों के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया । इन इन विट्रो में शामिल टी कोशिकाओं को पहले से शुद्ध और प्रतिजन के साथ संस्कृति-पेश कोशिकाओं की तैयारी । इस तरह की तैयारी प्रतिजन मांयता और जवाबदेही के तंत्र को परिभाषित करने में उल्लेखनीय प्रगति की अनुमति दी है । हालांकि, वे ऊतक पर्यावरण की जटिलता की कमी है । अंय की तैयारी की है कि और अधिक बारीकी से एक देशी ऊतक की संरचना की नकल स्थापित किया गया है । उदाहरण के लिए, तीन आयामी कोलेजन जेल मैट्रिक्स जिसमें शुद्ध टी कोशिकाओं को एंबेड किया गया है, साथ ही साथ समेकित ऊतक टुकड़े की संस्कृति के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के साथ टी लिम्फोसाइटों के गतिशील व्यवहार की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है9 . इन प्रणालियों के मूल ऊतक के करीब एक वास्तुकला का लाभ मौजूद है, लेकिन वे अंय महत्वपूर्ण सेलुलर और घुलनशील कारकों की कमी है । माउस में, दो फोटॉन intravital माइक्रोस्कोपी एक बरकरार अंग के सही मायने में शारीरिक वातावरण में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए कार्यरत किया गया है10. हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण को स्थापित करने के लिए तकनीकी रूप से मुश्किल है । इसके अलावा, माउस मॉडल मानव शरीर क्रिया विज्ञान के साथ उल्लेखनीय अंतर दिखाते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक एक जटिल बहु सेलुलर ट्यूमर वातावरण है कि विशिष्ट को सह संस्कृति अध्ययन और पशु मॉडल के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी के रूप में कार्य तैनात है का प्रतिनिधित्व करता है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी सीडी टी लिम्फोसाइटों के लिए जो एंटीबॉडी उत्पंन किया गया है की तुलना में अंय कोशिकाओं के गतिशीलता ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तकनीक अंय मानव और murine ट्यूमर और ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम वास्तविक समय में छवि के लिए सक्षम किया गया है बी कोशिकाओं की गतिशीलता ताजा मानव tonsils में एक विरोधी CD19 एंटीबॉडी के साथ लेबल ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक चिकित्सकीय ऊतकों में टी सेल गतिशीलता को नियंत्रित करने के अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए अनुमति देता है । संस्कृति प्रणाली की पहुंच कुछ औषधीय रिएजेंटों को लागू करने के लिए परमिट और टी सेल माइग्रेशन पर उनके परिणामों का परीक्षण । अब यह स्वीकार किया जाता है कि बढ़ ट्यूमर में, सीडी टी कोशिकाओं एक कम प्रवास प्रदर्शन और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कम संपर्क11. महत्वपूर्ण बात, ट्यूमर कोशिका क्षेत्रों में टी कोशिकाओं की दुर्लभ उपस्थिति एक बुरा परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है और टी सेल के लिए प्रतिरोध तंत्र में से एक माना जाता है कैंसर immunotherapy आधारित है । एकाधिक ट्यूमर में पलायन से टी कोशिकाओं को सीमित बाधाओं एक घने extracellular मैट्रिक्स सहित पहचान की गई है । इस संबंध में, टी सेल गतिशीलता और घातक कोशिकाओं के साथ बातचीत को बहाल करने में सक्षम अणुओं की पहचान कैंसर immunotherapy में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । पिछले एक अध्ययन में, हमने पाया है कि collagenase के साथ कोलेजन का एक आंशिक गिरावट, तीव्रता से मानव फेफड़ों के स्लाइस करने के लिए लागू, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ टी कोशिकाओं के संपर्क में सुधार.
अंत में, कई दिनों तक के लिए संस्कृति में मानव ट्यूमर स्लाइस रखने के लिए संभावना7,12,13 टी कोशिकाओं और immunotherapy के कार्यकाल में होनहार आवेदनों की एक संख्या प्रदान करता है ।हालांकि, दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान मॉडल प्रणाली की स्थिरता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जिसे पूरी तरह से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है ।
ताजा और स्वस्थ ऊतक प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है सीडी कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं के अच्छे immunostaining के साथ गुणवत्ता के स्लाइस का उत्पादन, और stromal तत्वों । प्रसंस्करण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूमर बायोप्सी रखते हुए महत्वपूर्ण है ।
ठीक संदंश के साथ स्लाइस की हैंडलिंग इस प्रोटोकॉल के भीतर एक और महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । यह बड़ी सावधानी के साथ किया जाना चाहिए के रूप में agarose आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । agarose में एक कट स्टेनलेस स्टील एंटीबॉडी समाधान युक्त के रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप वॉशर द्वारा बनाई गई सील समझौता होगा ।
Disclosures
ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।
Acknowledgments
हम सलाह और माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए कोचीन इमेजिंग सुविधा (Institut कोचीन, पेरिस) के पियरे Bourdoncle और थॉमस Guilbert शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । इस काम के हिस्से में फ्रेंच Ligue नेशनल contre le कैंसर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, CARPEM (निजीकृत चिकित्सा के लिए कैंसर अनुसंधान) द्वारा, शौकीनों डी फ्रांस द्वारा और अनुदान के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा ô नो ६६७९८० (कैरेट) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
| Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
| Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
| BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
| FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
| BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |
References
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