Summary
Burada, yetişkin farelerden canlı ventriküler dilimlerin hazırlanmasını ve keskin elektrodun hareket potansiyel kayıtları için kullanımlarını açıklıyoruz. Bu çok hücreli müstahzarlar , in vitro olarak elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar için değerli bir model oluşturan, korunmuş bir in vivo doku yapısı sağlar.
Abstract
Fare kardiyomiyositleri , in vitro kardiyak fizyoloji çalışmaları ve yeni tedavi stratejileri için yoğun şekilde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, ayrışmış kardiyomiyositlerin çok hücreli preparatları, kalbin hem mekanik hem de elektrofizyolojik özelliklerini etkileyen kardiyomiyositlerin, miyositlerin ve hücre dışı matrisin in vivo yapısının kompleksini temsil etmez. Burada, korunmuş in vivo doku yapısı ile yetişkin fare kalplerindeki canlı ventriküler dilimleri hazırlamak için bir teknik ve elektrofizyolojik kayıtlara uygunluğunu göstermek için bir teknik açıklanmaktadır. Kalbin eksizyonundan sonra, ventriküller atriyumdan ayrılır, 2,3-butandion monoksim içeren Ca2 + içermeyen çözelti ile perfüzyonlanır ve% 4'lük düşük eriyikli agaroz blok içine gömülür. Blok titreşen bir bıçakla mikrotom üzerine yerleştirilir ve 150-400 μm kalınlığa sahip doku dilimleri titreşimi serbest bırakarak hazırlanır60 Hz'de bıçak sıklığı ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirerek. Dilimlerin kalınlığı diğer uygulamalara bağlıdır. Dilimler buz soğukluğundaki Tyrode çözeltisinde 0.9 mM Ca 2+ ve 2,3-butandion monoksim (BDM) ile 30 dakika süreyle saklanır. Ardından, BDM'yi yıkamak için dilimler 37 ° C DMEM'ye 30 dakika boyunca aktarılır. Dilimler, kesici elektrodlar veya mikro elektrot dizileri ile elektrofizyolojik çalışmalar için, kontraktil fonksiyonu analiz etmek için güç ölçümleri için veya nakledilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin ve konakçı doku arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Keskin elektrot kayıtları için, bir dilim, ters çevrilmiş mikroskopun ısıtma plakasındaki 3 cm'lik hücre kültürü çanağına yerleştirilir. Dilim bir tek kutuplu elektrot ile uyarılır ve dilim içindeki kardiyomiyositlerin hücre içi eylem potansiyelleri keskin bir cam elektrot ile kaydedilir.
Introduction
Yamamot ve Mcllwain 1966'da beyin dilimlerinin elektriksel aktivitesinin in vitro muhafaza edildiğini gösterdiklerinden beri temel bilimde ince doku dilimleri sıklıkla kullanılmıştır. O zamandan beri, beyin 2 , karaciğer 3 , akciğer 4 ve miyokard dokusu 5 , 6 , 7 dilimleri üzerinde elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalar yürütülmüştür. Yenidoğan sıçan kalplerindeki ventriküler dilimlerde ilk yama-kelepçe kayıtları 1990'da 8'de tanımlanmıştır, ancak bu teknik bir süre unutulmaya uğradı. Birkaç yıl sonra grubumuz, fare embriyonik 9 , neonatal 10 ve erişkin 11 kalp dilimlerini hazırlamak için yeni bir yöntem geliştirdi. Bu canlı doku dilimleri akut deneyler için kullanılabilir (erişkin dilimS birkaç saat ekilebilir) veya kısa vadeli kültür deneyleri (embriyonik ve yenidoğan dilimleri birkaç gün boyunca yetiştirilebilir). Kesitler elektrofizyolojik özelliklere benzer şekilde in vivo olarak gösterirler ve keskin elektrot aksiyon potansiyeli ve mikro elektrot dizisi kayıtları ile değerlendirildiğinde homojen bir uyarılma yayılır 11 . "İki boyutlu" morfolojilerinden dolayı kayıt elektrotlarının ventrikülün tüm bölgelerine doğrudan erişmelerine izin veriyorlar, bu da elektrofizyolojik araştırmalar için ilginç bir araç haline getiriyor ve Langendorff tarafından perfüze edilmiş kalpler ile karşılaştırıldığında yeni deneysel seçenekler getiriyor. Dilimlerin verapamil (L-tipi Ca2 + -kanal bloke edicisi), lidokain (Na + -kanal bloke edicisi), 4-aminopiridin (seçici olmayan voltaja bağımlı K + -kanal bloke edici) ve linopirdin (KCNQ K) gibi ilaçların iyon tutucu etkisi + -kanal bloke edici) 9 , 11 in vitro bir doku modeli olarak uygun olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kesici elektrot kayıtları ile birlikte alıcı kalplerin ventriküler dilimleri, transplanted fetal 12 , 13 , 14 ve kök hücre kaynaklı 15 kardiyomiyositlerin olgunlaşması yanı sıra elektriksel ve mekanik entegrasyonu karakterize etmek için çok yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Özetle, ventriküler dilimler değerli ve iyi kurulmuş bir çok hücreli doku modeli olup ayrışmış kardiyomiyositleri ve Langendorff perfüze edilen kalpler için tamamlayıcı olarak düşünülmelidir(Dissociated hücrelere karşıt olarak) bir in vivo benzeri doku yapısı sağlamanın yanı sıra keskin elektrot kayıtları gibi (kalp preparatlarının aksine) kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişim sağlayan en büyük avantajı olan kardiyovasküler araştırmalardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanların taşınması, yerel hayvan refahı komitesinin ve Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63 / AB sayılı Direktifinin kurallarına uymalıdır.
1. Çözümleri Hazırlama
- Tyrode'nin solüsyonunu Ca 2+ olmadan (mM'de kompozisyon) hazırlayın: NaCI 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, 2,3-butandion monoksim (BDM) 30. pH'ı 7.4'e ayarlayın NaOH ile 4 ° C'de.
- Tyrode çözeltisini Ca 2+ (bileşim mM cinsinden) ile hazırlayın: NaCl 136, KCl 5.4, NaH2PO4.33, MgCl2, glikoz 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9. 4 ° C'de NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- % 4 düşük eriyikli agaroz hazırlayın: Ca 2+ içermeyen 0.6 mL düşük eriyikli agaroz 15 mL Tyrode çözeltisine koyun. Karışımı, bir mikrodalga fırında iki kez 750 W'de 10-15 saniye boyunca, agaroz çözünene kadar ısıtın. Çözeltiyi 37 ° C'de sabit bir sıcaklıkta tutun.# 176; C ve sürekli karıştırın.
- Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamını (DMEM) 37 ° C'de serum olmadan carbogen (% 5 CO 2 ,% 95 O 2 ) ile kabarcıklarken muhafaza edin.
2. Microtome'u hazırlayın
- Mikrogramı açın.
- Dış mikrotom hücresini buzla doldurun.
- İç mikrotom bölmesini, Ca 2+ içermeyen soğuk Tyrode çözeltisi ile doldurun ve çözeltiyi% 100 O 2 ile sürekli olarak oksijene koyun.
- Mikro topuzun bıçak tutucusuna bir çelik bıçak takın.
3. Fare Kalp İzolasyonu
- 2,500 U Heparin'i subkütan enjekte edin. 15 dakika bekleyin.
- Hayvanı servikal dislokasyon ile kurban edin.
- Sternotomi ile göğsünü açın.
- Küçük makas ve bir forseps # 5 kullanarak perikardı dikkatle inceleyin.
- Artan aortaya bir kanül yerleştirin ve koroner arterleri buz gibi soğuk Tyrode'lerle in situ olarak perfüze edinKalan kan alınana kadar Ca 2+ içermeyen bir solüsyon.
- Kalbi bir forseps ve makasla hafifçe kesip kalbi buz soğukluğunda transfer edin Tyrode'nin çözümü Ca 2+ olmadan sürdü.
- Atriyumu ventriküllerden bir neşter veya makasla ayırın.
4. Ventriküllerin% 4 Düşük Erime Agaroza Katılması
- Ventrikülleri, tepe kısmı yukarı bakacak şekilde agaroz kalıbına yerleştirin ( Şekil 1 ). Pimi sol ventriküler bölmedeki kalıbın ortasına yerleştirin.
- Kalıbı, kalp tamamen kaplanıncaya kadar 37 ° C'de% 4 düşük eriyikli agaroz ile doldurun.
- Agarozun daha hızlı sertleşmesi için kalıbı buz üzerinde bırakın, dokunun yüzmesini önleyin.
- Ventrikül içeren agaroz bloğu bir bistül ile kalıptan çıkarın.
- Bloğu ters çevirin ve ventriküler odaları ve agaroz bloğun arkasındaki boşluğu doldurun;20 G'lik bir iğneli bir şırınga kullanarak% 4 düşük eriyikli agaroz ile moltun iğnesi bıraktı.
- Blok düz bir alt ve kalp apeksinin dik pozisyonunu elde etmek için agaroz bloğu bir neşter ile kesin.
5. Ventriküler Doku Dilimleme
- Bir damla cyanoacrylate tutkalı ile mikrotomun numune tutucusundaki bloğu sabitleyin. Kardiyak üstü yukarı bakacak şekilde tasarlayın.
- Örnek tutucuyu, Ca 2+ içermeyen buz gibi soğuk Tyrode ile dolu mikrotomun iç numune bölmesine yerleştirin. Tyrode'nin çözeltisiyle agaroz bloğu tamamen örtün.
- Diğer uygulamalara (keskin elektrot kayıtları 150-200 μm için) bağlı olarak 150-400 μm kalınlığında kısa eksen dilimleri hazırlayın, bıçağın titreşim frekansı 60-70 Hz'de tutun ve bıçağı mümkün olduğunca yavaş ileri hareket ettirin .
- Kalan agarozu dilimlerden dikkatlice çıkarmak için ince bir fırça kullanın.
- Nazikçe gönderR dilimleri,% 0.9 O 2 ile havalandırılan 0.9 mM Ca 2 + ile Tyrode solüsyonuna bir Pasteur pipet ile dilimleme prosedüründen kurtulmak için buz üzerinde en az 30 dakika saklayın.
- Ardından, daha fazla kullanılmadan önce BDM'yi yıkamak için 30 dakika süreyle DMEM'de 37 ° C'de dilimler bırakın, karbogenle havalandırın.
6. Keskin Elektrot Kurulumunun Hazırlanması
- Ön ısıtma için, kayıtların başlamasından 30 dakika önce tüm elektrikli cihazları açın.
- Ters çevrilmiş mikroskopta yer alan ısıtma plakasına 3 cm'lik hücre kültürü kabı koyun.
- Özel yapım halka elektrotunu ( Şekil 2 ) çanağa yerleştirin ve ön amplifikatörün ve stimülasyon elektrodunun topraklama kablolarını bağlayın.
- Perfüzyon sisteminin esnek borularını çanağa bağlayın.
- Perfüzyon sisteminin rezervuarını karbogen ile havalandırılmış DMEM ile doldurun.
- Perfüzyon pompasını açın ve perfüzyon rafini ayarlayın2-3 mL / dk'ya kadar ısıtıldı.
- Akış ısıtıcısını ve ısıtma plakasını düzenleyerek çanak içindeki DMEM sıcaklığını 37 ° C'ye ayarlayın.
7. İşlem Potansiyel Kayıtları
- DMEM dolu tabağa bir ventriküler dilim yerleştirin.
- Ters çevrilmiş mikroskop ile yapının yapısal bütünlüğünü ve yaşayabilirliğini kontrol edin (kontraktil fonksiyona dayanmaktadır).
- Bir kayıt cam elektrodu 3 M KCL ile doldurun.
- Bir uyarılma elektrotunu DMEM ile doldurun.
- Kayıt elektrodunu ve stimülasyon elektrodunu elektrot tutucularının üzerine yerleştirin.
- Uyarı elektrodunu dilim üzerine dikkatle yerleştirin ve elektrik stimülatörünü açın. 1-2 Hz'lik bir stimülasyon frekansı ile başlayın.
- Kayıt elektrodunu mikromanipülatör ile istenen kayıt pozisyonunun üzerine getirin.
- İpucu dokuya dokunana kadar kayıt elektrodunu yavaşça indirin.
- Şebekeden kısa dikdörtgen elektrik darbesi uygulayın.Kayıt elektrotu hücre zarı içine nüfuz eder.
- Kayıt elektrodunu kararlı bir sinyal gelene kadar dikkatlice yeniden konumlandırın.
- Aksiyon potansiyellerinin kaydını başlatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Miyokard enfarktüsü kardiyomiyositlerin neredeyse geri döndürülemez bir kaybına yol açar. Eksojen kardiyak rejenerasyon için kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri kullanarak hücre replasman tedavisi umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Transplante hücrelerin elektriksel entegrasyonu ve olgunlaşması, hücre replasman tedavisinin güvenilirliği ve etkinliği için çok önemlidir.
Entegrasyon ve olgunlaşmayı değerlendirmek için yetişkin farelerin sağlıklı kalplerine arttırılmış yeşil flüoresan proteini (eGFP) eksprese eden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen kardiyomiyositleri (iPSCM; 0.5 x 10 6 iPSCM / 10 uL'lik 2 enjeksiyon) nakledildik (bkz. Peinkofer et al. Yöntemlerin ayrıntılı açıklaması için 15 ). Transplantasyondan altı gün sonra, tarif edilen protokol kullanılarak alıcı kalplerin ventriküler dilimleri hazırlandı. Temsili bir kayıt,Şekil 3. Nakledilmiş iPSCM içeren bir dilim, 37 ° C'de DMEM içine yerleştirildi ve konakçı dokuya yerleştirilen bir tek kutuplu elektrot tarafından fokal olarak stimüle edildi ( Şekil 3A , solda). Hücre içi aksiyon potansiyelleri, eGFP pozitif nakledilmiş iPSCM'de komşu konakçı dokuda 3 M KCl ile dolu keskin cam mikroelektrodlarla kaydedildi ( Şekil 3A , sağ).
Transplante iPSCM'nin alıcı kalplerdeki kalıcılığı ve elektriksel entegrasyonu gösterilebilir. Uyarılma eserlerinin geçici etkileşimleri ve aksiyon potansiyelleri nakledilen kardiyomiyositlerde hücre içinde kaydedilmişse, iPSCM elektriksel olarak entegre edilmiş olarak kabul edilmiştir ( Şekil 3B ). Elektriksel entegrasyonun kalitesi, elektriksel aktivasyonun ertelenmesi ile nicelendirilebilir, yani , uyarı ve başlama arasındaki gecikmeE hareket potansiyeli artışı ve iletim blokları olmaksızın maksimum uyarılma frekansı, yani her uyarıdan sonra aksiyon potansiyellerinin 1: 1'lik bir üretime götüren maksimal uyarım frekansı.
Bu temsilci deneyinde nakledilen iPSCM, yaklaşık 5 Hz'lik iletim blokları olmaksızın maksimum uyarılma frekansı ile gösterildiği gibi ( Şekil 3B , sağda) elektriksel olarak entegre edildi, ancak bağlanma kalitesi, konakçı dokudaki kadar uzun değildi Uyarılma eseri ve aksiyon potansiyeli yukarı vuruşu arasındaki gecikme (konukçu dokusu: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Ev sahibi kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyelleri, 84 mV amplitüd, -74 mV maksimal diyastolik potansiyel,% 50 repolarizasyonda 11 ms süre,% 90 repolarizasyonda 108 ms süre ve 114 V / s'lik bir iniş hızı idi. Uyarım sıklığını 1 ila 5 Hz artıracak olursak, aksiyon potansiyelinde azalma olurIyon% 90 repolarizasyonda (86 ms). Nakledilen iPSCM, aksiyon potansiyel özelliklerinde önemli farklılıklar göstermiştir. Konukçu hücrelere kıyasla genlik daha küçük (53 mV), maksimum diyastolik potansiyel daha az negatif (-54 mV),% 50 repolarizasyonda artış süresi (14 ms),% 90 repolarizasyon süresi daha kısa (90 ms) ve yukarı doğru hız Daha yavaş (57 V / s). Uyarı frekansında 1 ila 5 Hz'lik bir artış, aksiyon potansiyelinin% 90'lık repolarizasyonda (67 ms) azalmasına neden oldu. Sonuç olarak, nakil sonrası 6 gün içinde bu temsili örnekte, analiz edilen iPSCM, olgunlaşmamış kardiyomiyositlerin tipik özelliklerini göstermiştir. Bu anekdot bulgusu, istatistiksel olarak yeterli sayıda hücredeki ve preparatların ölçümleri ile uyumludur ve bunlar 15 yaşından önce bildirilmiştir.
Şekil 1: Strong> Agarozda Ventriküller Gömmek için Özel Yapılan Kalıp. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Keskin Elektrot Kayıtları için özel yapılmış Halka Elektrot (toprak). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Transplante iPSCM'nin Elektrik Entegrasyonu . ( A ) eGFP pozitif iPSCM'yi içeren ventriküler kalp dilimi (sol) (sağda). SE:Uyarma elektrodu. Kırmızı noktalar kayıtların yerini işaretler. ( B ) Sağlıklı konak dokusunda (üst izler) ve nakledilen iPSCM'de (alt izler) potansiyel kayıtlar. Dilim, konakçı dokuya yaklaşık 2 Hz (sol izler) ve 5 Hz (sağ izler) yerleştirilen bir uyarılma elektrotu ile fokal olarak uyarıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ventriküler dilimler, korunmuş bir in vivo doku yapısı ve ölçme teknolojisinin kalbin tüm bölgelerine doğrudan erişimi ile elektrofizyolojik, farmakolojik ve mekanik çalışmalara olanak tanır. Fizyolojik aksiyon potansiyel özellikleri embriyonik, neonatal ve erişkin dilimlerde gösterilmiştir 9,10,11. Dilimleme işlemi ile doğrudan hasar gören yüzey tabakaları haricindeki dilimlerin canlılığı, canlılık boyaması ile teyit edilmiştir 9 . Burada açıklandığı gibi transplanted kardiyomiyositlerin entegrasyonunu ve olgunlaşmasını araştırmak veya kardiyoaktif bileşikler ilave edildikten sonra farmakolojik araştırmalar yapmak için, keskin cam elektrotlar kullanarak dilimler içerisinde etki potansiyel kayıtları kullanılabilir. Tek bir hücrede bir saat veya daha fazla süreyle uzun süreli kayıtlar yapmak mümkündür. Bu kayıt süresi test etmek için yeterlidirArdışık perfüzyon ve yıkama ile farklı farmakolojik bileşiklerin bir hücredeki etkisi.
Kritik hazırlık adımları
Dilim kalitesini optimize etmek için iskemik doku hasarından kaçınılmalıdır. Bu nedenle kalbin in situ Tyrode çözeltisiyle perfüzyonu, hızlı kalp rezeksiyonu ve buz soğukluğunda oksitlenmiş Tyrode çözeltisinde derhal korunması hayati öneme sahiptir. Dövülmekte olan kalbe 2,3-butandion monoksim kullanılarak immobilizasyon, iskemiye duyarlılığı daha da azaltabilir ve düşük erimezli agarozda sağlam bir gömme için gereklidir. Düşük erimezli agaroz içine gömülmesi, difüzyonu sınırlayarak doku arzını engelleyebilir, ancak dilimlenmeden önce yumuşak kalp dokusunu stabilize etmek için gereklidir. Örnek bloğundaki küçük oyuklar, örneğin tamamen agarozla dolu olmayan veya hava kabarcıkları olmayan ventriküler odalar doku stabilizasyonunu engelleyebilir. Kararsız miyokard dokusu yeterince direnç göstermezTitreşim yapan bıçağa takılır ve bu da şiddetli doku bozulmasına ve hasar görmesine neden olur. Net bir kesim sağlamak ve doku hasarını en aza indirgemek için bıçaklar keskin olmalıdır ( yani üç defadan fazla kullanılmaz) ve bıçağın örnek bloğundan ileri doğru hareketi olabildiğince yavaş olmalıdır, aksi halde sıkıcı bıçaklar veya aşırı hızlanma, gevşetebilir Gömülü ventriküller veya dokuyu yırtıklar.
Kesitlerin kalitesi, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için mikroskop ile teyit edilebilen dokunun yapısal bütünlüğü de dahil olmak üzere belirli kriterleri ve 10 Hz'ye kadar fizyolojik dayak frekanslarında elektriksel uyarıya yanıt vermelidir.
Dilimler daha fazla uygulamaya bağlı olarak 150-400 μm kalınlığında kesilebilir. İnce dilimler doku çekirdeğinde hipoksik koşulları önleyebilir ve bir floresan mikroskop ile nakledilen hücrelerin daha kolay tespit edilmesine ve daha kesin bir konuma getirilmesine izin verirKayıt elektrotları 15 , kalın dilimler doku yapısının daha iyi bütünlüğünü ve dokunun daha yüksek stabilitesini sağlayabilir ve bu da kuvvet ölçümleri 10 için ve kayıtlardan sonraki histolojik işleme avantajlı olacaktır.
Yüksek BDM konsantrasyonlarının iyon kanalları ve Ca 2+ işleme proteinleri 16 , 17 üzerinde potansiyel etkilerini önlemek için, BDM içermeyen DMEM dilimlerinin daha fazla kullanılmadan önce en az 30 dakika inkübe edilmesiyle BDM yıkanması önerilir. Şaşırtıcı bir şekilde, BDM yıkamadan sonra dokunun daralması ve bundan sonra hareketi keskin elektrot kayıtlarını engellemez.
Sınırlamalar
Genel hücre kültürü modellerinin aksine dilimler, korunmuş elektriksel ve mekanik hücre-hücre bağlantıları, hücre dışı matrisler ve kardiyomiyosit dağılımı gibi sağlam bir doku yapısı sağlarTes ve non-myocytes'leri yerli doku içinde 6 . Bununla birlikte, kardiyak doku dilimleri yapay ortam tarafından sağlanan ve hazırlanma işlemi sırasında zarar görebilecekleri yalnızca 150-400 μm kalınlığa sahip oldukları için in vivo durumla tam olarak uyuşmamaktadır. Aktif kaspaz-3 ve PARP p85 fragmanının tripan mavisi boyaması ve immünohistolojik değerlendirmesi, embriyonik dilimlerin içindeki hücrelerin, yüzey katmanları dışındaki hücrelerin 9 dilimlemeden sonra canlı olduğunu ortaya koymuştur.
İletim sistemi ventriküler dilimlerde korunmaz ve uyarı yayılımı düz dilimlerde üç boyutlu değil iki boyutludur. Embriyonik kalplerdeki dilimler, kültürde iki haftaya kadar kendiliğinden dayak göstermektedir 9 . Yetişkin dilimlerin spontan kontraksiyonları da ortaya çıkabilir ve iletim sisteminin hücreleri tarafından indüklenip açılmadığı veya hücre hasarını ve Ca2 + örtüsünü gösterebilir mi belli değil18 .
Gelecekteki uygulamalar
İlacın etki potansiyelleri ve uyarılma yayılımı 11 , gelişimsel çalışmalar 19 veya transplante kardiyomiyositlerin 15 karakterizasyonu üzerine ilaçların etkilerini analiz etmek için farmakolojik deneyler için kullanılabilen keskin elektrotlar ve mikro elektrot dizileri ile elektrofizyolojik çalışmaların yanı sıra, yukarıda gösterildiği gibi, yenidoğanın ventriküler dilimleri Kalpler, yetişkin dilimlerine de uygulanabilen 10 kuvvet büzülme ölçümleri için kullanılmıştır. (I) enjekte edilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal entegrasyonunu değerlendirmek için, (II) incelenen hücre içi bağlaşımı için boşluk birleşim geçirgen boyaların enjeksiyonu veya (III) endotelyal çalışmalara ilişkin çalışmalar gibi ek potansiyel gelecekteki uygulamalar arasında, (I) ekili dilimlerde uzun vadeli mikroskopi çalışmaları bulunmaktadır Korona vasküler fonksiyonlarıDilim içindeki gemiler.
Sonuç olarak, ventriküler dilimler, ortak hücre kültürü modellerinin kısıtlılıklarının üstesinden gelmeye yardımcı olabilen ve farmakolojik, fizyolojik, gelişimsel ve hücre tedavisi çalışmalarının geniş bir yelpazesine uygulanabilen, in vivo benzer yapıda korunmuş, değerli bir çok hücreli doku modellidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalıştaylar ve Nörofizyoloji Enstitüsünün hayvan tesisi tarafından sağlanan desteği onaylıyoruz. Bu çalışma Walter und Marga Boll Stiftung, Köln Fortune ve Deutsche Stiftung für Herzforschung tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
