Summary
כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .
Abstract
Muriomyocytes Murine כבר בשימוש נרחב עבור במבחנה מחקרים של פיזיולוגיה של הלב ואסטרטגיות טיפוליות חדשות. עם זאת, הכנות רב תאיים של cardiomyocytes ניתק אינם נציג של מורכבות במבנה vivo של cardiomyocytes, שאינם myocytes ו מטריקס תאיים, אשר משפיע הן תכונות מכניות אלקטרו electiysiological של הלב. כאן אנו מתארים טכניקה להכין פרוסות חדרתי קיימא של לבבות העכבר הבוגרים עם השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, ולהפגין את התאמתם הקלטות אלקטרו. לאחר כריתה של הלב, החדרים מופרדים מן אטריה, perfused עם Ca 2 + ללא פתרון המכיל 2,3-butanedione monoxime ו מוטבע ב 4% נמוך להמיס agarose לחסום. הבלוק ממוקם על microtome עם להב רוטט, פרוסות רקמות עם עובי של 150-400 מיקרומטר מוכנים לשמור על רטט חופשיתשל הלהב ב 60-70 הרץ והעברת הלהב קדימה לאט ככל האפשר. עובי הפרוסות תלוי ביישום נוסף. פרוסות מאוחסנים פתרון קרח קר של Tyrode עם 0.9 מ"מ Ca 2 + ו 2,3-butanedione monoxime (BDM) במשך 30 דקות. לאחר מכן, פרוסות מועברים 37 מעלות צלזיוס DMEM למשך 30 דקות לשטוף את BDM. פרוסות ניתן להשתמש עבור מחקרים אלקטרופיזי עם אלקטרודות חדות או מערכים אלקטרודה מיקרו, עבור מדידות כוח לנתח את הפונקציה התכווצות או לחקור את האינטראקציה של cardiomyocytes נגזר בתאי גזע המושתל ואת רקמת המארח. לקבלת הקלטות אלקטרודה חדה, פרוסה ממוקמת לתוך צלחת 3 ס"מ תרבות התא על צלחת חימום של מיקרוסקופ הפוך. פרוסת הוא מגורה עם אלקטרודה חד קוטבית, ואת הפוטנציאל פעולה תאיים של cardiomyocytes בתוך הפרוסה נרשמות עם אלקטרודת זכוכית חדה.
Introduction
פרוסות רקמות דקות נעשה שימוש תכוף במדע בסיסי מאז ימאמוט ומקלווין הראה בשנת 1966 כי הפעילות החשמלית של פרוסות המוח נשמרת במבחנה 1 . מאז, מחקרים אלקטרוכימיים ופרמקולוגיים נערכו על פרוסות מהמוח 2 , כבד 3 , ריאה 4 ורקמת שריר הלב 5 , 6 , 7 . הראשון תיקון מהדק הקלטות בפרוסות חדרית לבבות חולדה בילודים תוארו בשנת 1990 8 , אבל טכניקה זו נפל לתוך שכחה במשך זמן מה. יותר מעשור לאחר מכן, הקבוצה שלנו הקימה שיטה חדשה להכין Murine עובריים 9 , neonatal 10 ומבוגר 11 פרוסות לב. אלה פרוסות רקמות קיימא ניתן להשתמש עבור ניסויים חריפים (פרוסה למבוגריםS יכול להיות מעובד במשך כמה שעות) או ניסויים תרבות לטווח קצר (פרוסות עובריים ו neonatal יכול להיות מעובד במשך כמה ימים). פרוסות להראות in vivo כמו מאפיינים electrophysiological ו עירור הומוגני להתפשט כפי שהוערך על ידי פעולה אלקטרודה חדה פוטנציאל הקלטות מיקרו אלקטרודה מערך 11 . בשל המורפולוגיה "דו מימדי" שלהם, הם מאפשרים גישה ישירה של אלקטרודות הקלטה לכל האזורים של החדר, מה שהופך אותם כלי מעניין עבור חקירות אלקטרופיולוגיות מעלה אפשרויות ניסיוניות חדשות בהשוואה Langendorff-perfused לב שלם. תגובה של סמים של פרוסות לחסיני תעלות יונים כמו verapamil (L-Ca Ca 2 + -channel blocker), lidocain (Na + -חוסך חוסך), 4-aminopyridine (מתח לא תלוי ב- K + -channel blocker) ו- linopirdine (KCNQ K + -חוסך חשמל) 9 , 11 במבחנה עבור מחקרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים. יתר על כן, פרוסות חדר הלב של לב המקבל בשילוב עם הקלטות אלקטרודה חדה הוכיחו להיות כלי מועיל מאוד לאפיין אינטגרציה חשמלית ומכנית כמו גם התבגרות של העובר השתלה 12 , 13 , 14 ותאי גזע נגזר 15 cardiomyocytes.
לסיכום, פרוסות חדרית הם בעלי ערך רב להקים מודל רקמות רב תאיים ויש לראות משלימים cardiomyocytes ניתק Langendorff- perfused לבבותב מחקר קרדיווסקולרי, עם היתרון העיקרי של מתן in vivo כמו מבנה רקמות (בניגוד לתאי ניתק) כמו גם גישה ישירה של טכנולוגיות מדידה כמו הקלטות אלקטרודה חדה לכל אזורי הלב (בניגוד כל ההכנות הלב).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים צריך להיות תואם את הנחיות הוועדה המקומית לרווחת בעלי חיים ואת הדירקטיבה 2010/63 / EU של הפרלמנט האירופי.
1. הכן פתרונות
- הכן את הפתרון של Tyrode ללא Ca 2 + (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, גלוקוז 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. התאם pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C.
- הכן פתרון של Tyrode עם Ca 2 + (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, גלוקוז 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9. התאמת pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C.
- הכן 4% נמוך להמיס agarose: לשים 0.6 גרם נמוך להמיס agarose ב 15 מ"ל הפתרון של Tyrode ללא Ca 2 + . מחממים את התערובת בתנור מיקרוגל פעמיים ב 750 W עבור 10-15 s עד agarose הוא מומס. שמור את הפתרון בטמפרטורה קבועה של 37 &# 176; C ומערבבים ברציפות.
- שמור Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) ללא סרום ב 37 מעלות צלזיוס מבעבע עם carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ).
הכן את המיקרוטום
- הפעל את המיקרוטום.
- ממלאים את החדר microtome החיצוני עם קרח.
- ממלאים את החדר microtome פנימי עם פתרון קרח קר של Tyrode ללא Ca 2 + ו oxygenate ברציפות הפתרון עם O 2 % 100.
- מניחים להב פלדה לתוך בעל הלהב של microtome.
3. עכבר לב בידוד
- להזריק 2,500 U הפרין תת עורי. חכה 15 דקות.
- להקריב את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.
- פתח את החזה על ידי sternotomy.
- בזהירות לנתח את קרום הלב באמצעות מספריים קטנים מלקחיים # 5.
- הכנס צינורית לתוך אבי העורקים עולה ו perfuse העורקים הכליליים באתרו עם קר הקרח Tyrode שלפתרון ללא Ca 2 + עד שנותר דם מוסר.
- בעדינות לכרות את הלב עם מלקחיים ומספריים ולהעביר את הלב בקורפת פתרון Tyrode קר רכוב ללא Ca 2 + .
- להפריד את אטריה מן החדרים עם אזמל או מספריים.
4. הטבעה של החדרים ב 4% נמוכה להמיס Agarose
- מניחים את החדרים עם השיא פונה כלפי מעלה עובש agarose ( איור 1 ). מניחים את הסיכה באמצע התבנית בחדר החדר השמאלי.
- ממלאים את התבנית עם 4% נמוך להמיס agarose ב 37 מעלות צלזיוס, עד הלב מכוסה לחלוטין.
- מניחים את התבנית על הקרח עבור התקשות מהירה יותר של agarose מניעת צף של הרקמה.
- הסר את בלוק agarose המכיל את החדרים מן התבנית עם אזמל.
- הפעל את הבלוק הפוך ולמלא חדרי החדר ואת הפער על הישבן של בלוק agarose, אשר אניS נותרו על ידי סיכה של מולט, עם 4% נמוך להמיס agarose באמצעות מזרק עם מחט 20 G.
- חתוך את הבלוק agarose עם אזמל כדי להשיג תחתית שטוחה של הבלוק ואת המיקום זקוף של איפקס לב.
5. פרוסת רקמת חדרית
- תקן את הבלוק על בעל הדגימה של microtome עם טיפה של דבק cyanoacrylate. הפנים את הקודקוד העליון כלפי מעלה.
- מניחים את בעל הדגימה לתוך החדר הדגימה הפנימית של microtome, אשר מלא Tyrode קר כקרח ללא Ca 2 + . לגמרי לכסות את הבלוק agarose עם הפתרון של Tyrode.
- הכנת פרוסות ציר קצר בעובי של 150-400 מיקרומטר, בהתאם ליישום נוסף (עבור הקלטות אלקטרודה חדה 150-200 מיקרומטר), לשמור על תדירות הרטט של הלהב ב 60-70 הרץ ולהזיז את הלהב קדימה לאט ככל האפשר .
- השתמש במברשת עדינה כדי להסיר בזהירות את agarose הנותרים מן הפרוסות.
- בעדינות transfeR פרוסות עם פיפטה פסטר לתוך הפתרון של Tyrode עם 0.9 מ"מ Ca 2 + סודה עם 100% O 2 ולאחסן אותם לפחות 30 דקות על הקרח להתאושש מההליך חיתוך.
- לאחר מכן, לשמור על פרוסות דקות 30 ב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס, מוגז עם carbogen, כדי לשטוף את BDM לפני שימוש נוסף.
6. הכנת הגדרת אלקטרודה חדה
- לחימום מראש, הדלק את כל המכשירים החשמליים 30 דקות לפני שההקלטה מתחילה.
- שים צלחת 3 ס"מ תרבות התא על צלחת חימום ממוקם על מיקרוסקופ הפוך.
- מניחים את אלקטרודה טבעת אישית ( איור 2 ) בצלחת לחבר חוטי הארקה של מגבר מראש אלקטרודה גירוי.
- חבר את צינורות גמישים של מערכת זלוף לצלחת.
- ממלאים את המאגר של מערכת זלוף עם DMEM, סודה עם carbogen.
- הפעל את משאבת זלוף ולהגדיר את זלוף raTe עד 2-3 מ"ל / דקה.
- התאם את הטמפרטורה של DMEM בצלחת ל 37 מעלות צלזיוס על ידי הסדרת תנור החימום ואת צלחת החימום.
7. פעולה הקלטות פוטנציאליות
- מניחים פרוסה חדרית לתוך צלחת DMEM מלא.
- בדוק את שלמות המבנית ואת הכדאיות (מבוסס על פונקציה התכווצות) של הרקמה עם מיקרוסקופ הפוך.
- מלא אלקטרודה ההקלטה זכוכית עם 3 M KCL.
- ממלאים אלקטרודה גירוי עם DMEM.
- מניחים את האלקטרודה הקלטה אלקטרודה גירוי על מחזיקי האלקטרודה.
- מניחים את האלקטרודה גירוי בזהירות על פרוסה ולהפעיל את המאיץ החשמלי. התחל עם תדר גירוי של 1-2 הרץ.
- העבר את האלקטרודה הקלטה עם micromanipulator מעל עמדת ההקלטה המיועד.
- לאט לאט להוריד את האלקטרודה הקלטה עד קצה נוגע רקמה.
- החל דופק חשמלי מלבני קצר דרךהקלטה אלקטרודה לחדור את קרום התא.
- בזהירות למקם את האלקטרודה הקלטה עד אות יציב מובטחת.
- התחל להקליט פוטנציאל פעולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אוטם שריר הלב מוביל לאובדן כמעט בלתי הפיך של cardiomyocytes. טיפול חלופי נייד באמצעות cardiomyocytes נגזר בתאי גזע עבור התחדשות לב אקסוגני הוא גישה טיפולית מבטיחה. אינטגרציה חשמלית והתבגרות של התאים המושתלים הם חיוניים לבטיחות ויעילות של טיפול החלפת תאים.
כדי להעריך את האינטגרציה ואת ההבשלה, אנו השתילו cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCM, 2 זריקות של 0.5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) לתוך לבבות בריאים של עכברים בוגרים (ראה Peinkofer et al. לתיאור מפורט של השיטות 15 ). שישה ימים לאחר ההשתלה, פרוסות חדר הלב של לב המקבל היו מוכנים באמצעות פרוטוקול המתואר. מוצג רישום נציגאיור 3. פרוסה המכילה iPSCM מושתל הוצב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס ו focally מגורה על ידי אלקטרודה חד קוטבית להציב ברקמת המארח ( איור 3 א , משמאל). פוטנציאל פעולה תאיים נרשמו עם microelectrodes זכוכית חדה מלא 3 M KCl ב eGFP חיובי מושתל iPSCM ו רקמת המארח השכנה בתוך פרוסות ( איור 3 א , מימין).
התמדה ושילוב חשמלי של iPSCM מושתלים לבבות הנמען יכול להיות מוכיח. IPSCM נחשבו להיות משולבים חשמלית, אם תלות הדדית זמנית של חפצים גירוי ופוטנציאל פעולה שנרשמו intracellularly ב cardiomyocytes המושתלים היה נוכח ( איור 3 ב ). איכות אינטגרציה חשמלית ניתן לכמת על ידי עיכוב של הפעלה חשמלית, כלומר העיכוב בין גירוי התחלה של thפעימת פעולה אקטיבית, ותדר הגירוי המקסימלי ללא בלוקי הולכה, כלומר תדר הגירוי המקסימלי המוביל לדור של 1: 1 של פוטנציאל פעולה לאחר כל גירוי.
השתלה iPSCM בניסוי נציג זה היו משולבים חשמלית, כפי שצוין על ידי תדר גירוי מקסימלי ללא בלוקים הולכה של סביב 5 הרץ ( איור 3 ב , ימין), אבל איכות הצימוד לא היה טוב כמו בתוך רקמת המארח כפי שצוין על ידי עיכוב בין artefact גירוי לפעולה פוטנציאלית upstroke (רקמת המארח: 8 ms, iPSCM: 20 ms). פוטנציאל הפעולה של cardiomyocytes המארח היה 84 mV משרעת, -74 mV פוטנציאל דיאסטולי מקסימלי, 11 ms משך ב repolarization 50%, 108 ms משך ב repolarization 90% מהירות upstroke של 114 V / s. הגדלת תדר גירוי מ 1 עד 5 הרץ להוביל לירידה durat פוטנציאל הפעולהיון ב 90% repolarization (86 ms). השתלה iPSCM הראה הבדלים משמעותיים במאפיינים פוטנציאל פעולה. בהשוואה לתאי המארח, המשרעת הייתה קטנה יותר (53 mV), הפוטנציאל הדיאסטולי המרבי היה פחות שלילי (-54 mV), משך ההתייעלות ב -50% (14 ms), משך הזמן ב -90% קצר יותר (90 מיליארדים) ו-upstroke (57 V / s). עלייה בתדר גירוי מ 1 עד 5 הרץ גרמה לירידה משך הפעולה הפוטנציאלי ב repolarization 90% (67 ms). לסיכום, בדוגמה מייצגת זו ב 6 ימים לאחר ההשתלה, ניתוח iPSCM הראה מאפיינים טיפוסיים של cardiomyocytes בוגר. ממצא אנקדוטלי זה עולה בקנה אחד עם מדידות במספר סטטיסטי של תאים ותכשירים, אשר דווחו לפני 15 .
איור 1: תבנית בהזמנה אישית עבור Embedding חדרי agarose. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מותאם אישית טבעת אלקטרודה (קרקע) עבור הקלטות חשמל חדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אינטגרציה חשמלית של השתלת iPSCM . ( א ) הלב פרוסת הלב (שמאל) המכיל ePSCM חיובי eGCM (מימין). SE:אלקטרודת גירוי. נקודות אדומות מסמנות את מיקום ההקלטות. ( ב ) פעולות פוטנציאל הקלטות ברקמת המארח בריא (עקבות העליונים) ו iPSCM מושתלים (עקבות נמוכים). פרוסת היה מגורה focally עם אלקטרודה גירוי להציב רקמות המארח בסביבות 2 הרץ (עקבות שמאל) ו 5 הרץ (עקבות ימניים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוסות חדרית מאפשרים מחקרים אלקטרו-מכאניים, פרמקולוגיים ומכניים עם שימור במבנה רקמות ויוו וגישה ישירה של טכנולוגיית המדידה לכל אזורי הלב. תכונות פוטנציאליות פעילות פיזיולוגית הוכחו בפרוסות עובריים, ילודים ומבוגרים 9 , 10 , 11 . החיוניות של פרוסות, למעט שכבות פני השטח שנפגעו ישירות על ידי הליך חיתוך, אושרה על ידי מכתים חיוניות 9 . פעולות פוטנציאל הקלטות בתוך פרוסות באמצעות אלקטרודות זכוכית חדה ניתן להשתמש כדי לחקור אינטגרציה והתבגרות של cardiomyocytes המושתלים כפי שתואר כאן, או עבור מחקרים פרמקולוגיים לאחר הוספת תרכובות cardioactive. הקלטות לטווח ארוך עם משך שעה אחת או יותר בתא בודדים אפשריים. משך הקלטה זה מספיק כדי לבדוקאת ההשפעה של תרכובות פרמקולוגיות שונות על תא אחד על ידי זלוף רציף לשטוף.
צעדים הכנה קריטיים
כדי לייעל את איכות הפרוסה, נזק רקמות איסכמי יש להימנע. לכן, זלוף של הלב באתרו עם הפתרון של Tyrode, כריתה מהירה לב ושימור מיידי הפתרון הקרה קר חמצן של Tyrode נחשבים מכריעים. Immobilization של הלב פועם באמצעות 2,3-butanedione monoxime עשוי לצמצם עוד יותר רגישות איסכמיה והוא נדרש עבור הטבעה מוצק agarose להמיס נמוכה. הטבעה ב agarose להמיס נמוכה עלול לעכב אספקת רקמות על ידי הגבלת דיפוזיה, אבל הוא חיוני כדי לייצב את רקמת הלב רך לפני חיתוך. חללים קטנים בתוך גוש הדגימה, למשל חדרי החדר לא מלא לחלוטין עם agarose או בועות אוויר הנותרים, עלול להפריע ייצוב רקמות. רקמת שריר לא יציבה אינה מספקת resis מספיקכדי להביס את הלהב רוטט, אשר גורם שיבוש רקמות קשות ופגיעה. כדי להבטיח חיתוך ברור ולמזער נזק לרקמות, הלהבים צריכים להיות חדים ( כלומר, לא לעשות בהם שימוש חוזר יותר משלוש פעמים), והתנועה קדימה של הלהב דרך גוש הדגימה צריכה להיות איטית ככל האפשר, שכן להבים עמומים או זרימת יתר עשויים לשחרר את חדרים מוטבע או ליקרד את הרקמה.
כדי להבטיח תוצאות אמינות לשחזור, איכות פרוסות צריך לעמוד בקריטריונים ספציפיים, כולל שלמות מבנית של הרקמה, אשר ניתן לאשר על ידי מיקרוסקופיה, ותגובה לגירוי חשמלי בתדרים מכות פיזיולוגיות עד 10 הרץ.
פרוסות ניתן לחתוך בעובי של 150-400 מיקרומטר בהתאם ליישום נוסף. בעוד פרוסות דקיק עשוי למנוע תנאים היפוקסית הליבה רקמות ולאפשר זיהוי קל יותר של תאים המושתלים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם מיקום מדויק יותר שלהקלטה אלקטרודות 15 , פרוסות עבות עשוי לספק שלמות טובה יותר של מבנה הרקמה ויציבות גבוהה יותר של הרקמה, אשר יהיה יתרון עבור מדידות כוח 10 ועיבוד היסטולוגית נוסף לאחר הקלטות.
כדי למנוע השפעות אפשריות של ריכוז גבוה BDM על תעלות יון ו Ca 2 + טיפול חלבונים 16 , 17 , BDM לשטוף על ידי הדגירה של פרוסות ב BDM חינם DMEM לפחות 30 דקות לפני השימוש המומלץ. באופן מפתיע, התכווצות בעקבות התנועה של רקמות לאחר לשטוף BDM לא לעכב הקלטות אלקטרודה חדה.
מגבלות
בניגוד למודלים משותפים לתרבית תאים, פרוסות מספקות מבנה רקמות שלם, כולל תא חשמלי מכני שמור לתאי תאים, מטריקס תאיים והפצה של קרדיומיוציTes ולא מיוציטים בתוך רקמת הילידים 6 . עם זאת, פרוסות רקמת הלב לא בדיוק להתאים את המצב vivo , שכן הם רק 150 - 400 מיקרומטר עבה, המסופקים על ידי בינוני מלאכותי עלול להיפגע במהלך תהליך ההכנה. מכתים כחול Trypan והערכת immunohistological של חלק פעיל caspase-3 ו PARP p85 גילה כי תאים בתוך פרוסות עובריים, למעט אלה בשכבות פני השטח, היו קיימא לאחר חיתוך 9 .
מערכת הולכה לא נשמר פרוסות חדרית, התפשטות עירור הוא דו מימדי ולא תלת ממדי של פרוסות שטוח. פרוסות מלבבות עובריים מראים מכות ספונטניות עד שבועיים בתרבות 9 . צירים ספונטניים של פרוסות מבוגר עשוי להתרחש גם, ולא ברור אם הם המושרה על ידי תאים של מערכת הולכה או יכול להצביע על נזק לתאים Ca 2 + שכבתאוד 18 .
יישומים עתידיים
מלבד מחקרים אלקטרו-מכניים עם אלקטרודות חדות ומערכי אלקטרודות מיקרו, אשר עשויים לשמש ניסויים פרמקולוגיים כדי לנתח את ההשפעה של תרופות על תכונות פוטנציאל פעולה והתרגשות התפשטות 11 , מחקרים התפתחותיים 19 או אפיון של cardiomyocytes המושתלים 15 כפי שמוצג לעיל, פרוסות חדרתי של neonatal לבבות שימשו מדידות התכווצות כוח 10 , אשר יכול להיות מיושם על פרוסות מבוגר, מדי. יישומים עתידיים פוטנציאליים נוספים כוללים מחקרים ארוכי טווח במיקרוסקופ בפרוסות מעובדות, למשל כדי להעריך את האינטגרציה המבנית של הקרדיומיטים של תאי גזע מוזרקים, הזרקת צומת פערים לצבעים חדירים לצורכי חקר בין תאיים או למחקרים של האנדותל ו תפקוד כלי הדם של קורונהRy כלי בתוך פרוסות.
לסיכום, פרוסות חדרית הם מודל רקמה רב תאיים רב ערך עם השתמרות in vivo כמו מבנה, אשר עשוי לעזור להתגבר על מגבלות של מודלים תרבות תאים משותפים והם ישים למגוון רחב של מחקרים פרמקולוגיים, פיזיולוגיים, התפתחותיים ו התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה להכריז.
Acknowledgments
אנו מכירים בתמיכת הסדנאות ובמתקן החיות של המכון לנוירופיזיולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי וולטר או מרגה בול Stiftung, Köln Fortune ו דויטשה Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
