Summary
यह प्रोटोकॉल माउस भ्रूण से मेटेनफ़्रिक मूल सिद्धांत को अलग और संवर्धन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है, विच्छेदन, अलगाव, और माउस मेटेनफ्रिक मूल सिद्धांतों की संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करना।
स्तनधारी गुर्दे के विकास के दौरान, दो पूर्वज के ऊतकों, यूरेटिक कली और मेटाइफ्रिक मेसेनच्यम, संचार और पारस्परिक रूप से सेलुलर तंत्र को प्रेरित करते हैं ताकि अंततः इकट्ठा करने की प्रणाली और गुर्दे की नेफ्रॉन बन सकें। चूंकि स्तनधारी भ्रूण गर्भनिरोधक होते हैं और इसलिए पर्यवेक्षक के लिए दुर्गम होते हैं, एक अंग संस्कृति विकसित की जाती है। इस पद्धति के साथ, गुर्दे के ऑर्गेनाइजनेस के दौरान उपकला-मेसेनचिमल इंटरैक्शन और सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करना संभव है। इसके अलावा, जन्मजात किडनी और मूत्रजनन पथ की अशुद्धताओं की उत्पत्ति की जांच की जा सकती है। सावधान विच्छेदन के बाद, मेटैफ़्रिक अवधारणाओं को एक फिल्टर पर स्थानांतरित किया जाता है जो संस्कृति माध्यम पर तैरता है और इसे कई दिनों तक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। हालांकि, एक को अवगत होना चाहिए कि शर्तें हैंकृत्रिम और ऊतक में चयापचय को प्रभावित कर सकता है। साथ ही, एक्स्टेंटाइन में मौजूद बाह्य मैट्रिक्स और बेसल झिल्ली के कारण परीक्षण पदार्थों की पहुंच सीमित हो सकती है।
अंग संस्कृति का मुख्य लाभ यही है कि प्रयोगकर्ता अंग को सीधी पहुंच प्राप्त कर सकता है। यह तकनीक सस्ता, सरल है, और बड़ी मात्रा में संशोधनों की अनुमति देती है, जैसे जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों के अलावा, आनुवंशिक रूपों का अध्ययन और उन्नत इमेजिंग तकनीकों के अनुप्रयोग।
Protocol
चूहे स्वीडिश विनियमों और यूरोपीय संघ के विधान (2010/63 / ईयू) के अनुसार बनाए गए थे। स्वीडिश एथिक्स कमेटी (सी 7 9/9, सी 248/11, और सी -135 / 14 परमिट) के दिशानिर्देशों के बाद सभी प्रक्रियाएं पूरी की गईं। हीडलबर्ग यूनिवर्सिटी में पशु विषयों से संबंधित प्रक्रियाओं को हाइडेल्बर्ग विश्वविद्यालय में Regierungspräsidium कार्लज़ूए और पशु कल्याण अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. संस्कृति के लिए अभिकर्मकों और सामग्री की तैयारी
नोट: संदूषण को कम करने के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड का उपयोग करें।
- विच्छेदन के दिन, पूर्व क्लस्टर मानव एफसी अकेले या पुनः संयोजक चिमरिक एफीरिन प्रोटीन मानव-एफसी बकरी एंटीबॉडी के साथ मानवीय एफसी बफर एंटीबॉडी के साथ मस्तिष्क अनुपात 1: 5 की बाँझ फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) में मिलाकर मिलाया जाता है। 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते 5
- दूल्बेक्को के संशोधित ईगल मध्यम पूरक द्वारा संस्कृति के माध्यम तैयार: पोषक तत्व1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (वी / वी), 1% ग्लूटामाइन (वी / वी), 1% इंसुलिन-ट्रांसफिरिन-सेलेनियम (वी / वी), 50 माइक्रोग्राम / एमएल मानव होलो- ट्रांसफिरिन, और 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल एएमफ़ोटेरिसिन।
नोट: 16 भ्रूण के लिए मध्यम के 10 एमएल पर्याप्त है। - संस्कृति माध्यम से 20 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता में क्लस्टर रिंकंबनेंट एफीरिन समाधान जोड़ें। नियंत्रण के रूप में क्लस्टर इंसान एफसी का उपयोग करें।
- एक बाँझ, अनोकेटेड, फ्लैट-नीचे पॉलिस्टीन 4-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के लिए 500 μL संस्कृति माध्यम को जोड़कर संस्कृति प्लेटें तैयार करें।
- बाँझ संदंश का प्रयोग करना, सावधानीपूर्वक एक पॉली कार्बोनेट झिल्ली फिल्टर को मध्यम के शीर्ष पर 5 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से ठीक से रखें। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 ) के लिए तैयार प्लेट को स्थानांतरित करें। यह सुनिश्चित करें कि फिल्टर ऊपरी सतह और फ्लोट पर सूखा रहता है।
नोट: एक फिल्टर दो गुर्दा एनलगेन के लिए पर्याप्त है। - रेजर ब्लेड का प्रयोग करके लगभग 30 पिपेट टिप्स (वॉल्यूम: 100 μL) का अनुमान लगाया गयावाई से 1 मिमी और बड़े खोलने के परिणामस्वरूप युक्तियाँ वापस एक विंदुक-टिप रैक में रखें।
2. ई -11.5 में मेटेनफ्रिक विध्वंस का विच्छेदन
- ग्रीक अव्यवस्था (या स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित विधि का उपयोग करके) द्वारा E11.5 पर एक समयबद्ध गर्भवती माउस का त्याग करें।
- गर्भाशय और भ्रूण निकालें, जैसा कि ब्राउन एट अल 6 द्वारा वर्णित है। इस बिंदु से आगे, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत काम करते हैं।
- नंबर 5 वॉचमाकर संदंश का प्रयोग करके, भ्रूण को सीधे अग्रजों के नीचे काट दिया। प्रत्येक भ्रूण के लिए एक ताजा पेट्री डिश का प्रयोग करें पैर और भ्रूण की पूंछ निकालें ऐसा करने के लिए, ऊतक को नं। 5 की एक जोड़ी के संदंश के साथ हटाया जाना चाहिए और कट करने के लिए दूसरी जोड़ी के सुझावों का उपयोग करें।
- वेंट्रल अंग को हटाने के लिए, संदंश की एक जोड़ी के सुझावों का उपयोग बाद में भ्रूण की शरीर की दीवार को एक उथल-पुथल दिशा में खोलने के लिए करें।
- सूक्ष्म रूप से कट, टी के समानांतरवह पृष्ठीय महाधमनी ओरिएंटेशन के लिए खून भरा और इसलिए दिखाई वाले पृष्ठीय महाधमनी का प्रयोग करें। बंद संदंश की युक्तियों का उपयोग करके पृष्ठीय भाग से शरीर की दीवार के उदर भाग को ध्यान से अलग करें और भ्रूण को फ्लिप दें। पीछे की ओर के रूप में, एक द्रोही-से-पूही दिशा में शरीर की दीवार को काटकर और ओरिएंटेशन के लिए पृष्ठीय महाधमनी का उपयोग करना।
- एक बार ऊतक शरीर की दीवार को पृष्ठीय शरीर से अलग कर दिया गया है, एक संदंश की एक जोड़ी के साथ इसे पकड़ो और ध्यान से इसे निकालने के लिए पुल, एक साथ अंग द्रव्यमान के साथ।
नोट: मेटाइफ़्रिक एलाजन आम तौर पर पृष्ठीय शरीर की दीवार से जुड़ा रहता है। वे अंडाकार हैं, ~ 200 माइक्रोन लंबे संरचनाएं जो हिंद अंगों के स्तर पर स्थित हैं। - पृष्ठीय शरीर की दीवार को एक संदंश के साथ पकड़ो, उदर की तरफ ऊपर का सामना करना। संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करते हुए, पृष्ठीय महाधमनी को अपनी उथल-पुथल के अंत में पकड़ लेते हैं और पृष्ठीय शरीर की दीवार से पृष्ठीय महाधमनी को छीलते हैं।
नोट: मेटैफ़्रिक किडनी दोनों आमतौर पर संलग्न रहेंपृष्ठीय महाधमनी के लिए एड - महाधमनी को हटाने के लिए एक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, गुर्दे के एलाजन को रोस्ट्रेली से काट लें। फिर, संदंश की युक्तियों का उपयोग करके दो गुर्दा एलाजन को सावधानी से अलग करें।
- संदंश की युक्तियों का उपयोग करके किडनी एलाजेन से अवांछित ऊतक को सावधानीपूर्वक छीलकर। मेसेनचाइम को नुकसान न करने की देखभाल करें, क्योंकि क्षति के कारण खराब वृद्धि हो सकती है और आगे के विश्लेषण से स्पष्टीकरण का बहिष्कार किया जा सकता है।
- एक 4-अच्छी तरह से थाली में पॉलीकार्बोनेट झिल्ली फिल्टर को पीबीएस के 10 μL में एक माइक्रोलाइटर विंदुक और एक विस्तृत खुली पिपेट टिप का उपयोग करके गुर्दे एलेजन को अलग से स्थानांतरित करें।
नोट: सतह तनाव के कारण, स्पष्टीकरण मध्यम की एक पतली परत के साथ कवर किया जाएगा। एक फिल्टर दो किडनी एनलगेन के लिए पर्याप्त है।- फिल्टर के प्रत्येक आधा हिस्से के केंद्र में दो गुर्दे के एलाजेन को रखें। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में इनक्यूबेटर पर प्लेट को वापस स्थानांतरित करें। मेटाइफ़्रिक रुड तक इनक्यूबेटर में प्लेट छोड़ देंअगले भ्रूण से इमेन्ट फिल्टर पर रखा जाने के लिए तैयार हैं।
- प्रत्येक भ्रूण के लिए चरण 2.3-2.9.1 दोहराएं।
नोट: कुछ अभ्यास के साथ, विच्छेदन प्रक्रिया में प्रत्येक भ्रूण के बारे में 5 मिनट लगेंगे। - 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में गुर्दा एलाजन को सेते हैं।
3. फिक्सेशन और स्टैनिंग के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
- कैल्शियम और मैग्नीशियम (डब्लू / वी) के बिना पीबीएस में 4% पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) तैयार करने के लिए, पीबीएस में पीएफए में 60 डिग्री सेल्सियस को भंग कर, लगातार सरगर्मी। कमरे के तापमान पर कूल रखें और शेष कणों को हटाने के लिए एक पेपर फिल्टर का उपयोग करें। विभाज्य और दीर्घकालिक भंडारण के लिए तत्काल उपयोग या फ्रीज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
सावधानी: पीएफए विषाक्त है स्थानीय सुरक्षा मानकों में निर्दिष्ट निजी सुरक्षात्मक उपकरणों को पहनें और एक धूआं हुड में काम करें। अपशिष्ट को संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार छोड़ दें और नामित अपशिष्ट कंटेनर का उपयोग करें। - Permeabilization समाधान तैयार करने के लिए, ट्रिटन एक्स -100 पतलाकैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस में 0.3% (वी / वी)
- अवरुद्ध समाधान तैयार करने के लिए, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 5% (वी / वी) बकरी सीरम और 0.1% ट्राइटन एक्स -100 पीबीएस जोड़ें। 0.02% (w / v) की अंतिम एकाग्रता के लिए सोडियम एजाइड जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
सावधानी: सोडियम अजाइड विषाक्त है। स्थानीय सुरक्षा और पर्यावरण संरक्षण विनियमों के अनुसार सोडियम अजाइड को संभालना
नोट: धुंधला हो जाने के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते समय, प्रजातियों से 5% सीरम का उपयोग करें, ब्लॉकिंग समाधान बनाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी निकली। - अवरुद्ध समाधान में बायोटिनिलाटेड डोलिचोरस बायफ्लोरस एग्लूटीनिन 1: 200 पतला। अवरुद्ध समाधान में Alexa488-conjugated streptavidin 1: 200 को छोटा करें।
- तैयार-से-उपयोग के लिए एम्बेडिंग माध्यम (सामग्री की मेज देखें) बनाने के लिए, 0.1 एम ट्रिस्-एचसीएल (पीएच 8.5) में 0.1 ग्राम पानी में घुलनशील पॉलीविनाल अल्कोहल-आधारित म्यूकोशेसिव / एमएल को 25% (वाय / वी) ग्लिसरॉल में जोड़ें। । 1 घंटे के लिए निरंतर आंदोलन के तहत 50 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी, शांत हो जाओ, और पीएच को 8.0-8.5 से 1 का उपयोग करके समायोजित करेंएम नाओएच उच्च NaOH सांद्रता से बचें 0.02% (डब्लू / वी) के अंतिम एकाग्रता में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एन-प्रोपीलेगेट और थिमरासल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हलचल।
सावधानी: थिमेरोशल विषाक्त है। इसे स्थानीय सुरक्षा और पर्यावरण संरक्षण विनियमों के अनुसार संभाल लें- एम्बेडिंग माध्यम को 50 एमएल ट्यूबों में भरें, रोटर को संतुलित करें, और 3,200 xg पर अपकेंद्रित्र और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान को भरें। 15 एमएल ट्यूबों में स्पष्ट समाधान को ढंकना और गोली त्यागें। कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और स्टोर। एक बार thawed, समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें उपयोग करने से पहले ~ 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म
- स्पष्टीकरण के साथ फिल्टर के रूप में कई ग्लास स्लाइड्स तैयार करें जिसे माउंट किया जाना है। इस के लिए, ग्लास स्लाइड के दोनों तरफ झटके में चिपकने वाला दो छोटे कवरलाइट, 18 x 18 मिमी, बीच में फिल्टर के लिए ~ 15 मिमी की जगह छोड़ें।
4. निर्धारण और धुंधला हो जाना
- 3 की संवर्धन अवधि के बादइन विट्रो (डिव) में दिन, इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें और माइक्रोप्रिपेट का इस्तेमाल करते हुए प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम से सावधानी बरतें। सुनिश्चित करें कि फिल्टर को छूने और अच्छी तरह से दीवार की ओर टिप खोलना न रखें।
- प्रत्येक कूल्हे में 500 μL का 4% पीएफए / पीबीएस जोड़ें। फिल्टर लगानेवाला पर तैर जाएगा माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करना, फ़िल्टर को डूबने के लिए सावधानीपूर्वक पीएफए लगानेवाला ड्रॉपवर्ड जोड़ें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते
नोट: सभी निम्न चरणों के लिए, फिल्टर से व्याख्यानों को धोने से नहीं लेना चाहिए। अच्छी तरह से दीवार की ओर विंदुक टिप खोलने के लिए रखें - पीएफए निकालें और पीबीएस के 500 μL के साथ दो बार कुल्ला, फिल्टर को डूब। प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μL पारगम्यता समाधान को जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें।
- पीबीएस के 500 μL के साथ दो बार कुल्ला और हर अच्छी तरह से 500 μL अवरुद्ध समाधान जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
- ब्लॉकिंग समाधान को इसके साथ बदलें250 μL बायोटीनिलेटेड डोलिचोरस बायफ्लोरस एग्लूटीनिन ने 1: 200 को अवरुद्ध करने में समाधान किया और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते।
- डोलिचोरस बायफ्लोरस एग्ल्लटिनिन समाधान को निकालें और पीबीएस की 500 μL प्रति अच्छी तरह से दो बार कुल्ला।
- Alexa 488-conjugated streptavidin के 250 μL जोड़ें अवरुद्ध समाधान में 1: 200 पतला और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
नोट: जब तापमान 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है तो बेहतर संकेत-टू-शोर अनुपात हासिल होता है। - पीबीएस के 500 μL प्रति अच्छी तरह से दो बार कुल्ला। संदंश का उपयोग करना, तैयार गिलास स्लाइड्स के लिए फ़िल्टर को स्थानांतरित करना, समझाए जाने वाले स्पष्टीकरण के साथ। ~ 50-100 μL एम्बेडिंग माध्यम के साथ माउंट करें 60 मिमी-लंबी नं। 1.5 कवरलिप्स के साथ कवर करें। एम्बेडिंग माध्यम समाधान को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मजबूत करने की अनुमति दें। छवि के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर, पन्नी में लिपटे स्लाइड्स इमेजिंग या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
- एक विस्तृतफ़ील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 7 < साथ छवि/ Sup> एक एचजी-दीपक के साथ मिलकर और नीले उत्तेजना (उत्तेजना बैंडपास, 460 - 495 एनएम; डायरेक्ट्रीक मिरर, 505 एनएम; और उत्सर्जन बैंडपास, 510-500 एनएम) और 20 एक्स प्लान-अपोक्रैटमैट लेंस, 0.75 संख्यात्मक एपर्चर।
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Representative Results
मेटाइफ़्रिक गुर्दा एलाजेन ई -11.5 पर गर्भवती काले -6 संकर चूहों से ली गई थी और सुसंस्कृत थे। 3 दिनों के बाद, मूत्रवर्गीय कली से 5 बार ब्रंच हो गया था, जिसके परिणामस्वरूप शुरू में टी-आकार की मूत्रिका कली की उत्पत्ति हुई थी। प्रत्येक स्पष्टीकरण की फोटो खींची गई थी, और शाखाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए शाखाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए और प्रत्येक शाखा के अंतिम बिंदुओं की संख्या ( चित्रा 1 ) की गणना करने के लिए खंडों और समापन बिंदुओं की संख्या निर्धारित की गई। ImageJ ( आरडी पीढ़ी; 4 वें पीढ़ी, केवल 8% एक्सट्रैंटेंट में, नियंत्रण एक्सप्रंटर्स ( चित्रा 1 बी ) के 35% के मुकाबले पहुंची थी। तदनुसार, प्रत्येक शाखा में समाप्ति बिंदुओं की संख्या और मिमी प्रति मिमी 2 की संख्या कम हो गई थी क्लस्टरफ्रेंफ्रिनबी 2 के साथ इलाज किये गए स्पष्टीकरण। इसके अतिरिक्त, एक तीसरे शोधकर्ताओं ने यूरेरिक कली युक्तियों ( चित्रा 1 ) में असामान्य आकारिकी पाया। ये परिणाम बताते हैं कि एफ्रिनबी 2 में एक सीमित प्रभाव हो सकता हैमूत्रवर्गीय कली शाखा की प्रक्रिया पर, एफ़ए 4 और एफएफबी 2 के आगे संकेतन सक्रिय करने के द्वारा सबसे अधिक संभावना है।
एक सफल प्रयोग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन के दौरान metanephric mesenchyme क्षतिग्रस्त नहीं होता है। मेसेनचाइम की किसी भी चोट ने आगमनात्मक क्षमता को कम कर दिया, कम या अनुपस्थित यूरेटिक कली शाखाओं की ओर जाता है, और पूर्वाग्रह का एक स्रोत हो सकता है। चित्रा 2 ए में उदाहरण बताता है कि मेसेनचाइम लगभग गायब है। यूरेन्टीक कली टी-स्टेज से आगे नहीं फैलती थी चित्रा 2 बी एक उदाहरण दिखाता है जहां मेटेनफ्रिक मेसेनच्यम की हानि ने खराब वृद्धि और शाखाओं में बाधा डाली। दोनों explants विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए
चित्रा 1: ई 11.5 मेटानफ्रिक किडनी एनलगेन 3 डिवि के लिए सुसंस्कृत और क्लस्टर रिंकंबिनेंट एफ्रिनबी 2 या क्लस्ट के साथ इलाज किया गयाEred मानव एफसी एक नियंत्रण के रूप में ( ए ) मेटेनफ्रिक किडनी एलागेन को ई 11.5 पर विच्छेदित किया गया था, 3 डिवियों के लिए सुसंस्कृत, और बायोटिनिलाटेड डोलिचोरस बायफ्लोरस एग्लूटीनिन और एलेक्सा 488-संयुग्मित स्ट्रेक्टाविडीन के साथ दाग गया। स्पष्टीकरण 460-495 एनएम, 505 एनएम, 510-550 एनएम के एक उत्सर्जन बैंडपास, और 20 एक्स प्लान-अपोक्रैटमैट लेंस के एक डिक्टोरमेटिक दर्पण के साथ एक विस्तृतफ़ील्ड एफ़िफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया। क्लस्टर रिंकंबिनेंट एफ्रिनबी 2 (सीएलईफ्रिन बी 2) के आवेदन के परिणामस्वरूप शाखाओं की जटिलता और मूत्रवर्गीय कली युक्तियों (एरोहेड) की खराबी को कम किया गया। ( बी ) बाएं ग्राफ clEphrinB2 इलाज और नियंत्रण explants में शाखाओं की शाखाओं दिखाता है। शाखाओं की 4 वीं पीढ़ी के इलाज के लिए केवल 35% कंट्रोल एक्सप्लानरों की तुलना में, इलाज के केवल 8% में पहुंच गया। प्रति शाखाएं (मध्यम ग्राफ) की संख्या और प्रति क्षेत्र में अंतिम बिंदु (दायां ग्राफ) कम हो जाती है (प्रति शाखाएं सीएनटी, 2.1 ± 0.09; क्लिफिन बी 2, 1.7± 0.08, पी = 0.007 **; प्रति वर्ग मीटर के अंत बिंदु: सीएनटी, 31 ± 0.01; क्लएफ्रिनबी 2, 27 ± 0.02; पी = 0.04 *; N = 23) डेटा को ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और एक अनपढ़ छात्र के टी-टेस्ट का इस्तेमाल किया जाता था। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आकृति को पेकर्ट एट अल से संशोधित किया गया है , 2016 3 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: दो ई 11.5 मेटानफ्रिक किडनी एनलगेन के उदाहरण, विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त हो गए थे, 3 डिवियों के लिए संवर्धित, और बायोटिनिलाटेड डोलिचोरस बिफ़्लोरस एग्ग्लुतििनिन और एलेक्सा 488-संयुग्मित स्ट्रेटेपिडिन के साथ सना हुआ था। ( ए और बी ) मेसेनचाइम की क्षति खराब या अनुपस्थित विकास और यूरेटिक कली शाखाओं में हुई,आगे विश्लेषण से व्याख्यानों को अयोग्य ( ए ) मेटनिप्रिक गुर्दा का पता लगाने के बाद 3 डिवों के बाद अनुपस्थित यूरेरेटिक कली शाखाएं। केवल पहली टी-स्टेज की शाखा दिखाई दे रही है ( बी ) मेटनफ़्रिक किडनी स्पष्टीकरण 3 डिव के बाद, गरीब यूरेटिक कली शाखाओं के साथ। स्केल बार = 60 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यह पांडुलिपि माउस भ्रूण से विकासशील मेटेनिप्रिक एलाजन को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और अंग को अवयवों के लिए संस्कृति से जुड़ा हुआ है। यह विधि एक मानक तकनीक है, जैसा कि ग्रॉब्स्टिन 8 और सक्सेन 9 , 10 द्वारा विकसित किया गया था और कई अन्य 11 , 12 द्वारा अनुकूलित और संशोधित किया गया था। विधि की सफलता मुख्य रूप से विच्छेदन की अवधि पर निर्भर करती है, क्योंकि लंबे समय तक विच्छेदन समय के साथ व्याख्यात्मक अस्तित्व और प्रेरक क्षमता में कमी। आस-पास के ऊतकों से गुर्दा की छाल की सफाई करते समय मेसेनचाइम को नुकसान नहीं पहुंचाया जाना चाहिए। मेटानिप्रिक मेसेनच्यम का नुकसान प्रायः स्पष्टीकरण की खराब वृद्धि का कारण है। हालांकि, विच्छेदन की गति और ठीक मोटर कौशल अभ्यास के साथ बहुत सुधार करते हैं।
प्रस्तावित प्रोटोकॉल में रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम को आमतौर पर बदलने के लिए उपयोग किया जाता हैप्राथमिक कोशिका और इन विट्रो अंग संस्कृति में सीरम युक्त माध्यम और डीएमईएम और हैम एफ -12 का एक 1: 1 (वी / वी) मिश्रण होता है, जिसमें इंसुलिन-ट्रांसफिरिन-सेलेनियम के पूरक होते हैं जो स्पष्टीकरणों के विकास और अस्तित्व का समर्थन करते हैं। ग्लूकोज और एमिनो एसिड की तेजता, लिपोजेनेसिस और इंट्रासेल्युलर परिवहन को इंसुलिन द्वारा सहायता प्रदान की जाती है। सेलेनियम, ग्लूटाथियोन पेरोक्साइड के लिए एक कॉफ़ेक्टर, एंटीऑक्सिडेंट के रूप में कार्य करता है। ट्रान्सफिरिन एक लोहा वाहक है और ऑक्सीजन कणों के खिलाफ की रक्षा करने में मदद करता है। भ्रूण की गुर्दा की संस्कृति में, ट्रांसफिरिन के माध्यम से मध्यम में ट्यूबेल भेदभाव और थिमेडीन शामिल एक खुराक पर निर्भर तरीके से बढ़ जाता है, जिसमें अधिकतम 50 μg / mL 13 के आसपास प्रभाव होता है। इसलिए, मानव-होलो-ट्रांसफिरिन को अतिरिक्त माध्यम में पूरक किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 55 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम ट्रांसफिरिन एकाग्रता होती है। कई प्रोटोकॉल, जो ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम के साथ सरल लेकिन रासायनिक रूप से कम परिभाषित संरचना का उपयोग करते हैं(एमईएम) या डीएमईएम और 10% सीरम ( यानी, भ्रूण गोजातीय सीरम, एफबीएस) भी 12 , 13 , 14 , 15 के बहुत संतोषजनक परिणाम देते हैं। हालांकि, विभिन्न बहुत से एफबीएस के बीच भिन्नताएं हो सकती हैं। इस तरह के बदलावों से बचने के लिए और एफएम सिग्नलिंग के साथ सीरम में मौजूद वृद्धि कारकों के संभावित हस्तक्षेप को बाहर करने के लिए, सीरम मुक्त माध्यम चुना गया था। सीरम-मुक्त माध्यम का उपयोग करने का निर्णय प्रायोगिक सेटअप और वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर करता है। सीरम से मुक्त संस्कृति की स्थिति विशेष रूप से आवश्यक होती है, जब अंतिम लक्ष्य चिकित्सीय आवेदन होता है। अम्फोटेरिसिन बी, इस प्रोटोकॉल में शामिल विरोधी कवक एजेंट, को छोड़ा जा सकता है। प्रस्तुत उदाहरण में संवर्धन अवधि 3 दिन थी, लेकिन मेटैनफ्रिक किडनी के मूल सिद्धांतों को 10 दिनों तक 15 दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। संस्कृतियों में 3 दिन से अधिक, मध्यम हर 48 घंटे में परिवर्तित किया जाना चाहिए अपहरण का विकासइन विट्रो में ईकाई के सिद्धांतों में पूर्व-ट्यूबलर समुच्चय, गुर्दे के पुटिकाएं, और अल्पविराम- और एस-आकार के निकायों के विवो अनुक्रम को पुनः मिलाया जाता है। इन विट्रो में 3 दिनों के बाद, ग्लोमेर्युलर-जैसी संरचनाओं का गठन 15 , 16 है । लंबी संस्कृतियों में, यूरेटिक कली की निरंतर शाखाओं के कारण स्पष्टीकरण क्षेत्र बढ़ जाता है। लगभग 5 दिनों की संस्कृति में, नेफ्रों को दूर, मध्य और समीपस्थ खंड 16 में विभाजित किया गया है।
तकनीक की सापेक्ष आसानी और लागत दक्षता के बावजूद, बहुमुखी अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है, प्रयोगों की योजना बनाते समय और परिणामों की व्याख्या करते समय कुछ विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सुसंस्कृत अंगों में मौजूद बाह्य मैट्रिक्स और तहखाने झिल्ली के कारण, बहिर्जात एजेंटों और कणों का प्रसार 17 तक सीमित है इसके अलावा, कृत्रिम संस्कृति की स्थिति और जोड़तोड़ मेटाबोल में परिवर्तन का कारण हो सकता हैऊतक का आइसम, और सेल व्यवहार जो विवो स्थिति 15 , 18 से अलग है। सबसे ज़ाहिर है, explants रक्त की आपूर्ति की कमी है, और glomeruli avascular रहे हैं; यद्यपि नेफ्रोन खंडग्रस्त हो जाते हैं, जोनेशन और मेन्दुला और हेन्ले के लूप का गठन 14 , 1 9 इस प्रकार, भ्रूण गुर्दे की संस्कृति का अनुप्रयोग स्पेक्ट्रम ट्यूबलर संरचनाओं तक सीमित है, उनकी शाखाओं की आकृति विज्ञान, और मेसेनचिमल-एपिथेलियल इंटरैक्शन। नतीजतन, गुर्दा समारोह को लक्षित करने वाले वैज्ञानिक प्रश्नों को संबोधित नहीं किया जा सकता है।
संस्कृति पद्धति के हालिया संशोधनों में, जिसमें गुर्दा की रूढ़िताओं को कम मात्रा में सक्षम अंगोलापीक विकास में लेपित कांच पर उगाया जाता है, यहां तक कि हेनले 15 के विस्तारित छोरों के साथ कॉर्टिको-मेडलरी ज़ोनेशन तक। यह भी ध्यान देने योग्य है कि, हाल ही में, जीवित रहने और संरक्षित करने की एक विधिभ्रूण गुर्दे प्रकाशित किया गया था। इस पद्धति ने ई -11.5 पर भ्रूण के गुर्दे के मूलभूत नियमों को परिवहन के लिए कई दिनों तक सक्षम बनाया और बाद में उन्हें सुसंस्कृत करने की अनुमति दी। यह विशेष रूप से सहयोग के हित में है 20 संपूर्ण-गुर्दा अवधारणा संस्कृति की प्रकृति उन्नत इमेजिंग तकनीकों सहित विभिन्न तरीकों के अनुकूलन की अनुमति देती है। लाइव इमेजिंग के दौरान परेशान करने वाले आंदोलनों से बचने के लिए, फिक्स्डिंग को एक निश्चित फिल्टर के साथ बदलने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि ट्रांसवेल्स इनसेट प्रस्तुती हुई तकनीक का विस्तार पूरे मूत्रजन्य पथ वाले संस्कृति टिशू ब्लॉकों तक भी किया गया है। इस विस्तारित संस्कृति का उपयोग करते हुए, मूत्राशय में मूत्र सम्मिलन 21 की जांच कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों ने लिनफ ऑक्सबर्ग और डेरेक एडम्स को अपने ज्ञान, लिप ऑक्सबर्ग को पांडुलिपि पर सहायक टिप्पणियों, और स्टीफन वोल्फ और उलरीक म्युलर को उनके तकनीकी सहायता और सास्का श्मिटेंटर्ट, जूलिया गोब्बर्ट, सासा वीयर और वियोला मेयर के लिए उदारता से साझा करने के लिए धन्यवाद दिया है। प्रयोगशाला। यह काम डेवलपमेंट, द बायोजिस्ट्स (सीपी) की कंपनी द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
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