Summary
在这里,我们描述了成年小鼠可行心室切片的制备及其对尖锐电极动作电位记录的应用。这些多细胞制剂提供了保留在体内的类似组织结构,这使得它们成为体外电生理和药理学研究的有价值的模型。
Abstract
鼠心肌细胞已广泛用于心脏生理学和新治疗策略的体外研究。然而,解离的心肌细胞的多细胞制剂并不代表心肌细胞,非肌细胞和细胞外基质的复合体内结构,其影响心脏的机械和电生理学性质。在这里,我们描述了一种技术,用于制备具有保留的体内类似组织结构的成年小鼠心脏的活动性心室切片,并且证明其适用于电生理记录。切除心脏后,将心室与心房分离,用含有2,3-丁二酮一肟的无Ca 2+溶液灌注,并包埋在4% 低熔点琼脂糖块中。将块放置在具有振动叶片的切片机上,并且制备厚度为150-400μm的组织切片,保持振动频率60-70 Hz的刀片速度,并尽可能缓慢地向前移动刀片。切片的厚度取决于进一步的应用。切片储存在冰冷的Tyrode溶液中,用0.9mM Ca 2+和2,3-丁二酮一肟(BDM)处理30分钟。之后,将切片转移到37℃的DMEM中30分钟以洗出BDM。切片可用于具有尖锐电极或微电极阵列的电生理研究,用于力测量分析收缩功能或调查移植的干细胞衍生的心肌细胞和宿主组织的相互作用。对于尖锐的电极记录,将切片置于倒置显微镜的加热板上的3cm细胞培养皿中。用单极电极刺激切片,用锋利的玻璃电极记录切片内心肌细胞的细胞内动作电位。
Introduction
由于Yamamot和Mcllwain于1966年在体外证实了脑片的电活动,所以在基础科学中经常使用薄片切片1 。此后,从脑2 ,肝3 ,肺4和心肌组织5,6,7的切片进行了电生理和药理学研究。 1990年8月描述了来自新生大鼠心脏的心室切片中的第一次膜片钳记录,但是这种技术被遗忘了一段时间。十多年后,我们组织制定了一种新的方法来准备鼠胚胎9 ,新生儿10和成人11心脏切片。这些活组织切片可用于急性实验(成人切片)s可以培养数小时)或短期培养实验(胚胎和新生儿切片可以培养几天)。切片在体内显示如电生理特征和均匀的激发扩散,如通过尖锐电极动作电位和微电极阵列记录所评估的。由于其“二维”形态,它们允许记录电极直接进入心室的所有区域,这使得它们成为电生理调查的有趣工具,并且与Langendorff灌注的整个心脏相比提出了新的实验选择。离子通道阻滞剂如维拉帕米(L型Ca 2+通道阻断剂),利多卡因(Na +通道阻断剂),4-氨基吡啶(非选择性电压依赖性K +通道阻滞剂)和亚麻酸(KCNQ K +通道阻塞) 9,11 10 。这些研究结果表明,鼠心室切片适合作为生理和药理学研究的体外组织模型。此外,受体心脏的心室切片与尖锐的电极记录结合已经被证明是一个非常有用的工具,用于表征移植胎儿12,13,14和干细胞衍生的15个心肌细胞的电和机械整合以及成熟。
总之,心室切片是一种有价值且成熟的多细胞组织模型,应被认为与分离的心肌细胞和Langendorff灌注心脏互补在心血管研究中,提供体内类似组织结构(与分离的细胞相反)的主要优点,以及直接访问诸如尖锐电极记录到心脏的所有区域的测量技术(与全心脏制剂相反)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物处理必须符合当地动物福利委员会的指导方针和欧盟议会的2010/63 / EU指令。
准备解决方案
- 制备没有Ca 2+ (组成为mM)的Tyrode溶液:NaCl 136,KCl 5.4,NaH 2 PO 4 0.33,MgCl 2 1,葡萄糖10,HEPES 5,2,3-丁二酮单肟(BDM)30。将pH调节至7.4用NaOH在4℃。
- 用Ca 2+ (组成为mM)制备Tyrode溶液:NaCl 136,KCl 5.4,NaH 2 PO 4 0.33,MgCl 2 ,葡萄糖10,HEPES 5,BDM 30,CaCl 2 0.9。在4℃用NaOH调节pH至7.4。
- 准备4%低熔点琼脂糖:将0.6 g低熔点琼脂糖置于15 mL Tyrode溶液中,不含Ca 2+ 。将混合物在微波炉中以750W加热10次,直到琼脂糖溶解。将溶液保持在37℃的恒定温度,#176; C并连续搅拌。
- 在37℃下保持不含血清的Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM),用碳霉素(5%CO 2,95%O 2 )鼓泡。
2.准备切片机
- 打开切片机。
- 用冰将外切片机室填满。
- 用冰冷的Tyrode溶液填充内切片机室,不含Ca 2+ ,并持续用100%O 2使溶液充氧。
- 将钢刀片放入切片机刀片架上。
3.小鼠心脏隔离
- 皮下注射2500 U肝素。等待15分钟
- 通过颈椎脱位牺牲动物。
- 通过胸骨切开术打开胸部。
- 用小剪刀和镊子#5仔细分析心包。
- 将插管插入升主动脉,并用冰冷的Tyrode's 原位灌注冠状动脉不含Ca 2+的溶液,直到除去剩余的血液。
- 用镊子和剪刀轻轻切除心脏,将冰块转移到冰冷的Tyrode溶液中,不含Ca 2+ 。
- 用手术刀或剪刀将心房与心室分开。
4.将心室嵌入4%低熔点琼脂糖中
- 将顶点面朝上放置在琼脂糖模具中( 图1 )。将引脚放在模具中间的左心室。
- 在37℃下用4%低熔点琼脂糖填充模具,直到心脏完全被覆盖。
- 将模具放在冰上,以更快地硬化琼脂糖,防止组织漂浮。
- 用手术刀从模具中取出含有心室的琼脂糖块。
- 将块颠倒倒置并充满心室和琼脂糖块背面的间隙,由蜕皮的针留下,用4%的低熔点琼脂糖,使用20 G针的注射器。
- 用手术刀修剪琼脂糖块,实现块的平坦底部和心脏顶点的直立位置。
5.切片心脏组织
- 用一滴氰基丙烯酸酯胶将块固定在切片机的样品架上。面向心脏顶点向上。
- 将样品架放入切片机的内部样品室中,该样品室装满冰冷的Tyrode,不含Ca 2+ 。用Tyrode的解决方案完全覆盖琼脂糖块。
- 根据进一步的应用(锋利的电极记录150-200μm)准备厚度为150-400μm的短轴切片,将刀片的振动频率保持在60-70 Hz,并将刀片向前移动尽可能慢。
- 用细毛刷小心地从切片中取出剩余的琼脂糖。
- 轻轻地输r片用巴斯德吸管浸入含有100%O 2的 0.9mM Ca 2+的Tyrode溶液中,并在冰上储存至少30分钟,以从切片程序中回收。
- 然后,在37℃的DMEM中保持切片30分钟,用碳水充气,以便进一步使用之前洗去BDM。
6.准备夏普电极设置
- 在预热之前,在录制开始前30分钟打开所有电器。
- 将3厘米的细胞培养皿放在放置在倒置显微镜上的加热板上。
- 将定制的环形电极( 图2 )放入盘中,并连接前置放大器和刺激电极的接地线。
- 将灌注系统的柔性管连接到盘上。
- 用DMEM填充灌注系统的储存器,用碳水充气。
- 打开灌注泵并设置灌注量te至2-3 mL / min。
- 通过调节流量加热器和加热板将盘中DMEM的温度调节至37°C。
7.行动潜在记录
- 将心室切片放入装有DMEM的盘中。
- 用倒置显微镜检查组织的结构完整性和活力(基于收缩功能)。
- 用3 M KCL填充记录玻璃电极。
- 用DMEM填充刺激电极。
- 将记录电极和刺激电极放在电极支架上。
- 将刺激电极仔细放在切片上并打开电刺激器。以1-2赫兹的刺激频率开始。
- 将记录电极用显微操纵器移动到预期的记录位置。
- 缓慢降低记录电极直到尖端接触组织。
- 应用短矩形电脉冲记录电极穿透细胞膜。
- 仔细重新定位记录电极,直到确保稳定的信号。
- 开始记录动作电位。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
心肌梗死导致心肌细胞几乎不可逆的损失。使用干细胞衍生的心肌细胞进行外源性心脏再生的细胞替代疗法是一种有希望的治疗方法。移植细胞的电气整合和成熟对细胞替代疗法的安全性和效率至关重要。
为了评估整合和成熟,我们将来自表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的诱导多能干细胞(iPSCM; 2次注射0.5×10 6 iPSCM /10μL)的心肌细胞移植到成年小鼠的健康心脏中(参见Peinkofer 等人详细描述方法15 )。移植后6天,使用所述方案制备受体心脏的心室切片。一个代表性的记录显示在图3。将含有移植的iPSCM的切片置于37℃的DMEM中,并通过置于宿主组织中的单极电极进行照射( 图3A ,左侧)。在eGFP阳性移植的iPSCM和切片内的相邻宿主组织中,用填充有3M KCl的尖锐玻璃微电极记录细胞内动作电位( 图3A ,右图)。
可以证明移植的iPSCM在受体心脏中的持续性和电气整合。如果存在刺激伪影和移植心肌细胞中细胞内记录的动作电位的时间相互依赖性,则iPSCM被认为是电气集成的( 图3B )。电气整合的质量可以通过电激活的延迟来量化, 即刺激和时间的延迟e动作电位上行以及没有传导阻滞的最大刺激频率, 即每次刺激后产生1:1动作电位的最大刺激频率。
在该代表性实验中移植的iPSCM是电积分的,如最大刺激频率所示 ,没有大约5Hz的传导阻滞( 图3B ,右),但是偶联质量不如在宿主组织内更好刺激伪影和动作电位上行之间的延迟(宿主组织:8ms; iPSCM:20ms)。宿主心肌细胞的动作电位具有84mV幅度,-74mV最大舒张电位,在50%复极化时11ms持续时间,90%复极化时108ms持续时间和114V / s的上行速度。将刺激频率从1增加到5Hz导致动作电位的降低离子在90%复极化(86毫秒)。移植的iPSCM在动作电位特性上显示出显着的差异。与宿主细胞相比,振幅较小(53mV),最大舒张末期电位较低(-54mV),50%复极化期持续时间增加(14ms),90%复极时间持续时间较短(90ms),上行速度较慢(57 V / s)。刺激频率从1到5Hz的增加导致90%复极化(67ms)的动作电位持续时间的降低。总之,在代表性实例中,在移植后6天,分析的iPSCM显示未成熟心肌细胞的典型特征。这个轶事发现符合统计学上足够数量的细胞和制剂的测量,这些细胞和制剂在15年前报道。
图1: 强力> 定制模具在琼脂糖中嵌入心室。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2: 定制环形电极(接地)用于夏普电极记录。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3: 移植iPSCM的电气整合 。 ( A )含有eGFP阳性iPSCM的心室心脏切片(左)(右)。 SE:刺激电极。红点标记录音的位置。 ( B )在健康的主体组织(上部痕迹)和移植的iPSCM(下面的痕迹)中的动作电位记录。用位于宿主组织中的刺激电极在约2Hz(左侧迹线)和5Hz(右侧迹线)下对切片进行焦点刺激。 请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
心室切片使电生理,药理和机械研究具有体内保留的组织结构,并可将测量技术直接进入心脏的所有区域。已经在胚胎,新生儿和成人切片9,10,11中证明了生理作用潜力。生物活性染色证实切片的活力除了切片程序直接损伤的表层外,其余的活性染色9 。使用尖锐玻璃电极的切片内的动作电位记录可用于研究如本文所述的移植心肌细胞的整合和成熟,或加入心脏活性化合物后的药理学研究。在单个电池中持续一个小时以上的长期录音是可能的。此记录时间足以进行测试通过连续灌注和冲洗,不同药理化合物对一个细胞的影响。
关键准备步骤
为了优化切片质量,应避免缺血组织损伤。因此,使用Tyrode溶液灌注心脏原位 ,快速切除心脏并立即保存在冰冷氧合的Tyrode溶液中被认为是至关重要的。使用2,3-丁二酮单肟固定跳动心脏可进一步降低对局部缺血的易感性,并且固体包埋在低熔点琼脂糖中是必需的。嵌入低熔点琼脂糖可能通过限制扩散阻碍组织供应,但是在切片之前稳定软心脏组织是必不可少的。样品块内的小腔, 例如未充满琼脂糖或剩余气泡的心室,可能会阻碍组织的稳定。不稳定的心肌组织不能提供足够的抵抗力对振动叶片的影响,导致严重的组织破坏和损坏。为了确保清洁切割并尽可能减少组织损伤,刀片应该是锋利的( 即不要重复使用三次以上),并且刀片通过样品块的向前运动应尽可能的慢,因为钝的刀片或超速可能会松动嵌入脑室或撕裂组织。
为了确保可靠和可重现的结果,切片的质量应该满足特定的标准,包括组织的结构完整性,这可以通过显微镜来证实,以及在高达10Hz的生理跳动频率下对电刺激的响应。
根据进一步的应用,切片可以切割成150-400μm的厚度。虽然较薄的切片可以防止组织核心中的缺氧条件,并且允许用荧光显微镜更容易地检测移植的细胞以及更精确地定位记录电极15 ,更厚的切片可以提供组织结构的更好的完整性和组织的更高的稳定性,这对于力测量10和在记录之后的进一步的组织学处理将是有利的。
为了防止高BDM浓度对离子通道和Ca 2+处理蛋白16,17 ,BDM的潜在影响,通过在BDM游离DMEM中孵育切片至少30分钟,推荐进一步使用。令人惊讶的是,BDM冲洗后组织的收缩和随后运动不会妨碍尖锐的电极记录。
限制
与常见的细胞培养模型相比,切片提供完整的组织结构,包括保留的电和机械细胞与细胞连接,细胞外基质和心肌细胞分布天然组织中的非肌细胞和非肌细胞6 。然而,心脏组织切片与体内情况不完全一致,因为它们仅为150-400μm厚,由人工培养基提供并且在制备过程中可能被损坏。台盼蓝染色和活性半胱天冬酶-3和PARP p85片段的免疫组织学评估显示,切片9之外,胚层切片内除表面层之外的细胞是可行的。
传导系统不保留在心室切片中,激光传播在平片中是二维的而不是三维的。来自胚胎心脏的切片在培养物中显示出长达两周的自发性跳动9 。成人切片的自发收缩也可能发生,并且不清楚它们是否被传导系统的细胞诱导,或者可能表示细胞损伤和Ca 2+覆盖oad 18 。
未来的应用
除了具有尖锐电极和微电极阵列的电生理研究之外,其可用于药理学实验以分析药物对动作电位特性和激发扩散的影响11 ,开发研究19或移植心肌细胞的表征如上所示,新生儿心室切片心脏已经用于强制收缩测量10 ,这也可以应用于成人切片。进一步的潜在未来应用包括(I)在培养切片中的长期显微镜研究, 例如评估注射的干细胞来源的心肌细胞的结构整合,(II)注射间隙连接可渗透染料以研究细胞间耦合或(III)内皮细胞研究和血管功能的电晕在片中的ry血管。
总而言之,心室切片是一种有价值的多细胞组织模型,具有保留的体内相似结构,可有助于克服常见细胞培养模型的局限性,适用于广泛的药理学,生理学,发育和细胞治疗研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有任何声明。
Acknowledgments
我们承认研讨会和神经生理学研究所的动物设施提供的支持。这项工作得到了Walter und Marga Boll-Stiftung,KölnFortune和Dezscher Stfung Herzforschung的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
Preparation table | self made | ||
Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).