Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en cultiveren van metanefrische rudimenten uit muisembryo's.
Abstract
Het doel van dit protocol is om een methode te beschrijven voor de dissectie, isolatie en cultuur van muismetanefrische rudimenten.
Tijdens de ontwikkeling van zoogdierontwikkeling, communiceren de twee voorvaderweefsels, de ureterische knop en het metanefrische mesenchym, cellulaire mechanismen en vormen zij uiteindelijk het verzamelstelsel en de nefronen van de nier. Aangezien de embryo's van de zoogdier intracuterine groeien en derhalve ontoegankelijk zijn voor de waarnemer, is er een orgelcultuur ontwikkeld. Met deze methode is het mogelijk om epitheliale mesenchymale interacties en cellulaire gedragingen tijdens nierorganogenese te bestuderen. Bovendien kan de oorsprong van aangeboren nier- en urogenitale tract misvormingen worden onderzocht. Na zorgvuldige dissectie worden de metanefrische rudimenten overgebracht op een filter dat op cultuurmedium drijft en gedurende enkele dagen in een celcultuur-incubator kan worden gehouden. Men moet echter bewust zijn dat de voorwaarden zijnKunstmatig en kan het metabolisme in het weefsel beïnvloeden. Ook kan de penetratie van teststoffen beperkt worden door de extracellulaire matrix en het basale membraan aanwezig in de explant.
Een belangrijk voordeel van orgelcultuur is dat de experimentator direct toegang tot het orgaan kan krijgen. Deze technologie is goedkoop, eenvoudig en maakt een groot aantal wijzigingen mogelijk, zoals de toevoeging van biologisch actieve stoffen, de studie van genetische varianten en de toepassing van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
Protocol
Muizen werden gehandhaafd volgens de Zweedse regelgeving en de wetgeving van de Europese Unie (2010/63 / EU). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Zweedse Etiekkomitee (vergunningen C79 / 9, C248 / 11 en C135 / 14). Procedures bij de Universiteit van Heidelberg met betrekking tot diergeneeskunde zijn goedgekeurd door het Regierungspräsidium Karlsruhe en de dierenwelzijnsambtenaren aan de Universiteit van Heidelberg.
1. Bereiding van reagentia en materialen voor cultuur
OPMERKING: Gebruik een laminaire afzuigkap om de vervuiling te minimaliseren.
- Op de dag van dissectie wordt pre-cluster menselijk Fc alleen of recombinant chimere ephrin eiwit gefuseerd aan humaan Fc door het te mengen met anti-humane Fc geit antilichamen bij een molverhouding van 1: 5 in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C 5 .
- Bereid het kweekmedium door Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient aan te vullenMengsel F-12 (DMEM / F12) met 1% penicilline / streptomycine (v / v), 1% glutamine (v / v), 1% insuline transferrin selenium (v / v), 50 μg / ml humaan holo- Transferrine en 1,5 μg / ml amphotericine.
OPMERKING: 10 ml medium is voldoende voor 16 embryo's. - Voeg clusterde recombinant ephrinoplossing toe bij een uiteindelijke concentratie van 20 μg / ml aan het kweekmedium. Gebruik geclusterde menselijke Fc als controle.
- Bereid kweekplaten door 500 μl kweekmedium toe te voegen aan elke putje van een steriele, niet-beklede, platte bodem polystyreen 4-putjesplaat.
- Met behulp van steriele tang, plaats een polycarbonaat membraanfilter met een poriegrootte van 5 μm per putje bovenop het medium. Breng de voorbereide plaat over naar de incubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Zorg ervoor dat het filter droog blijft op het bovenvlak en drijft.
OPMERKING: Eén filter is voldoende voor twee nieranlagen. - Gebruik een scheermesje, snijd ongeveer 30 pipetjes (volume: 100 μL) bij benaderingY 1 mm van de punt om een bredere opening te geven. Plaats de tips terug in een pipetstickrek.
2. Dissectie van Metanephric Rudiments in E11.5
- Een timed-zwangere muis op E11.5 door cervicale dislocatie opofferen (of gebruik maken van een methode die is goedgekeurd door de lokale ethische commissie).
- Verwijder de baarmoeder en de embryo's, zoals beschreven door Brown et al. 6 . Vanaf dit punt naar voren, werk onder een dissectiemicroscoop.
- Snijd het embryo direct onder de voorbenen met behulp van nr. 5 horlogemaker. Gebruik een vers petri dish voor elk embryo. Verwijder de benen en de staart van het embryo. Om dit te doen, grijp het weefsel met een paar nr. 5 horlogemakerpincetjes en gebruik de tips van een tweede paar om te snijden.
- Om de ventrale organenmassa te verwijderen, gebruik de tips van een paar tang om lateraal de lichaamswand van het embryo in een rostral-naar-caudale richting te openen.
- Snijd oppervlakkig, parallel aan tHij verdween aorta. Gebruik de bloedgevulde en dus zichtbare dorsale aorta voor oriëntatie. Zorg het ventrale deel van de lichaamswand voorzichtig van het dorsale gedeelte af met behulp van de uiteinden van de gesloten tang en draai het embryo om. Snijd de lichaamswand lateraal in een rostral-naar-caudale richting en gebruik de dorsale aorta voor oriëntatie, zoals voor de vorige kant.
- Zodra de ventrale lichaamswand is gescheiden van het dorsale lichaam, pak het met een paar tang en trek het zorgvuldig om het te verwijderen, samen met de orgaand massa.
OPMERKING: De metanefrische anlagen blijven gewoonlijk aan de dorsale lichaamswand bevestigd. Zij zijn ovaal, ~ 200 μm lange structuren gelegen op het niveau van de achterste ledematen. - Houd de dorsale lichaamswand vast met een paar tangjes, met de ventrale zijde naar boven gericht. Gebruik de andere paar tangen, pak de dorsale aorta aan het rostale uiteinde en schroef de dorsale aorta zorgvuldig af van de dorsale lichaamswand.
OPMERKING: Beide metanefrische nieren blijven gewoonlijk bijgevenEd naar de dorsale aorta. - Met een paar tangjes snijdt u radiaal naar de nierpunten om de aorta te verwijderen. Vervolgens zorgvuldig scheid de twee nierpunten met behulp van de tips van de tang.
- Vet het ongewenste weefsel voorzichtig af van de nierpunten met behulp van de tips van de tang. Wees voorzichtig om het mesenchym niet te beschadigen, aangezien schade kan leiden tot slechte groei en uitsluiting van de explant uit verdere analyse.
- Breng de nierplaten apart door met een microliterpipet en een wijd open pipettepunt in 10 μl PBS aan het polycarbonaatmembraanfilter in een 4-putjesplaat.
OPMERKING: Vanwege de oppervlaktespanning wordt de explant bedekt met een dunne laag medium. Eén filter is voldoende voor twee nieranlagen.- Plaats elk van de twee nieranlagen in het midden van elke respectieve helft van het filter. Breng het bord terug naar de incubator bij 37 ° C / 5% CO 2 . Laat de bord in de incubator tot aan de metanefrische rudIments uit het volgende embryo zijn klaar om op het filter te worden geplaatst.
- Herhaal stap 2.3-2.9.1 voor elk embryo.
OPMERKING: Bij een bepaalde praktijk duurt de dissectieprocedure ongeveer 5 minuten per embryo. - Incubeer de nieren anlagen gedurende 3 dagen bij 37 ° C / 5% CO 2 .
3. Bereiding van reagentia voor fixatie en kleuring
- Om 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS zonder calcium en magnesium (w / v) op te bereiden, ontleed de PFA bij 60 ° C in PBS, continu roeren. Koel tot kamertemperatuur en gebruik een papieren filter om de resterende deeltjes te verwijderen. Aliquot en houd bij 4 ° C voor onmiddellijk gebruik of bevriezen voor langdurige opslag.
VOORZICHTIG: PFA is giftig. Draag de persoonlijke beschermende uitrusting zoals gespecificeerd in de lokale veiligheidsnormen en werk in een afzuigkap. Verwijder afval volgens de institutionele richtlijnen en gebruik de aangegeven afvalcontainers. - Om de permeabilisatieoplossing voor te bereiden, verdund Triton X-100In PBS zonder calcium en magnesium tot 0,3% (v / v).
- Voor het bereiden van een blokkerende oplossing, voeg 5% (v / v) geiten serum en 0,1% Triton X-100 toe aan PBS zonder calcium en magnesium. Voeg natriumazide toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w / v). Bewaren bij 4 ° C.
VOORZICHTIG: Natriumazide is giftig. Hanteer natriumazide in overeenstemming met de lokale veiligheids- en milieubeschermingsvoorschriften.
OPMERKING: Als u antilichamen gebruikt voor het vullen, gebruik 5% serum uit de soort waarvan het secundaire antilichaam is afgeleid om blokkerende oplossing te maken. - Verdun biotinyleerde Dolichorus biflorus agglutinine 1: 200 in blokkerende oplossing. Verdun Alexa488-geconjugeerde streptavidine 1: 200 in blokkerende oplossing.
- Voor gebruiksklaar inbewerkingsmedium (zie tabel van materialen) voeg 0,1 g wateroplosbare polyvinylalcohol gebaseerde mucoadhesive / mL toe aan 25% (w / v) glycerol in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Verhit tot 50 ° C onder continue roering gedurende 1 uur, afkoelen en stel de pH op op 8,0-8,5 met 1M NaOH. Vermijd hogere NaOH concentraties. Voeg 100 μg / ml N-propylgallaat en thimerosal toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,02% (w / v). Roer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
VOORZICHTIG: Thimerosal is giftig. Hanteer het in overeenstemming met de lokale veiligheids- en milieubeschermingsvoorschriften.- Vul het embeddingsmedium in 50 ml buizen, balans de rotor en centrifugeer bij 3.200 xg en kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Dek de heldere oplossing in 15 ml buizen en gooi de pellet weg. Aliquot en opslaan bij -20 ° C gedurende enkele weken. Zodra het ontdooid is, houd de oplossing bij 4 ° C. Warm tot ~ 30 ° C onmiddellijk voor gebruik.
- Bereid zoveel glazen glijbanen als filters met explanteren op. Lijm hiervoor twee kleine deklijsten, 18 x 18 mm aan weerszijden van de glazen glijbaan met behulp van directe lijm. Laat een ruimte van 15 mm voor de filter tussenin.
4. Bevestiging en kleuring
- Na een kweekperiode van 3Dagen in vitro (div), verwijder de platen uit de incubator en aspirateer het kweekmedium zorgvuldig uit elke put met behulp van een micropipet. Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt en de tipopening naar de wand van de put houdt.
- Voeg 500 μl 4% PFA / PBS toe aan elke put. De filters zullen op de fixatie drijven. Gebruik een micropipet, voeg de PFA-fixatief voorzichtig toe om de filters te onderdompelen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Voor alle volgende stappen moet erop worden gezorgd dat de explantanten niet van het filter afgewassen worden. Houd de opening van de pipettip tegen de wand van de put. - Verwijder de PFA en spoel tweemaal met 500 μL PBS, onderdompeling van het filter. Voeg 500 μl permeabilisatieoplossing toe aan elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel tweemaal met 500 μL PBS en voeg 500 μL blokkerende oplossing toe aan elke put. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Vervang de blokkerende oplossing met250 μl biotinylated Dolichorus biflorus agglutinine verdund 1: 200 in blokkerende oplossing en incuberen bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Verwijder de Dolichorus biflorus agglutinine oplossing en spoel tweemaal met 500 μL PBS per putje.
- Voeg 250 μL Alexa488-geconjugeerde streptavidine verdund 1: 200 in blokkeringsoplossing toe en incubeer bij 24 ° C gedurende 4 uur. Alternatief, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
OPMERKING: een beter signaal-ruisverhouding wordt bereikt bij incubatie bij 4 ° C. - Spoel tweemaal met 500 μL PBS per putje. Met behulp van pincet, breng de filters over op de voorbereide glazen glijbanen, met de explanteren naar boven gericht. Monteer met ~ 50-100 μL embedding medium. Deksel met 60 mm lang nr. 1.5 deksels. Laat de embeddingmediumoplossing gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker stollen. Ga door naar afbeelden of sla de glijbanen op, in folie verpakt, bij 4 ° C tot klaar om op te slaan.
- Afbeelding met een widefield epifluorescentiemicroscoop 7 </ Sup> gekoppeld aan een Hg-lamp en gebruik een spiegel-eenheid voor blauwe excitatie (excitatie bandpas, 460 - 495 nm, dichromatische spiegel, 505 nm en emissie bandpas, 510 - 550 nm) en 20X Plan-Apochromat lenzen, 0,75 numerieke opening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metanephrische nier anlagen werden afgeleid van zwangere Black-6 inbloed muizen bij E11.5 en werden gekweekt. Na 3 dagen had de ureterische knop tot 5 maal vertakt, waardoor de initiële T-vormige ureterische knop werd verdubbeld. Elke explant werd gefotografeerd en de aantallen segmenten en eindpunten werden gekwantificeerd om de vertakkende generaties te bepalen en het aantal eindpunten per tak te berekenen ( Figuur 1 ). ImageJ ( rd generatie; de 4e generatie werd bereikt in slechts 8% van de behandelde explanteren, vergeleken met 35% van de controlexplants ( Figuur 1b ). Het aantal eindpunten per tak en eindpunten per mm2 werd derhalve gereduceerd in de Explanteren behandeld met clustered EphrinB2. Bovendien had een derde van de explanteren ongebruikelijke morfologie in de ureterische knop tips ( Figuur 1 ). Deze resultaten suggereren dat EphrinB2 een beperkend effect zou kunnen hebbenOp het ureterische vertakkingsproces, waarschijnlijk door EphA4 en EphB2 voorwaartse signalering te activeren.
Voor een succesvol experiment is het kritisch dat het metanefrische mesenchym niet wordt beschadigd tijdens dissectie. Eventueel letsel van het mesenchym vermindert het inductieve potentieel, leidt tot verminderde of afwezige ureterische vertakkingen, en kan een bron van vooroordeel zijn. Het voorbeeld in figuur 2A toont een explant waar het mesenchym bijna ontbreekt. De ureterische knop ging niet verder dan de T-fase. Figuur 2B toont een voorbeeld waar de schade van het metanefrische mesenchym leidde tot slechte groei en vertakking. Beide explanten moeten uit de analyse worden uitgesloten.
Figuur 1: E11.5 Metanephrische Nier Anlagen Gecultiveerd voor 3 div en Behandeld met Clustered Recombinant EphrinB2 of ClustMenselijke Fc als een controle. ( A ) Metanephrische nieranlagen werden gescheiden bij E11.5, gekweekt voor 3 div, en gekleurd met biotinylated Dolichorus biflorus agglutinine en Alexa488-geconjugeerde streptavidine. De explants werden afgebeeld met een widefield epifluorescentiemicroscoop met een excitatiebandpas van 460-495 nm, een dichromatische spiegel van 505 nm, een emissie bandpas van 510-550 nm en 20X Plan-Apochromat lenzen. De toepassing van geclusterde recombinant EphrinB2 (clEphrinB2) resulteerde in verminderde vertakkingskomplexiteit en misvorming van de ureterische knoppunten (pijlkop). ( B ) De linker grafiek toont vertakkingsgeneraties in clEphrinB2-behandelde en controlexplants. De 4e generatie vertakking werd bereikt in slechts 8% van de behandelde explanteren, vergeleken met 35% van de controlexplants. Het aantal eindpunten per tak (middengrafiek) en eindpunten per gebied (rechtergrafiek) is verminderd (eindpunten per tak CNT, 2,1 ± 0,09; clEphrinB2, 1,7± 0,08, P = 0,007 **; Eindpunten per vierkante millimeter: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). De gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM en een unpaired Student's t-test werd gebruikt. Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Peuckert et al. , 2016 3 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van twee E11.5 Metanephrische Nier Anlagen die tijdens de Dissectie werden beschadigd, gekweekt voor 3 div, en gebleekt met Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinine en Alexa488-geconjugeerde Streptavidine. ( A en B ) De schade van het mesenchym resulteerde in slechte of afwezige groei en ureterische bud vertakking,Diskwalificatie van de explanteren uit verdere analyse. ( A ) Metanefrische nieruitplanting na 3 div, met afwezige ureterische vertakkingen. Alleen de eerste T-stage tak is zichtbaar. ( B ) Metanefrische nieruitplanting na 3 div, met een slechte ureterische knopvergrening. Schaalstang = 60 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een methode om de ontwikkelende metanephrische anlagen van het muisembryo te isoleren en de orgaansrudimenten te cultiveren. Deze methode is een standaard techniek, zoals ontwikkeld door Grobstein 8 en Saxén 9 , 10 , en werd aangepast en aangepast door vele anderen 11 , 12 . Het succes van de methode hangt voornamelijk af van de duur van de dissectie, aangezien explantieve overleving en inductief potentieel afnemen met langdurige dissectietijd. Ook moet u ervoor zorgen dat het mesenchym niet wordt beschadigd wanneer u het nierrudiment uit het omliggende weefsel reinigt. Schade aan het metanefrische mesenchymme is vaak de reden voor een slechte groei van de explantanten. Dissectie snelheid en fijne motorische vaardigheden verbeteren echter veel beter met de praktijk.
Het chemisch gedefinieerde medium in het gepresenteerde protocol wordt vaak gebruikt om deSerum bevattend medium in primaire cel en in vitro orgelkweek en bevat een mengsel van DMEM en Ham's F-12, gemengd met insuline-transferrineselium, om de groei en overleving van de explanteren te ondersteunen. Glucose- en aminozuuropname, lipogenese en intracellulaire transport worden gefaciliteerd door insuline. Selenium, een cofactor voor glutathionperoxidase, fungeert als antioxidant. Transferrin is een ijzeren drager en helpt bij het beschermen tegen zuurstofradikalen. Bij embryonale niercultuur verhoogt de toevoeging van transferrine aan het medium tubule-differentiatie en thymidine-opname op dosisafhankelijke wijze, met een maximum effect rond 50 μg / mL 13 . Daarom wordt human-holo-transferrine additioneel aangevuld in het medium, wat resulteert in een uiteindelijke transferrineconcentratie van ongeveer 55 ug / ml. Veel protocollen, die een eenvoudiger maar chemisch minder gedefinieerde samenstelling gebruiken, met Eagle's Minimal Essential Medium(MEM) of DMEM en 10% serum ( dwz foetaal runder serum, FBS) geven ook zeer bevredigende resultaten 12 , 13 , 14 , 15 . Er kunnen echter variaties tussen verschillende partijen FBS optreden. Om dergelijke variaties te vermijden en eventuele interferentie van groeifactoren die in het serum aanwezig zijn met Eph-signalering uit te sluiten, werd serumvrij medium gekozen. De beslissing om serumvrij medium te gebruiken hangt af van de experimentele opstelling en de wetenschappelijke vraag. Serumvrije kweekomstandigheden zouden in het bijzonder nodig zijn wanneer het uiteindelijke doel therapeutische toepassing is. Amphotericin B, het anti-schimmelmiddel dat in dit protocol wordt opgenomen, kan worden weggelaten. De cultiveringsperiode in het gepresenteerde voorbeeld was 3 dagen, maar metanephrische nierroosters kunnen tot 10 dagen 15 worden gekweekt. In culturen die 3 dagen overschrijden, dient het medium elke 48 uur te worden vervangen. De ontwikkeling van ontvoeringIn vitro- formuleringen in vitro herhalen de in vivo sequentie van pre-tubulaire aggregaten, niervezels en comma- en S-vormige lichamen. Na 3 dagen in vitro hebben glomerulair-achtige structuren 15 , 16 gevormd. In langere culturen groeit het explantgebied verder door de voortdurende vertakking van de ureterische knop. Bij ongeveer 5 dagen cultuur zijn de nefronen gescheiden in distale, midden- en proximale segmenten 16 .
Ondanks de relatieve gemak en kosteneffectiviteit van de techniek, waardoor veelzijdige toepassingen mogelijk zijn, moet rekening gehouden worden met de overwegingen bij het plannen van experimenten en het tolken van resultaten. Door de extracellulaire matrix en basismembraan aanwezig in de gekweekte organen is de diffusie van exogene stoffen en deeltjes beperkt 17 . Bovendien kunnen de omstandigheden van de kunstmatige cultuur en manipulaties veranderingen in de stof veroorzakenIsm van het weefsel, en celgedrag dat verschilt van de in vivo situatie 15 , 18 . Meest opmerkelijk ontbreken de explanteren de bloedtoevoer, en de glomeruli zijn avasculair; Hoewel de nefronen worden gesegmenteerd, zonering en de vorming van een medulla en loops van Henle ontbreken 14 , 19 . Zo is het toepassingsspectrum van embryonale niercultuur beperkt tot de buisvormige structuren, hun vertakkende morfologie en mesenchymale-epitheliale interacties. Bijgevolg kunnen wetenschappelijke vragen gericht op nierfunctie niet worden aangepakt.
Recente wijzigingen van de cultuurmethode waarbij nierresten worden gegroeid op gecoat glas in een lage volume-geactiveerde organotypische ontwikkeling, zelfs tot cortico-medullaire zonering met verlengde lussen van Henle 15 . Het is ook opmerkelijk dat, recentelijk, een methode om het leven te bewaren en te behoudenEmbryonale nieren werd gepubliceerd. Met deze methode kan het transport van embryonale nierresten bij E11.5 gedurende meerdere dagen worden vervoerd en laat ze later later worden gekweekt. Dit is vooral van belang voor samenwerkingen 20 . De aard van de gehele nier-rudiment cultuur maakt een verscheidenheid aan methodologische aanpassingen mogelijk, waaronder geavanceerde beeldvormingstechnieken. Om bewegingen tijdens de livebeeldvorming te storen, wordt het aanbevolen de drijvende te vervangen door een vast filter, zoals een transwellinzet. De gepresenteerde technologie is zelfs uitgebreid naar cultuurweefselblokken die het hele urogenitale kanaal bevatten. Met behulp van deze uitgebreide cultuur kan de ureterinzetting in de blaas 21 worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Leif Oxburgh en Derek Adams om hun kennis, Leif Oxburgh, voor de handige opmerkingen over het manuscript te delen en Stefan Wölfl en Ulrike Müller voor hun technische ondersteuning en Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer en Viola Mayer voor hulp in de laboratorium. Dit werk werd ondersteund door Development, The Company of Biologists (aan CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
