Summary
Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .
Abstract
Murine Kardiomyozyten wurden weitgehend für In-vitro- Studien der Herzphysiologie und neue therapeutische Strategien verwendet. Allerdings sind multizelluläre Präparate von dissoziierten Kardiomyozyten nicht repräsentativ für die komplexe in vivo- Struktur von Kardiomyozyten, Nicht-Myozyten und extrazellulärer Matrix, die sowohl mechanische als auch elektrophysiologische Eigenschaften des Herzens beeinflusst. Hier beschreiben wir eine Technik zur Vorbereitung lebensfähiger ventrikulärer Scheiben von erwachsenen Mausherzen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und zeigen ihre Eignung für elektrophysiologische Aufnahmen. Nach der Exzision des Herzens werden Ventrikel von den Vorhöfen abgetrennt, mit einer Ca 2+ -freien Lösung, die 2,3-Butandionmonoxim enthält, perfundiert und in einen 4% niederschmelzenden Agaroseblock eingebettet. Der Block wird auf ein Mikrotom mit einer Vibrationsklinge gelegt und Gewebeschnitte mit einer Dicke von 150-400 μm werden vorbereitet, wobei die Vibration frei bleibtQuency der Klinge bei 60-70 Hz und bewegt die Klinge so langsam wie möglich nach vorne. Die Dicke der Scheiben hängt von der weiteren Anwendung ab. Die Scheiben werden in eiskalter Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ und 2,3-Butandionmonoxim (BDM) für 30 min gelagert. Danach werden die Scheiben für 30 min auf 37 ° C DMEM übertragen, um das BDM zu waschen. Scheiben können für elektrophysiologische Untersuchungen mit scharfen Elektroden oder Mikroelektroden-Arrays verwendet werden, um Kraftmessungen zu analysieren, um die kontraktile Funktion zu analysieren oder die Wechselwirkung von transplantierten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten und Wirtsgewebe zu untersuchen. Für scharfe Elektrodenaufnahmen wird eine Scheibe in eine 3 cm Zellkulturschale auf der Heizplatte eines invertierten Mikroskops gegeben. Die Scheibe wird mit einer unipolaren Elektrode stimuliert und intrazelluläre Aktionspotentiale von Kardiomyozyten innerhalb der Scheibe werden mit einer scharfen Glaselektrode aufgezeichnet.
Introduction
Dünngewebescheiben wurden in der Grundwissenschaft häufig verwendet, da Yamamot und Mcllwain 1966 zeigten, dass die elektrische Aktivität von Hirnschnitten in vitro 1 aufrechterhalten wird . Seither wurden elektrophysiologische und pharmakologische Studien an Scheiben aus Gehirn 2 , Leber 3 , Lunge 4 und Myokardgewebe 5 , 6 , 7 durchgeführt. Erste Patch-Clamp-Aufnahmen in ventrikulären Scheiben aus neonatalen Rattenherzen wurden im Jahre 1990 beschrieben 8 , aber diese Technik fiel für einige Zeit in Vergessenheit. Mehr als ein Jahrzehnt später, unsere Gruppe eine neue Methode zur Vorbereitung murine embryonalen 9 , neonatale 10 und erwachsenen 11 Herz-Scheiben. Diese lebensfähigen Gewebeschnitte können für akute Experimente (erwachsene Scheibe) verwendet werdenS kann für mehrere Stunden kultiviert werden) oder kurzfristige Kulturversuche (embryonale und neonatale Scheiben können für einige Tage kultiviert werden). Die Scheiben zeigen in vivo wie elektrophysiologische Eigenschaften und eine homogene Anregungsspanne, wie sie durch scharfe Elektrodenwirkungspotentiale und Mikroelektrodenanordnungen aufgezeichnet wird 11 . Aufgrund ihrer "zweidimensionalen" Morphologie erlauben sie den direkten Zugang von Aufzeichnungselektroden zu allen Bereichen des Ventrikels, was sie zu einem interessanten Werkzeug für elektrophysiologische Untersuchungen macht und im Vergleich zu Langendorff-perfundierten Herzen ganz neue experimentelle Möglichkeiten aufwirft. Arzneimittelreaktion der Scheiben auf Ionenkanalblocker wie Verapamil (L-Typ Ca 2+ -Kanalblocker), Lidocain (Na + -Kanalblocker), 4-Aminopyridin (unselektivspannungsabhängiger K + -Kanalblocker) und Linopirdin (KCNQ K + -Kanal-Blocker) 9 , 11 10 . Diese Ergebnisse zeigten, dass murine ventrikuläre Scheiben als in vitro Gewebemodell für physiologische und pharmakologische Studien geeignet sind. Darüber hinaus haben sich die ventrikulären Scheiben der Empfängerherzen in Kombination mit scharfen Elektrodenaufnahmen als sehr hilfreiches Werkzeug erwiesen, um die elektrische und mechanische Integration sowie die Reifung der transplantierten fetalen 12 , 13 , 14 und der Stammzellen-abgeleiteten 15 Kardiomyozyten zu charakterisieren.
Zusammenfassend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles und gut etabliertes multizellulares Gewebemodell und sollten als komplementär zu dissoziierten Kardiomyozyten und Langendorff-perfundierten Herzen betrachtet werdenIn der Herz-Kreislauf-Forschung mit dem großen Vorteil der Bereitstellung einer in vivoähnlichen Gewebestruktur (im Gegensatz zu dissoziierten Zellen) sowie direkten Zugang von Messtechniken wie scharfe Elektrodenaufnahmen zu allen Regionen des Herzens (im Gegensatz zu ganzen Herzpräparaten).
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Protocol
Die Tierhaltung muss den Richtlinien des örtlichen Tierschutzausschusses und der Richtlinie 2010/63 / EU des Europäischen Parlaments entsprechen.
1. Lösungen vorbereiten
- Die Lösung von Tyrode ohne Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, 2,3-Butandionmonoxim (BDM) 30. pH-Wert auf 7,4 einstellen Mit NaOH bei 4 ° C.
- Die Lösung von Tyrode mit Ca 2+ (Zusammensetzung in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, Glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH bei 4 ° C einstellen.
- 4% niedrigschmelzende Agarose vorbereiten: 0,6 g Schmelzklebstoff in 15 ml Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ geben . Die Mischung in einem Mikrowellenofen zweimal bei 750 W für 10-15 s erhitzen, bis die Agarose aufgelöst ist. Halten Sie die Lösung bei einer konstanten Temperatur von 37 &# 176, C und rühren kontinuierlich.
- Halten Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Serum bei 37 ° C mit Carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ) geblasen.
2. Bereiten Sie das Mikrotom vor
- Schalte das Mikrotom ein.
- Füllen Sie die äußere Mikrotomkammer mit Eis.
- Füllen Sie die innere Mikrotomkammer mit eiskalter Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ und kontinuierlich die Lösung mit 100% O 2 an .
- Legen Sie eine Stahlklinge in den Messerhalter des Mikrotoms.
3. Maus Herzisolation
- 2500 U Heparin subkutan injizieren Warte 15 min.
- Das Tier durch zervikale Versetzung opfern
- Öffne die truhe durch sternotomie.
- Sorgfältig das Perikard mit einer kleinen Schere und einer Pinzette # 5 sezieren.
- Setzen Sie eine Kanüle in die aufsteigende Aorta ein und benennen Sie die Koronararterien in situ mit eiskaltem TyrodeLösung ohne Ca 2+ bis das übrige Blut entfernt wird.
- Vorspeisen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer Schere und überträgt das Herz in eiskaltes Tyrode-Lösung ohne Ca 2+ .
- Trennen Sie die Vorhöfe von den Ventrikeln mit einem Skalpell oder einer Schere.
4. Einbettung der Ventrikel in 4% niedrigschmelzende Agarose
- Legen Sie die Ventrikel mit der Spitze nach oben in die Agarose-Form (Abbildung 1 ). Legen Sie den Stift in die Mitte der Form in die linke Kammerkammer.
- Füllen Sie die Form mit 4% niedrigschmelzender Agarose bei 37 ° C, bis das Herz vollständig bedeckt ist.
- Legen Sie die Form auf Eis für eine schnellere Aushärtung der Agarose, die das Schwimmen des Gewebes verhindert.
- Entfernen Sie den Agaroseblock, der die Ventrikel enthält, aus der Form mit einem Skalpell.
- Drehen Sie den Block umgedreht und füllen Sie die ventrikulären Kammern und die Lücke auf der Rückseite des Agarose-Blocks, die iS durch den Stift der Molte, mit 4% niedrigschmelzender Agarose unter Verwendung einer Spritze mit einer 20 G-Nadel.
- Trimmen Sie den Agaroseblock mit einem Skalpell, um einen flachen Boden des Blocks und die aufrechte Position des Herzscheitels zu erreichen.
5. Das ventrikuläre Gewebe schneiden
- Fixieren Sie den Block auf dem Probenhalter des Mikrotoms mit einem Tropfen Cyanacrylat-Leim. Gesicht der Herzschärfe nach oben.
- Legen Sie den Probenhalter in die innere Probenkammer des Mikrotoms, die mit eiskaltem Tiroler ohne Ca 2+ gefüllt ist. Den Agaroseblock vollständig mit der Tyrode-Lösung abdecken.
- Kleine Achsenscheiben in einer Dicke von 150-400 μm vorbereiten, abhängig von der weiteren Anwendung (bei scharfen Elektrodenaufnahmen 150-200 μm), die Vibrationsfrequenz der Klinge bei 60-70 Hz halten und die Klinge so langsam wie möglich nach vorne bewegen .
- Verwenden Sie eine feine Bürste, um die verbleibende Agarose vorsichtig aus den Scheiben zu entfernen.
- Sanft transfR Scheiben mit einer Pasteurpipette in die Tyrode-Lösung mit 0,9 mM Ca 2+ belüftet mit 100% O 2 und lagern sie für mindestens 30 min auf Eis, um sich aus dem Schneidvorgang zu erholen.
- Danach 30 Minuten in DMEM bei 37 ° C aufbewahren, mit Carbogen belüftet, BDM vor der weiteren Verwendung abwaschen.
6. Vorbereitung der Sharp Electrode Setup
- Zum Vorheizen alle elektrischen Geräte 30 min einschalten, bevor die Aufnahmen beginnen.
- Setzen Sie eine 3 cm Zellkulturschale auf die Heizplatte, die auf dem invertierten Mikroskop platziert ist.
- Legen Sie die maßgeschneiderte Ringelektrode (Abbildung 2 ) in die Schale und verbinden Sie die Erdungsdrähte des Vorverstärkers und der Stimulationselektrode.
- Verbinden Sie die flexiblen Rohre des Perfusionssystems mit der Schale.
- Füllen Sie das Reservoir des Perfusionssystems mit DMEM, belüftet mit Carbogen.
- Schalte die Perfusionspumpe ein und setze die Perfusion raTe bis 2-3 mL / min.
- Stellen Sie die Temperatur von DMEM in der Schale auf 37 ° C ein, indem Sie den Durchlauferhitzer und die Heizplatte regeln.
7. Aktion Potenzielle Aufnahmen
- Legen Sie eine ventrikuläre Scheibe in die DMEM gefüllte Schale.
- Überprüfen Sie die strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit (auf der Grundlage der kontraktilen Funktion) des Gewebes mit dem invertierten Mikroskop.
- Füllen Sie eine Aufzeichnungsglaselektrode mit 3 M KCL.
- Füllen Sie eine Stimulationselektrode mit DMEM.
- Legen Sie die Aufzeichnungselektrode und die Stimulationselektrode auf die Elektrodenhalter.
- Legen Sie die Stimulationselektrode sorgfältig auf die Scheibe und schalten Sie den elektrischen Stimulator ein. Beginnen Sie mit einer Stimulationsfrequenz von 1-2 Hz.
- Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem Mikromanipulator über die vorgesehene Aufnahmeposition.
- Langsam die Aufzeichnungselektrode absenken, bis die Spitze das Gewebe berührt.
- Tragen Sie einen kurzen rechteckigen elektrischen Puls durch dieAufzeichnungselektrode, um die Zellmembran zu durchdringen.
- Setzen Sie die Aufzeichnungselektrode sorgfältig ein, bis ein stabiles Signal gewährleistet ist.
- Starten Sie die Aufnahme von Aktionspotentialen.
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Representative Results
Myokardinfarkt führt zu einem nahezu irreversiblen Verlust von Kardiomyozyten. Zell-Ersatz-Therapie mit Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten für exogene Herzregeneration ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Die elektrische Integration und Reifung der transplantierten Zellen ist entscheidend für die Sicherheit und Effizienz der Zellersatztherapie.
Zur Beurteilung der Integration und Reifung wurden die von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSCM; 2 Injektionen von 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μl), die ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) in gesunde Herzen erwachsener Mäuse exprimieren (vgl. Peinkofer et al. Für eine detaillierte Beschreibung der Methoden 15 ). Sechs Tage nach der Transplantation wurden ventrikuläre Scheiben von Empfängerherzen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt. Eine repräsentative Aufnahme ist inAbbildung 3 Eine Scheibe, die transplantiertes iPSCM enthielt, wurde in DMEM bei 37 ° C platziert und durch eine unipolare Elektrode, die in Wirtsgewebe platziert wurde, fokal stimuliert ( Fig. 3A , links). Intrazelluläre Aktionspotentiale wurden mit scharfen Glasmikroelektroden aufgezeichnet, die mit 3 M KCl in eGFP-positiv transplantiertem iPSCM und benachbartem Wirtsgewebe innerhalb der Scheiben gefüllt wurden (Abbildung 3A , rechts).
Die Persistenz und die elektrische Integration von transplantiertem iPSCM in Empfängerherzen konnten nachgewiesen werden. IPSCM wurden als elektrisch integriert betrachtet, wenn eine zeitliche Interdependenz von Stimulationsartefakten und Aktionspotentialen, die intrazellulär in transplantierten Kardiomyozyten aufgezeichnet wurden, vorhanden war (Abbildung 3B ). Die Qualität der elektrischen Integration könnte durch die Verzögerung der elektrischen Aktivierung, dh die Verzögerung zwischen Stimulus und Beginn von th, quantifiziert werdenE-Aktionspotential-Aufschlag und die maximale Stimulationsfrequenz ohne Leitungsblöcke, dh die maximale Stimulationsfrequenz, die nach jedem Stimulus zu einer 1: 1-Erzeugung von Aktionspotentialen führt.
Transplantiertes iPSCM in diesem repräsentativen Experiment wurden elektrisch integriert, wie durch eine maximale Stimulationsfrequenz ohne Leitungsblöcke von etwa 5 Hz (Abbildung 3B , rechts) angezeigt, aber die Qualität der Kopplung war nicht so gut wie im Wirtsgewebe, wie durch die längere angegeben Verzögerung zwischen Stimulations-Artefakt und Aktionspotential Aufstieg (Wirtsgewebe: 8 ms, iPSCM: 20 ms). Die Aktivierungspotentiale von Wirts-Kardiomyozyten hatten eine Amplitude von 84 mV, -74 mV maximales diastolisches Potential, 11 ms Dauer bei 50% Repolarisation, 108 ms Dauer bei 90% Repolarisation und eine Aufwärtsgeschwindigkeit von 114 V / s. Die Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 1 bis 5 Hz führt zu einer Abnahme des AktionspotentialsIon bei 90% Repolarisation (86 ms). Transplantiertes iPSCM zeigte signifikante Unterschiede in den Aktionspotentialeigenschaften. Im Vergleich zu den Wirtszellen war die Amplitude kleiner (53 mV), maximales diastolisches Potential weniger negativ (-54 mV), Dauer bei 50% Repolarisation erhöht (14 ms), Dauer bei 90% Repolarisierung kürzer (90 ms) und Aufwärtsgeschwindigkeit Langsamer (57 V / s). Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 1 bis 5 Hz führte zu einer Abnahme der Aktionspotentialdauer bei 90% Repolarisation (67 ms). Schlussfolgerung, in diesem repräsentativen Beispiel bei 6 Tagen nach der Transplantation zeigte das analysierte iPSCM typische Merkmale von unreifen Kardiomyozyten. Dieser anekdotische Befund steht im Einklang mit Messungen in einer statistisch ausreichenden Anzahl von Zellen und Präparaten, die vor 15 berichtet wurden.
Abbildung 1: Maßanfertigung für Einbettung von Ventrikeln in Agarose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Maßgeschneiderte Ringelektrode (geschliffen) für scharfe Elektrodenaufnahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Elektrische Integration von transplantiertem iPSCM . ( A ) Ventrikuläres Herzstück (links) mit eGFP positivem iPSCM (rechts). SE:Stimulationselektrode Rote Punkte markieren den Ort der Aufnahmen. ( B ) Aktionspotentialaufnahmen im gesunden Wirtsgewebe (obere Spuren) und transplantiertes iPSCM (untere Spuren). Die Scheibe wurde fokal stimuliert mit einer Stimulationselektrode, die in Wirtsgewebe bei etwa 2 Hz (linke Spuren) und 5 Hz (rechte Spuren) platziert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ventrikuläre Scheiben ermöglichen elektrophysiologische, pharmakologische und mechanische Untersuchungen mit einer konservierten in vivoähnlichen Gewebestruktur und einem direkten Zugang der Messtechnik zu allen Regionen des Herzens. Physiologische Wirkungspotentialeigenschaften wurden in embryonalen, neonatalen und erwachsenen Scheiben 9 , 10 , 11 nachgewiesen. Die Vitalität der Scheiben, mit Ausnahme der Oberflächenschichten, die durch das Schneidverfahren direkt beschädigt wurden, wurde durch Vitalfärbung bestätigt 9 . Aktionspotentialaufnahmen innerhalb der Scheiben unter Verwendung von scharfen Glaselektroden können verwendet werden, um die Integration und Reifung von transplantierten Kardiomyozyten, wie hier beschrieben, oder für pharmakologische Untersuchungen nach der Zugabe von kardioaktiven Verbindungen zu untersuchen. Langzeitaufnahmen mit einer Dauer von einer Stunde oder mehr in einer einzelnen Zelle sind möglich. Diese Aufnahmedauer reicht aus, um zu testenDie Auswirkung verschiedener pharmakologischer Verbindungen auf eine Zelle durch sequentielle Perfusion und Auswaschung.
Kritische Vorbereitungsschritte
Zur Optimierung der Scheibenqualität sollte ischämische Gewebeschädigung vermieden werden. Daher werden die Perfusion des Herzens in situ mit Tyrode-Lösung, schnelle Herzresektion und sofortige Konservierung in eiskalter, mit Sauerstoff angereicherter Tyrode-Lösung als entscheidend angesehen. Die Immobilisierung des schlagenden Herzens unter Verwendung von 2,3-Butandionmonoxim kann die Anfälligkeit für Ischämie weiter verringern und ist für eine feste Einbettung in niedrigschmelzende Agarose erforderlich. Einbetten in niedrigschmelzende Agarose könnte die Gewebeversorgung durch Begrenzung der Diffusion behindern, ist aber wichtig, um das weiche Herzgewebe vor dem Schneiden zu stabilisieren. Kleine Hohlräume innerhalb des Probenblocks, z. B. ventrikuläre Kammern, die nicht vollständig mit Agarose oder verbleibenden Luftblasen gefüllt sind, könnten die Gewebestabilisierung behindern. Unstabilisiertes Myokardgewebe bietet keine ausreichende ResisTanzen zum Vibrationsmesser, was zu schweren Gewebeunterbrechungen und Schäden führt. Um einen klaren Schnitt zu gewährleisten und die Gewebeschädigung zu minimieren, sollten die Klingen scharf sein ( dh nicht mehr als dreimal wiederverwendet werden), und die Vorwärtsbewegung der Klinge durch den Probenblock sollte so langsam wie möglich sein, da stumpfe Klingen oder Überdrehungen das lösen können Eingebettete Ventrikel oder lacerieren das Gewebe.
Um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, sollte die Qualität der Scheiben spezifische Kriterien erfüllen, einschließlich der strukturellen Integrität des Gewebes, die durch Mikroskopie bestätigt werden kann, und die Reaktion auf elektrische Stimulation bei physiologischen Schläge bis zu 10 Hz.
Scheiben können je nach Anwendungsfall mit einer Dicke von 150-400 μm geschnitten werden. Während dünnere Scheiben hypoxische Zustände im Gewebekern verhindern und einen leichteren Nachweis von transplantierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop sowie eine präzisere Positionierung ermöglichen könnenAufzeichnungselektroden 15 können dickere Scheiben eine bessere Integrität der Gewebestruktur und eine höhere Stabilität des Gewebes bereitstellen, was für Kraftmessungen 10 und eine weitere histologische Verarbeitung nach Aufnahmen vorteilhaft sein wird.
Um mögliche Einflüsse hoher BDM-Konzentrationen auf Ionenkanälen und Ca 2+ -Handhabungsproteinen 16 , 17 zu vermeiden, wird eine BDM-Auswaschung durch Inkubation von Scheiben in BDM-freiem DMEM für mindestens 30 min vor der weiteren Verwendung empfohlen. Überraschenderweise beeinträchtigen die Kontraktion und die anschließende Bewegung des Gewebes nach dem BDM-Auswaschen keine scharfen Elektrodenaufnahmen.
Einschränkungen
Im Gegensatz zu herkömmlichen Zellkulturmodellen liefern Scheiben eine intakte Gewebestruktur, einschließlich konservierter elektrischer und mechanischer Zelle zu Zellverbindungen, extrazelluläre Matrix und Verteilung von KardiomyocyTes und non-myozyten innerhalb des nativen Gewebes 6 . Allerdings entsprechen Herzgewebescheiben nicht exakt der in vivo- Situation, da sie nur 150 - 400 μm dick sind und von künstlichem Medium geliefert werden und während des Herstellungsprozesses beschädigt werden können. Trypan-Blau-Färbung und immunhistologische Auswertung von aktivem Caspase-3 und PARP-p85-Fragment zeigten, dass Zellen innerhalb embryonaler Scheiben, mit Ausnahme derjenigen in den Oberflächenschichten, nach dem Aufschneiden lebensfähig waren 9 .
Das Leitungssystem ist nicht in ventrikulären Scheiben erhalten, und die Erregungsstrecke ist zweidimensional und nicht dreidimensional in den flachen Scheiben. Scheiben aus embryonalen Herzen zeigen spontanes Schlagen für bis zu zwei Wochen in Kultur 9 . Spontane Kontraktionen von erwachsenen Scheiben können auch auftreten, und es ist unklar, ob sie durch Zellen des Leitungssystems induziert werden oder auf Zellschäden und Ca 2+ Overl hindeuten könnenOad 18
Zukünftige Anwendungen
Neben elektrophysiologischen Untersuchungen mit scharfen Elektroden und Mikroelektroden-Arrays, die für pharmakologische Experimente zur Analyse des Einflusses von Arzneimitteln auf Aktionspotentialeigenschaften und Anregungsspanne 11 , Entwicklungsstudien 19 oder Charakterisierung von transplantierten Kardiomyozyten 15 , wie oben gezeigt, ventrikuläre Neonatalscheiben verwendet werden können Herzen wurden für Kraftkontraktionsmessungen 10 verwendet, die auch auf erwachsene Scheiben angewendet werden könnten. Weitere mögliche zukünftige Anwendungen sind (I) Langzeitmikroskopie-Studien in kultivierten Scheiben, z. B. zur Beurteilung der strukturellen Integration von injizierten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, (II) Injektion von Spaltübergang permeablen Farbstoffen zu untersuchten interzellulären Kopplung oder (III) Studien von Endothel Und vaskuläre Funktion der KoronaRy Schiffe innerhalb der Scheiben.
Abschließend sind ventrikuläre Scheiben ein wertvolles multizellulares Gewebemodell mit konservierter in vivoähnlicher Struktur, die dazu beitragen können, Beschränkungen von gemeinsamen Zellkulturmodellen zu überwinden und auf eine breite Palette pharmakologischer, physiologischer, entwicklungs- und zelltherapeutischer Studien anwendbar zu sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung der Workshops und der Tierfazilität des Instituts für Neurophysiologie an. Diese Arbeit wurde von der Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune und der Deutschen Stiftung für Herzforschung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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