Summary
هنا، نحن تصف تقنية لعزل الخلايا السكان الجانب من نموذج الزرد من التي يسببها MYC T خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL). هذا الاختبار السكان الجانب حساس للغاية، ويوصف لالزرد T-ALL، لكنها قد تكون قابلة للتطبيق لأنواع الخلايا الزرد الخبيثة وغير الخبيثة الأخرى.
Abstract
قد تحتوي على السكان الخلايا غير المتجانسة، سواء من أنسجة صحية أو خبيثة، مجموعة من الخلايا التي تتميز القدرة التفاضلية ل إفلوكس الحمض النووي ملزم صبغ هويشت 33342. هذا "الجانب السكان" من الخلايا يمكن تحديدها باستخدام أساليب تدفق سايتوميتريك بعد هويشت 33342 صبغ هو متحمس بواسطة الأشعة فوق البنفسجية (أوف) الليزر. السكان الجانب من العديد من أنواع الخلايا يحتوي على الجذعية أو السلف مثل الخلايا. ومع ذلك، ليس كل أنواع الخلايا لديها عدد سكان يمكن التعرف عليها. دانيو ريريو ، الزرد، لديها قوية في نموذج الجسم الحي من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل)، ولكن ما إذا كانت هذه الزرد T-ألز لديها سكان الجانب غير معروف. الطريقة الموصوفة هنا الخطوط العريضة لكيفية عزل الخلايا السكانية الجانبية في الزرد T-آل. للبدء، يتم إنشاء T-آل في الزرد عن طريق ميكروينجكتيون من البلازميدات tol2 في الأجنة مرحلة واحدة الخلية. مرة واحدة وقد نمت الأورام إلى مرحلة التي تتوسع في أكثر من نصف العانيجسم مال، يمكن حصاد الخلايا T-آل. ثم تلطخ الخلايا مع هويشت 33342 وفحصها عن طريق التدفق الخلوي للخلايا السكان الجانبية. هذه الطريقة لديها تطبيقات واسعة في الزرد T- جميع البحوث. في حين لا توجد علامات سطح الخلية المعروفة في الزرد التي تؤكد ما إذا كانت هذه الخلايا السكانية الجانبية هي سرطان الخلايا الجذعية مثل، في الجسم الحي فحوصات زرع وظيفية ممكنة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق ترانسكريبتوميكس خلية واحدة لتحديد السمات الوراثية لهذه الخلايا السكانية الجانبية.
Introduction
المقياس السكاني الجانب يستفيد من تعزيز قدرة خلايا معينة داخل الأنسجة ل إفلوكس الحمض النووي ملزمة صبغ هويشت 33342 بسبب مستويات عالية من البروتين أتب ملزمة (أبك) البروتينات الناقل على غشاء الخلية. الخلايا التي تفرغ صبغ هويشت 33342 يمكن تحديدها باستخدام تحليل الطول الموجي المزدوج تحليل سايتوميتريك بعد صبغ متحمس بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. وقد استخدم هذا الفحص لأول مرة لتحديد الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران (هسس) 1 ، ولكنها استخدمت منذ ذلك الحين لتحديد السكان الخلايا الجذعية / السلف في العديد من الأنسجة والسرطانات (استعرض في المرجع 2). ومع ذلك، ليس كل السكان من الخلايا لديها سكان الجانب، وليس إثراء جميع السكان الجانب للخلايا الجذعية / السلف.
الزرد هو نظام نموذج وراثي الفقاريات قوية لدراسة السرطان البشري 3 ، 4 ، مع عدد من المزايا على مو التقليدية الفئرانديلس، بسبب، برج السرطان. وتخصيب الأجنة الزرد خارجيا وهي واضحة بصريا، وتسهيل ترانزجينيسيس والمراقبة في الجسم الحي من العمليات المرضية، بما في ذلك بدء السرطان والتقدم. وحتى الآن، وقد تم تطبيق فحص السكان الجانب للكشف عن الجذعية المحتملة أو الخلايا السلف فقط إلى نخاع الكلى في الزرد لتحديد هسس، وليس إلى أي نماذج السرطان الزرد 5 ، 6 .
نموذج الزرد من الخلايا التائية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-آل) هو شكليا وراثيا مماثلة للإنسان T-آل 7 ، 8 ، 11 . T-آل هو خبيثة عدوانية التي، في البشر، تمثل 10-15٪ من الأطفال و 25٪ من البالغين جميع الحالات 9 . في حين أن علاج T-آل قد تحسنت، والانتكاس لا يزال شائعا ويرتبط مع سوء التشخيص. الأورام T-آل هي غير متجانسةأوس وتحتوي على العديد من المجموعات السكانية الفرعية للورم مختلفة، بما في ذلك خلايا بدء سرطان الدم (ليس). وتعرف المركبات الليفية الليفية عن طريق قدرتها على إعادة نمو الورم بأكمله من خلية واحدة، ويمكن حساب تواتر الخلايا الليفية داخل خلايا الخلايا السرطانية عن طريق زرع جرعات خلايا متفاوتة إلى مستلمين عن طريق مقايسة زرع التخفيف المحدود (لدا). في حين أجريت تجارب لدا في الزرد لحساب وتيرة الليكود 8 ، 10 ، 11 ، ويتم هذا التحديد في وقت متأخر ولا يسمح لعزلة المحتملين من البلدان المنخفضة الدخل. لذلك، هناك طريقة لعزل مستقبلي للسكان المخصب لنشاط الخلايا الجذعية السرطانية غير موجودة. تحديد وعزل الخلايا السكانية الجانبية من الزرد T-ألز هو الخطوة الأولى نحو معالجة هذا النقص.
بروتوكول المعروضة هنا يصف كيفية توليد بكفاءة T- آل أورام في زبرأفيش باستخدام ترانسجينيسيس tol2 بوساطة، وحصاد خلايا الأورام T-آل، وصمة عار لهم مع هويشت 33342 لتحديد الجانب السكان من الخلايا. المستقبل في التجارب المجراة مع الزرد T-آل يمكن أن تشمل ما إذا كان يتم إثراء الخلايا السكانية الجانبية لل ليكس أو يكون لها خصائص أخرى الجذعية أو السلف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات مع الزرد من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة شيكاغو. وقد تم اعتماد جامعة شيكاغو من قبل جمعية لتقييم واعتماد رعاية الحيوان المختبرية (آلاك).
1. توليد وعزل فلورزنتلي المسمى T- جميع الخلايا في الزرد
- حقن ميكروينجكتيون في الأجنة الزرد متجانسة
- باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا، عزل Rag2 دائري: ج- ميك و rag2 : البروتين الفلوري الأخضر ( rag2 : غفب) الحمض النووي البلازميد التي تحتوي على تكرار محطة مقلوب يعترف بها tol2 ترانسبوساز (انظر جدول المواد لمصدر الحمض النووي البلازميد) 12 وأزل الحمض النووي في الماء المعقم.
ملاحظة: يستخدم غفب في هذه الدراسة، ولكن أي بروتين الفلورسنت العمل. - إعداد pcs2-ترانزبوسيس (tol2) الحمض النووي الريبي
- عزل الحمض النووي البلازميد tol2 باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا (انظر رانه جدول المواد للمصدر DNA البلازميد) 12 وأزل الحمض النووي في الماء المعقم.
- احتضان 1 ميكروغرام من الحمض النووي tol2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع 5 وحدات من انزيم التقييد نوتي في المنطقة العازلة المناسبة لخطي البلازميد. للحرارة إبطال نشاط نوتي عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- نسخ الحمض النووي الريبي tol2 مع البلمرة SP6 RNA من DNA خطي باستخدام المتاحة تجاريا عدة RNA النسخ 13. تخزين الحمض النووي الريبي في أجزاء مأخوذة تستخدم مرة واحدة في -80 ° C.
- تحضير مزيج الحقن على الجليد بإضافة 250 نانوغرام من rag2: ج myc DNA البلازميد، 250 نانوغرام من rag2: GFP DNA البلازميد، 150 نانوغرام من الحمض النووي الريبي tol2، و 0.5 ميكرولتر من الفينول الأحمر. ضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه.
- حقن ~ 1 NL من مزيج الحقن في الخلية من مرحلة واحدة الخلية الجنين الزرد مسانج باستخدام microinjector وإبرة سحبها من أنبوب زجاجي الشعرية، في أعقاب سابقا إنشطرق الأساليب 8 ، 14 .
ملاحظة: يتم استخدام الزرد سينجينيك التي تنتجها التوالد 15 هنا للقضاء على التغايرية الوراثية ورفض المناعة بعد زرع. ومع ذلك، يمكن استخدام الزرد ويلديب أو أي سلالة المطلوب. - إزالة الأجنة ميتة، متخلفة، أو مشوه في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الحقن 16 .
- وضع الأسماك حقن على نظام الأسماك في 6 أيام بعد الحقن ورفعها وفقا لبروتوكول قياسي 6 .
- باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا، عزل Rag2 دائري: ج- ميك و rag2 : البروتين الفلوري الأخضر ( rag2 : غفب) الحمض النووي البلازميد التي تحتوي على تكرار محطة مقلوب يعترف بها tol2 ترانسبوساز (انظر جدول المواد لمصدر الحمض النووي البلازميد) 12 وأزل الحمض النووي في الماء المعقم.
- فحص حقن الزرد ورصد نمو الورم
- في 21 يوما بعد الحقن، ووضع يرقات حقن واحد في قطيرة من الجنين المتوسطة على طبق بتري وشاشة لمضان غفب باستخدام المجهر إبيفلورزنت (ممر الإثارة: 470/40، ممر الموجة الانبعاث: 525/50) 8 .
ملاحظة: اليرقات الزرد أن hأفي متكاملة على حد سواء rag2 : ج- ميك و rag2 : سوف غفب لديها الغدة الصعترية الفلورسنت الأخضر (الأسماك الإيجابية) وربما تعرض بالفعل توسع الخلايا الفلورية الخضراء الخبيثة وراء الغدة الصعترية. جميع الأسماك مع غفب + الغدة الصعترية سوف تستمر في تطوير غفب + T-آل. اليرقات التي لا تظهر تكامل البلازميدات لن يكون أي الخلايا الفلورية الخضراء (الأسماك السلبية). - فصل الأسماك السلبية (على أساس عدم وجود مضان) في خزان مختلفة ومراقبة الأسماك مرة أخرى في 28 و 35 يوما بعد الحقن. في 28 و 35 يوما بعد الحقن، تخدير الأسماك مع 0.02٪ تريكين مخزنة (مس-222) في المياه نظام السمك قبل الفحص.
- وضع كل يرقات الزرد التي هي إيجابية لفلورسنتلي المسمى الغدة الصعترية أو ورم فلورزنتلي المسمى في خزان الفردية لرصد نمو الورم ثلاث مرات في الأسبوع.
- في 21 يوما بعد الحقن، ووضع يرقات حقن واحد في قطيرة من الجنين المتوسطة على طبق بتري وشاشة لمضان غفب باستخدام المجهر إبيفلورزنت (ممر الإثارة: 470/40، ممر الموجة الانبعاث: 525/50) 8 .
- مجموعة من الخلايا تي-آل فلورزنتلي المسمى من الأسماك الورم الأولية
- إعداد ما لا يقل عن 20 مل من 10٪ المصل الحرارة المعطل الجنين البقري في 0.9x الفوسفات مخزنة المالحة (فبس / بس).
- إضافة 1 مل من فبس / بس إلى قارورة واحدة من الملح الهيبارين الصوديوم (300 وحدة).
- حدد الأسماك التي تحمل الأورام في أكثر من 50٪ من الجسم، أو تلك الأسماك التي تواجه صعوبة في تناول الطعام أو السباحة. التضحية الأسماك عن طريق جرعة زائدة مع تريكين أو عن طريق الغمر بالماء الجليد. تأكيد الموت من خلال عدم وجود حركة الخيشوم ونبض القلب.
- استخدم شفرة حلاقة لإزالة رأس السمك.
- غسل تجويف الأسماك مع الحل الهيبارين لإزالة خلايا الدم الحمراء الزائدة.
- باستخدام ماصة، وحقن 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين (أعدت في الخطوة 1.3.2) في تجويف الجسم من الأسماك. إزالة كل السائل الذي يتسرب (وسوف تحتوي على خلايا الدم) وماصة في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
- استخدام طرف ماصة جديدة لغسل الجسم مرة أخرى. أداء ما لا يقل عن ثلاثة يغسل، أو حتى السائل الذي يتسرب خارج يبدو خالية من بلالعود.
- تجاهل كل السائل من يغسل في الخطوات 1.3.5.1 و 1.3.5.2، كما أنها لن تستخدم في مزيد من التحليلات.
- جمع خلايا سرطان الدم.
- حقن 100 ميكرولتر من فبس / بس في تجويف الجسم من الأسماك.
- تطبيق ضغط لطيف على الجزء الخارجي من الجسم من الأسماك مع طرف ماصة للضغط / دفع خارج الخلايا السرطانية.
ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه الخطوة باستخدام المجهر تشريح، فإن الخلايا السرطانية يتسرب من تجويف الجسم يكون واضحا. - جمع السائل والخلايا من كل غسل في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
- كرر الخطوات 1.3.6.1-1.3.6.3 حتى يتم جمع معظم الخلايا السرطانية (عادة 5-10 مرات). جمع كل الخلايا السرطانية في نفس أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
- مزيج الخلايا السرطانية التي تم جمعها من الخطوة 1.3.6 من قبل بيبتينغ بلطف لهم لفصل كتل من الخلايا. تصفية تعليق الخلية من خلال 40 ميكرون فلتر شبكة. غسل فلتر 1-2 مرات مع 100 ميكرولتر من فبس / بس. الحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
- مزيج 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 18 ميكرولتر من تريبان الأزرق (0.4٪، المخفف 01:10 وتصفيتها) في أنبوب جديد. تحميل 10 ميكرولتر على عدادة الكريات وعدد عدد الحية (غير الزرقاء) خلايا الفلورسنت لحساب عدد الخلايا السرطانية المعزولة.
ملاحظة: غير الزرقاء الخلايا السلبية غفب من المرجح الطبيعي، والخلايا T غير الخبيثة ويجب ألا تحسب. مطلوب على الأقل 2 × 10 6 خلايا لصمة عار الخلايا مع هويشت 33342.
2. تلطيخ فلوريسنتلي المسمى T- جميع الخلايا مع هويشت 33342 لتحديد الجانب السكان
- تمييع هوشست 33342 1:10 مع نوكليس خالية H 2 O لجعل تركيز العمل 1 ملغ / مل. تخزين الصبغة في 4 درجات مئوية وفي الظلام.
- إعداد حل 100 ملم من فيراباميل عن طريق إذابة 49.1 ملغ في 1 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (دمسو).
ملاحظة: فيراباميل هو المانع من النقل ABC وهو عنصر تحكم الهامة للتجارب السكان الجانب. مضيفا فيراباميل لعينات تحول دون قدرة النقل ABC إلى هروب رأس المال الصبغة هويشت 33342. لذلك، سوف تختفي يبلغ عدد سكانها الجانب الصحيح عند إضافة فيراباميل للعينة. - تعيين حمام مائي إلى 28 ° C.
- إعداد العينات والتحكم في الظلام بإضافة الخلايا وحلول لمضان تنشيط خلية فارز (FACS) الأنابيب.
- إعداد العينات من خلال إضافة 10 6 خلايا، و 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل هويشت 33342، و 2.5 ميكرولتر من DMSO لأنبوب FACS. ضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع FBS / PBS.
- إعداد الضوابط وذلك بإضافة 10 6 خلايا، و 15 ميكرولتر من 1 ملغ / مل هويشت 33342، و 2.5 ميكرولتر من 100 ملي فيراباميل لأنبوب FACS. ضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع FBS / PBS.
ملاحظة: ما لا يقل عن 10 6 خلايا / يوصى عينة، ولكن تلطيخ المزيد من الخلايا وفضل، وخاصة إذا كان الجانب populatسيتم فرز الخلايا الأيونية لمزيد من التحليل. لا تتجاوز 10 6 خلايا / مل، والحفاظ على تركيز هويشت 33342 في 15 ميكروغرام / مل. إذا كانت ملطخة 10 × 10 6 خلايا، وحجم التفاعل الكلي هو 10 مل.
- احتضان في حمام مائي 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 120 دقيقة.
- بعد الحضانة، ووضع الخلايا على الفور على الجليد والاحتفاظ بها في الظلام.
- بيليه الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف. يغسل مع 1 مل من فبس / بس.
- بيليه الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من فبس / بس.
- إبقاء في 4 درجات مئوية حتى الفرز الخلية.
- 15 دقيقة قبل الفرز الخلية، إضافة 2 ميكرولتر من يوديد بروبيديوم (بي) الأسهم (1 ملغ / مل) إلى كل 1 مل من فبس / بس (تركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل). اخلط جيدا.
3. استخدام فاكس لإيجاد السكان الجانب داخل فلوريسنتلي المسمى T-آل السكان الخلية
- تحديد بوابة للعيش، غفب + T-آل الخلايا.
- استخدام مبعثر إلى الأمام (فسك) ومنطقة الجانب مبعثر (سك) لخروج الحطام.
ملاحظة: يستخدم فسك للتمييز بين حجم الخلية ويستخدم سك للتمييز بين تحبب الخلية. - استخدام فسك وعرض سك لتمييز دوبلتس.
ملاحظة: هناك ثلاثة مكونات التي حددتها أجهزة الكشف عن التدفق الخلوي: المنطقة، الطول، والعرض. منطقة عادة ما تستخدم لقياس مضان الخلية. ويقيس العرض زمن الرحلة، ويضاعف عرضه مرتين إذا تم تجميع خليتين معا. - للخلايا السرطانية الحية، رسم بوابة حول الخلايا إيجابية ل غفب والسلبية ل بي باستخدام كاشفات مناسبة (على سبيل المثال ، فيتس ل غفب و بيركب Cy5-5 ل بي).
- استخدام مبعثر إلى الأمام (فسك) ومنطقة الجانب مبعثر (سك) لخروج الحطام.
- إذا فرز الخلايا السكان الجانب لمزيد من التجارب، استخدم طرف فوهة كبيرة (100 ميكرون)، وجمع الخلايا في أنبوب FACS تحتوي على 3 مل من 100٪ FBS. استخدام تلميح أكبر فوهة (100 ميكرون) بدلا من غيض أصغر (70 ميكرون) لتحسين بقاء الخلية بعد الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوليد بكفاءة الفلورسنت الفطرية التي يسببها T- آل الأورام في الزرد، يبني دنا دائرية يحيط بها tol2 مواقع ترانسبوساز يمكن أن يكون شارك في حقن مع tol2 الحمض النووي الريبي. الدراسات السابقة من حقن الحمض النووي الخطي في الأجنة الزرد تقرير معدل ترانزجينيسيس 5٪ 8 . مع بروتوكول تعديلها لتشمل ترانسجينيسيس tol2 بوساطة، معدلات ترانزجينيسيس تتراوح بين 10-44٪ يمكن ملاحظتها ( الجدول 1 ).
في المثال ممثل، وقد ملطخة سمكة مع غفب + T-آل مع هويشت 33342 لتحديد النسبة المئوية للخلايا في الجانب السكان. ويبين الشكل 1 مخطط التباعد المستخدمة لتحديد النسبة المئوية للخلايا السكانية الجانبية. أولا، وذلك باستخدام فسك و سك، يتم عزل الخلايا T-آل من خلال استبعاد الحطام ( الشكل 1A ) واختيار في وقت لاحق ضد دوبلتس ( الشكل 1B ). المقبل، يتم عزل جميع الخلايا الحية عن طريق الخلايا التي ينحدر منها غفب + والسلبية للميتة ميتة الخلية بي ( الشكل 1C ). مرة واحدة يتم اختيار واحدة، وتعيش خلايا T-آل، يمكن العثور على السكان الجانب في الملف الشخصي هويتش 33342. في الخلية الرئيسية السكان، هويشت 33342 لا يزال في الخلايا، وهذه الخلايا يمكن فصلها إلى مجموعات من محتوى الحمض النووي. ومع ذلك، فإن السكان الجانب من الخلايا يمكن تمييزها عن السكان الخلية الرئيسية، كما خلايا السكان الجانب يفرغ الصبغة بسبب ارتفاع أعداد الناقلين أبك على غشاء الخلية. لتصور السكان الجانب، ويستخدم الملف الشخصي هويشت لمقارنة قناتين، هويشت الأزرق وهويشت الأحمر. السكان الجانب هو ذيل خافت من الخلايا تمتد من الجانب الأيسر من السكان الخلية الرئيسية نحو المحور الأزرق هويشت ( الشكل 1D ).
سيتم فقدان السكان الجانب الحقيقي عندما يتم التعامل مع الخلايا مع مثبط oو أبك الناقلين، مثل فيراباميل. ويبين الشكل 2 السكان الجانب في العديد من الأورام ممثل T-آل، وكذلك عندما يتم التعامل مع تلك الأورام مع فيراباميل خلال تلطيخ مع هويشت 33342. للتأكد من أن السكان وجدت في العينة هو السكان الجانب الحقيقي، يجب أن تختفي هذه الخلايا في وجود المانع، كما هو مبين في الشكل 2 .
| عدد الأسهم | عدد الأسماك مفروز | عدد إيجابي | معدل ترانزجينيسيس |
| 930 | 21 | 3 | 14.3٪ |
| 934 | 12 | 4 | 33.3٪ |
| 950 | 12 | 5 | 41.7٪ |
| 951 | 19 | 3 | 15.8٪ |
| 960 | 3 </ td> | 1 | 33.3٪ |
| 983 | 9 | 4 | 44.4٪ |
| 1004 | 30 | 3 | 10.0٪ |
| 1013 | 4 | 1 | 25.0٪ |
| 1025 | 35 | 5 | 14.3٪ |
| 1029 | 10 | 2 | 20.0٪ |
| 1065 | 5 | 1 | 20.0٪ |
| 1070 | 6 | 1 | 16.7٪ |
| 1073 | 19 | 8 | 42.1٪ |
| 1079 | 8 | 1 | 12.5٪ |
| 1105 | 38 | 7 | 18.4٪ |
| 1193 | 30 | 8 | 26.7٪ |
| 1215 | 9 | 1 | 11.1٪ |
| 1229 | 10 | 2 | 20.0٪ |
| 1314 | 6 | 1 | 16.7٪ |
الجدول 1: معدلات ترانزجينيسيس عند استخدام tol2 ترانسبوسيز ل ميكروينجكتيون البلازميد في الأجنة الزرد. وتظهر معدلات محسوبة ترانزجينيسيس لمدة تسعة عشر أيام حقن منفصلة. يمثل عدد الأسماك التي تم فرزها عدد الأسماك التي بقيت على قيد الحياة بعد 21 يوما من الحقن، وعدد إيجابي يمثل عدد الأسماك التي كانت إيجابية لأورام الفلورسنت.
الشكل 1: مخطط ترحيل السكان الجانبي. مثال على مخطط المباعدة المستخدمة لتحديد السكان الجانب في غفب + T-آل في الزرد. ( A ) أولا، يستبعد الحطام باستعمال الانتثار الأمامي (فسك) والجانب مبعثر (SSC) المنطقة. (B) المقبل، يتم عزل الخلايا واحد من خلال التمييز ضد الحلل باستخدام FSC والمعلمات عرض المؤسسة. (C) ولما كان هذا المثال الورم GFP +، يجب أن تكون جميع الخلايا الحية GFP + والسلبية للخلية علامة الميتة التأيد Propidium. (D) عدد السكان الجانب ويمكن رؤية مع هويشت الأحمر مقابل الشخصي هويشت الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يختفي جانب السكان عندما تعامل مع ABC الناقل المانع، فيراباميل. وترد بوابات للسكان الجانب. وتظهر لوحات أعلى أربع عينات الأورام المختلفة. ومن المهم أن نلاحظ أنه ليست كل الأورام لديهم نفس نسبة السكان الجانب، وكاليفورنيا سكان الجانبن تبدو مختلفة لكل ورم اختبار. وتظهر لوحات أسفل عينات الأورام التي كانت تعامل مع فيراباميل خلال تلطيخ مع هويشت 33342 لمنع صبغ هروب رأس المال. في حين أن السكان الجانب قد تبدو مختلفة لكل الورم، وتأثير فيراباميل هو نفسه: يختفي السكان الجانب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فحص السكان الجانب حساس للغاية. وبالتالي، يمكن التغييرات الطفيفة على البروتوكول يؤدي إلى صعوبة في الكشف عن خلايا سكان الجانب. أولا، ودرجة الحرارة خلال تلطيخ خطوة هي خاصة بكل نظام الحيوانية / الخلية. لأنظمة الثدييات، يتم إجراء فحص سكان الجانب عادة عند 37 درجة مئوية 2. عندما حضنت الزرد T-ALL الخلايا عند 37 درجة مئوية، وكثير من الخلايا مات، مما يجعل درجة الحرارة هذه الحضانة غير مقبولة (لا تظهر البيانات). عندما تشريح كوباياشي وزملاؤه (2008) نخاع الكلى الزرد لفحص السكان الجانب، نفذت حضانات بها في 25 ° C 5. كانت درجة الحرارة هذه الحضانة ليست كافية لالزرد T-ALL الخلايا، كما أنه أدى إلى ضعف هويشت 33342 الملف (لا تظهر البيانات). في بروتوكول الموصوفة هنا، كانت درجة حرارة الحضانة من 28 ° C المثلى للحفاظ على بقاء الخلية وتحقيق قوي هويشت 33342 الشخصي.
الشرط الثاني للمقايسة السكان الجانب الذي يتطلب دراسة واختبار مسبق لتركيز هويشت 33342. إذا كان تركيز هويشت 33342 منخفض جدا، فإن عدد سكان الجانب قد لا تكون مرئية، أو النمط الظاهري السكان الجانب (صبغ القدرة هروب رأس المال) قد يمكن زيادة زورا، وتحديد الخلايا السكان أكثر جانبية من هي في الواقع الحاضر 2. من ناحية أخرى، مرتفعة جدا من تركيز هويشت 33342 يمكن أن تكون سامة للخلايا. لT-ALL الزرد الخلايا، 15 ميكروغرام / مل هويشت 33342 المحتضنة لمدة 120 دقيقة هو مزيج الأمثل. وحوكم تركيزات أقل من هويشت 33342 لT-ALL الزرد الخلايا، ولكن كان عدد السكان الجانب ليس دائما واضحا (لا تظهر البيانات). وكان من فترة حضانة الكلي لل90 دقيقة كافية للكشف عن سكان الجانب، ولكن كان ينظر إلى العدد الأقصى من الخلايا السكان الجانبية بعد 120 دقيقة من الوقت الحضانة.
كما ذكرت سابقا عن الصورة الثدييات يستيمز، وليس كل الورم سيكون لها سكان الجانب كشفها 17 ، 18 ، 19 . باستخدام هذه الطريقة، لاحظنا سكان الجانب في 14 من 17 T-ألز اختبار (لا تظهر البيانات). بعد عزل الخلايا السكانية الجانبية من T-ألز، ومن المتوقع أن تكون قابلة للتطبيق على نماذج الورم الزرد الأخرى هذه الطريقة.
داخل الزرد غير متجانسة T-آل الورم، وخلايا سرطان الدم بدء الخلايا (ليس) قادرة على إعادة نمو الورم، وعلى هذا النحو يعتقد أنها مسؤولة عن تكرار السرطان والانبثاث. حاليا، لا توجد طريقة في الزرد الذي يسمح لعزل المحتملين من الكائنات الحية المحورة في الجسم الحي . حساب تردد ليك يتطلب زرع الخلايا السرطانية في التخفيف الحد 8 ، 10 . وقد نشرت الدراسات التي نشرت سابقا مع الزرد نسيلي أن الليكوس تشكل 0.1-1.4٪ من الخلايا الأولية T-آل"كريف"> 10. هنا، يتم الإبلاغ عن التباين مماثل في وتيرة الخلايا السكانية الجانبية (0.2-1.0٪) من الزرد نسلي T-ألز ( الشكل 2 ). وهناك حاجة إلى مزيد من التجارب لتحديد ما إذا كان السكان الجانبيون يثريون في البلدان المنخفضة الدخل؛ ومع ذلك، فإن التشابه بين نطاقات تردد ليك ونسبة الخلايا السكانية الجانبية في هذه T-ألز تدعم هذه الفرضية.
في حين أن فحص السكان الجانب حساس وليس من السهل دائما لأداء، وفحص يسمح للباحثين، لأول مرة، لعزل السكان النادرين من الخلايا في الزرد T-آل التي قد يكون لها خصائص الخلايا الجذعية أو السلف. لا توجد حاليا علامات سطح الخلية المتاحة في الزرد لتحديد الخلايا الجذعية أو السلف مثل؛ وبالتالي، فإن القدرة على عزل السكان الجانب واعدة جدا. التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة تشمل الحد من التجارب زرع التخفيف من فرزها الجانب السكان T-آل الخلايا لتقييم إثراء Lالمرحلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الطريقة تسمح الخصائص التي تحدد البلدان المنخفضة الدخل ليتم توضيحها، بما في ذلك الآليات الجزيئية التي تحكم البلدان المنخفضة الدخل في الزرد T-آل. هذه التجارب يمكن أن توفر نقطة انطلاق لاكتشاف أهداف علاجية جديدة ل T-آل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جامعة مجلس شيكاغو للمرأة، وصندوق ويندي الحالة سوف، وجامعة شيكاغو الشامل للسرطان مركز دعم جرانت (P30 CA014599). ونود أن نشكر التدفق الخلوي الأساسية في جامعة شيكاغو لمساعدتهم في تأسيس هذه التجربة، وكذلك الأعضاء الآخرين في مختبر دي يونج، ولا سيما ليزلي بيدرازا وسين مكونل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
