Summary
Aqui, descrevemos a preparação de fatias ventriculares viáveis de camundongos adultos e seu uso para gravações de potencial de ação de eletrodos afiados. Essas preparações multicelulares proporcionam uma estrutura de tecido in vivo preservada, o que os torna um modelo valioso para estudos eletrofisiológicos e farmacológicos in vitro .
Abstract
Os cardiomiócitos murinos têm sido amplamente utilizados para estudos in vitro de fisiologia cardíaca e novas estratégias terapêuticas. No entanto, as preparações multicelulares de cardiomiócitos dissociados não são representativas da estrutura complexa in vivo de cardiomiócitos, não miocitos e matriz extracelular, que influencia as propriedades mecânicas e eletrofisiológicas do coração. Aqui descrevemos uma técnica para preparar fatias ventriculares viáveis de corações de mouse adultos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e demonstrar sua adequação para gravações eletrofisiológicas. Após a excisão do coração, os ventrículos são separados dos átrios, perfundidos com solução livre de Ca2 + contendo monoxime de 2,3-butanodiona e incorporados em um bloqueio de agarose com baixo teor de fusão a 4%. O bloco é colocado em um microtomo com uma lâmina vibratória, e fatias de tecido com uma espessura de 150-400 μm são preparadas mantendo a vibração freDa lâmina a 60-70 Hz e movendo a lâmina para a frente o mais lentamente possível. A espessura das fatias depende da aplicação adicional. As fatias são armazenadas na solução de Tyrode gelada com Ca2 + 0,9 mM e monoxime de 2,3-butanodiona (BDM) durante 30 min. Depois, as fatias são transferidas para DMEM a 37 ° C durante 30 min para lavar o BDM. As fatias podem ser usadas para estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados ou arrays de microeletrodos, para medidas de força para analisar a função contrátil ou para investigar a interação de cardiomiócitos derivados de células estaminais transplantadas e tecido hospedeiro. Para gravações de eletrodos afiados, uma fatia é colocada em um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento de um microscópio invertido. A fatia é estimulada com um eletrodo unipolar, e os potenciais de ação intracelular de cardiomiócitos dentro da fatia são registrados com um eletrodo de vidro afiado.
Introduction
As fatias de tecido fino têm sido utilizadas com freqüência na ciência básica, uma vez que Yamamot e Mcllwain mostraram em 1966 que a atividade elétrica de fatias de cérebro é mantida in vitro 1 . Desde então, estudos eletrofisiológicos e farmacológicos foram realizados em fatias do cérebro 2 , fígado 3 , pulmão 4 e tecido miocárdico 5 , 6 , 7 . As primeiras gravações de patch-clamp em fatias ventriculares de corações de ratos neonatais foram descritas em 1990 8 , mas essa técnica caiu no esquecimento por algum tempo. Mais de uma década depois, nosso grupo estabeleceu um novo método para preparar as fatias de coração de embrião murino 9 , neonatal 10 e adulto 11 . Estas fatias de tecido viáveis podem ser usadas para experiências agudas (fatias adultasS podem ser cultivadas por várias horas) ou experiências culturais de curto prazo (fatias embrionárias e neonatais podem ser cultivadas por alguns dias). As fatias mostram in vivo como características eletrofisiológicas e uma dispersão de excitação homogênea conforme avaliado pelo potencial de ação de eletrodo afiado e gravações de microeletrodos 11 . Devido à sua morfologia "bidimensional", eles permitem o acesso direto dos eletrodos de gravação a todas as regiões do ventrículo, o que os torna uma ferramenta interessante para investigações eletrofisiológicas e levanta novas opções experimentais em comparação com os corações inteiros de perfumes de Langendorff. A resposta ao fármaco das fatias aos bloqueadores dos canais iônicos, como o verapamil (bloqueador de canal Ca 2+ ), lidocain (bloqueador de canais de Na + ), 4-aminopiridina (bloqueador de canal K + não -seletivo dependente da tensão) e linopirdina (KCNQ K + -Bloqueador de canal) 9 , 11 10 . Esses achados demonstraram que as fatias ventriculares murinas são adequadas como um modelo de tecido in vitro para estudos fisiológicos e farmacológicos. Além disso, as fatias ventriculares de corações receptores em combinação com gravações afiadas de eletrodos provaram ser uma ferramenta muito útil para caracterizar a integração elétrica e mecânica, bem como a maturação dos 12 cardiomiócitos transplantados 12 , 13 , 14 e derivados de células-tronco.
Em resumo, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso e bem estabelecido e devem ser consideradas complementares a cardiomiócitos dissociados e corações perfundidos por LangendorffNa pesquisa cardiovascular, com a principal vantagem de fornecer uma estrutura de tecido in vivo (em contraste com células dissociadas), bem como acesso direto de tecnologias de medição, como gravações de eletrodos afiados para todas as regiões do coração (em contraste com preparações de coração inteiro).
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Protocol
O manuseio de animais deve ser conforme às diretrizes do comitê local de bem-estar animal e à Diretiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu.
1. Prepare Soluções
- Preparar a solução de Tyrode sem Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butanodiona monoxime (BDM) 30. Ajustar o pH para 7,4 Com NaOH a 4 ° C.
- Preparar a solução de Tyrode com Ca 2+ (composição em mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH a 4 ° C.
- Prepare 4% de agarose com baixo teor de fusão: Coloque 0.6 g de agarose com baixo teor de fusão em 15 mL de solução de Tyrode sem Ca 2+ . Aqueça a mistura em um forno de microondas duas vezes a 750 W por 10-15 s até que a agarose seja dissolvida. Mantenha a solução a uma temperatura constante de 37 &# 176; C e mexa continuamente.
- Mantenha o Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) sem soro a 37 ° C com borbulhante com 5% de CO 2 , 95% de O2).
2. Prepare o Microtome
- Ligue o microtome.
- Encha a câmara externa do microtomo com gelo.
- Preencha a câmara interna do microtomo com solução de Tyrode gelada sem Ca 2+ e oxigene continuamente a solução com 100% de O2.
- Coloque uma lâmina de aço no suporte da lâmina do microtomo.
3. Isolamento do coração do mouse
- Injete 2,500 U de heparina por via subcutânea. Aguarde 15 min.
- Sacrifique o animal pela luxação cervical.
- Abra o tórax por esternotomia.
- Dispare cuidadosamente o pericárdio usando pequenas tesouras e uma pinça # 5.
- Inserir uma cânula na aorta ascendente e perfundir as artérias coronárias in situ com o gelo TyrodeSolução sem Ca 2 + até o sangue restante ser removido.
- Respete suavemente o coração com uma pinça e uma tesoura e transfira o coração na solução gelada de Tyrode montada sem Ca 2+ .
- Separe os átrios dos ventrículos com um bisturi ou uma tesoura.
4. Incorporação dos Ventrículos em 4% de Agarose com baixo ponto de fusão
- Coloque os ventrículos com o ápice voltado para cima no molde de agarose ( Figura 1 ). Coloque o pino no meio do molde na câmara ventricular esquerda.
- Encha o molde com 4% de agarose de baixo teor de fusão a 37 ° C, até que o coração esteja completamente coberto.
- Coloque o molde no gelo para um endurecimento mais rápido da agarose, evitando a flutuação do tecido.
- Remova o bloco de agarose contendo os ventrículos do molde com um bisturi.
- Gire o bloco de cabeça para baixo e cubra as câmaras ventriculares e o espaço na parte traseira do bloco de agarose, que euS deixado pelo pino da muda, com 4% de agarose de baixo teor de fusão usando uma seringa com uma agulha de 20 G.
- Corte o bloco de agarose com um bisturi para conseguir um fundo plano do bloco e posição vertical do ápice cardíaco.
5. Cortando o tecido ventricular
- Corrija o bloco no suporte de amostra do microtome com uma gota de cola de cianoacrilato. Enfrente o ápice cardíaco para cima.
- Coloque o suporte de amostra na câmara de amostra interna do microtomo, que é preenchido com Tyrode gelado sem Ca 2+ . Cubra completamente o bloco de agarose com a solução de Tyrode.
- Prepare fatias de eixos curtos com uma espessura de 150-400 μm, dependendo da aplicação adicional (para gravações de eletrodos afiados de 150-200 μm), mantenha a freqüência de vibração da lâmina a 60-70 Hz e mova a lâmina para frente o mais rápido possível .
- Use uma escova fina para remover cuidadosamente a agarose restante das fatias.
- Gentilmente transfeR fatiga com uma pipeta Pasteur na solução de Tyrode com Ca2 + 0,9 mM arejado com 100% de O2 e armazená-los durante pelo menos 30 minutos em gelo para recuperar do processo de corte.
- Depois, mantenha as fatias durante 30 min em DMEM a 37 ° C, arejado com carbógeno, para lavar o BDM antes de continuar a usar.
6. Preparando a Configuração do Eletrodo Sharp
- Para pré-aquecimento, ligue todos os dispositivos elétricos 30 min antes do início das gravações.
- Coloque um prato de cultura de células de 3 cm na placa de aquecimento colocada no microscópio invertido.
- Coloque o eletrodo de anel personalizado ( Figura 2 ) no prato e conecte os fios de aterramento do pré-amplificador e o eletrodo de estimulação.
- Ligue os tubos flexíveis do sistema de perfusão ao prato.
- Encha o reservatório do sistema de perfusão com DMEM, arejado com carbógeno.
- Ligar a bomba de perfusão e ajustar a perfusãoA 2-3 mL / min.
- Ajuste a temperatura do DMEM no prato a 37 ° C, regulando o aquecedor de fluxo e a placa de aquecimento.
7. Gravações de Ação Potencial
- Coloque uma fatia ventricular no prato cheio de DMEM.
- Verifique a integridade estrutural e a viabilidade (com base na função contrátil) do tecido com o microscópio invertido.
- Preencha um eletrodo de vidro de gravação com KCL de 3 M.
- Preencha um eletrodo de estimulação com DMEM.
- Coloque o eletrodo de gravação e o eletrodo de estimulação nos suportes dos eléctrodos.
- Coloque o eletrodo de estimulação cuidadosamente na fatia e ligue o estimulador elétrico. Comece com uma frequência de estimulação de 1-2 Hz.
- Mova o eletrodo de gravação com o micromanipulador sobre a posição de gravação pretendida.
- Abaixe lentamente o eletrodo de gravação até a ponta tocar o tecido.
- Aplique um curto impulso elétrico retangular através doGravação de eletrodo para penetrar a membrana celular.
- Desconexe cuidadosamente o eletrodo de gravação até garantir um sinal estável.
- Comece a gravar os potenciais de ação.
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Representative Results
O infarto do miocárdio leva a uma perda praticamente irreversível de cardiomiócitos. A terapia de reposição celular com cardiomiócitos derivados de células estaminais para regeneração cardíaca exógena é uma abordagem terapêutica promissora. A integração e a maturação elétrica das células transplantadas são cruciais para a segurança e eficiência da terapia de reposição celular.
Para avaliar a integração e maturação, transplantamos cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCM, 2 injeções de 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) expressando proteína fluorescente verde melhorada (eGFP) em corações saudáveis de camundongos adultos (ver Peinkofer et al. Para uma descrição detalhada dos métodos 15 ). Seis dias após o transplante, as fatias ventriculares dos corações receptores foram preparadas usando o protocolo descrito. Uma gravação representativa é mostrada emFigura 3. Uma fatia contendo iPSCM transplantado foi colocada em DMEM a 37 ° C e estimulada focalmente por um eletrodo unipolar colocado no tecido hospedeiro ( Figura 3A , esquerda). Os potenciais de ação intracelular foram registrados com microeletrodos de vidro afiados preenchidos com KCl 3 M em iPSCM transplantado de eGFP positivo e tecido hospedeiro vizinho dentro das fatias ( Figura 3A , direita).
A persistência ea integração elétrica de iPSCM transplantado em corações receptores poderiam ser demonstradas. O iPSCM foi considerado eletricamente integrado, se uma interdependência temporal de artefatos de estimulação e potenciais de ação registrados intracelularmente em cardiomiócitos transplantados estava presente ( Figura 3B ). A qualidade da integração elétrica pode ser quantificada pelo atraso da ativação elétrica, ou seja , o atraso entre o estímulo e o início do processo.Ataque de potencial de ação e a freqüência de estimulação máxima sem blocos de condução, ou seja , a freqüência de estimulação máxima que leva a uma geração de potenciais de ação de 1: 1 após cada estímulo.
O iPSCM transplantado neste experimento representativo foi eletricamente integrado, como indicado por uma freqüência de estimulação máxima sem blocos de condução de cerca de 5 Hz ( Figura 3B , direita), mas a qualidade do acoplamento não foi tão boa quanto dentro do tecido hospedeiro conforme indicado pelo longo Atraso entre artefato de estimulação e aumento de ação potencial (tecido do hospedeiro: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Os potenciais de ação dos cardiomiócitos hospedeiros tiveram amplitude de 84 mV, potencial diastólico máximo de -74 mV, duração de 11 ms com repolarização de 50%, duração de 108 ms com repolarização de 90% e velocidade de movimento ascendente de 114 V / s. Aumentar a freqüência de estimulação de 1 a 5 Hz leva a uma diminuição do potencial de ação duratIon em 90% de repolarização (86 ms). O iPSCM transplantado mostrou diferenças significativas nas propriedades de potencial de ação. Em comparação com as células hospedeiras, a amplitude foi menor (53 mV), potencial diastólico máximo menos negativo (-54 mV), duração a 50% de aumento de repolarização (14 ms), duração a 90% de repolarização menor (90 ms) e velocidade ascendente Mais lento (57 V / s). Um aumento na frequência de estimulação de 1 a 5 Hz causou uma diminuição da duração do potencial de ação em 90% de repolarização (67 ms). Em conclusão, neste exemplo representativo aos 6 dias após o transplante, o iPSCM analisado mostrou características típicas de cardiomiócitos imaturos. Este achado anedótico está em linha com as medidas em um número estatisticamente suficiente de células e preparações, que foram relatadas antes de 15 .
Figura 1: Molde feito sob encomenda para incorporar ventrículos em Agarose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eletrodo de anel feito sob encomenda (terra) para gravações de eletrodos afiados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Integração elétrica do iPSCM transplantado . ( A ) Fatia de coração ventricular (esquerda) contendo iPSCM positivo eGFP (à direita). SE:Eletrodo de estimulação. Pontos vermelhos marcam a localização das gravações. ( B ) Gravações de potencial de ação em tecido hospedeiro saudável (traços superiores) e iPSCM transplantado (traços mais baixos). A fatia foi focalmente estimulada com um eletrodo de estimulação colocado no tecido do hospedeiro em torno de 2 Hz (vestígios esquerdos) e 5 Hz (traços certos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As fatias ventriculares permitem estudos eletrofisiológicos, farmacológicos e mecânicos com uma estrutura de tecido preservada in vivo e acesso direto da tecnologia de medição a todas as regiões do coração. As propriedades potenciais de ação fisiológica foram demonstradas em fatias embrionárias, neonatais e adultas 9 , 10 , 11 . A vitalidade das fatias, com exceção das camadas superficiais diretamente danificadas pelo procedimento de corte, foi confirmada pela coloração da vitalidade 9 . As gravações de potencial de ação dentro das fatias usando eletrodos de vidro afiados podem ser usadas para investigar a integração e maturação de cardiomiócitos transplantados como descrito aqui, ou para estudos farmacológicos após a adição de compostos cardioativos. As gravações de longo prazo com duração de uma hora ou mais em uma célula individual são possíveis. Esta duração da gravação é suficiente para testarO impacto de diferentes compostos farmacológicos em uma célula por perfusão sequencial e lavagem.
Passos de preparação crítica
Para otimizar a qualidade da fatia, o dano tecidual isquêmico deve ser evitado. Portanto, a perfusão do coração in situ com a solução de Tyrode, ressecção rápida do coração e preservação imediata na solução de Tyrode oxigenada e gelada são considerados cruciais. A imobilização do coração batendo usando monoxime de 2,3-butanodiona pode ainda reduzir a susceptibilidade à isquemia e é necessária para uma incorporação sólida em agarose de baixo teor de fusão. A incorporação de agarose de baixo teor de fusão pode dificultar o fornecimento de tecido por limitação da difusão, mas é essencial para estabilizar o tecido do coração suave antes de cortar. Pequenas cavidades dentro do bloco de espécimes, por exemplo , câmaras ventriculares não preenchidas completamente com agarose ou bolhas de ar remanescentes, podem dificultar a estabilização do tecido. O tecido miocárdico não estabilizado não oferece resis suficientePara a lâmina vibratória, o que provoca graves rupturas e danos nos tecidos. Para garantir um corte claro e minimizar os danos nos tecidos, as lâminas devem ser afiadas ( ou seja, não reutilizadas mais do que três vezes), e o movimento para a frente da lâmina através do bloco da amostra deve ser o mais lento possível, uma vez que as lâminas opacas ou o excesso de velocidade podem afrouxar Ventrículos embutidos ou lacerar o tecido.
Para garantir resultados confiáveis e reprodutíveis, a qualidade das fatias deve atender a critérios específicos, incluindo a integridade estrutural do tecido, que pode ser confirmada por microscopia e resposta à estimulação elétrica em freqüências de batimento fisiológico até 10 Hz.
As fatias podem ser cortadas com uma espessura de 150-400 μm, dependendo da aplicação adicional. Enquanto fatias mais finas podem evitar condições hipóxicas no núcleo do tecido e permitem a detecção mais fácil de células transplantadas com um microscópio de fluorescência, bem como um posicionamento mais preciso deOs eletrodos de gravação 15 , fatias mais espessas podem proporcionar uma melhor integridade da estrutura do tecido e uma maior estabilidade do tecido, o que será vantajoso para medidas de força 10 e processamento histológico posterior após gravações.
Para evitar potenciais influências das altas concentrações de BDM nos canais iónicos e proteínas de manuseio de Ca 2 + 16 , 17 , lavagem de BDM por incubação de fatias em DMEM livre de BDM durante pelo menos 30 min antes de recomendar o uso adicional. Surpreendentemente, a contração e o movimento subseqüente do tecido após o lavado BDM não impedem registros afiados de eletrodos.
Limitações
Em contraste com os modelos comuns de cultura celular, as fatias fornecem uma estrutura de tecido intacta, incluindo conexões celulares e celulares preservadas, matriz extracelular e distribuição de cardiomiopatiaTes e não miócitos dentro do tecido nativo 6 . No entanto, as fatias de tecido cardíaco não correspondem exatamente à situação in vivo , uma vez que são apenas de 150 a 400 μm de espessura, fornecidas por meio artificial e podem ser danificadas durante o processo de preparação. A coloração com azul de Trypan e a avaliação imuno-terapêutica do caspase-3 ativo e do fragmento PARP p85 revelaram que as células dentro das fatias embrionárias, exceto aquelas nas camadas superficiais, eram viáveis após o corte 9 .
O sistema de condução não é preservado em fatias ventriculares, e a propagação de excitação é bidimensional em vez de tridimensional nas fatias planas. As fatias de corações embrionários mostram espancamento espontâneo por até duas semanas em cultura 9 . Também podem ocorrer contrações espontâneas de fatias adultas, e não está claro se elas são induzidas por células do sistema de condução ou podem indicar danos celulares e Ca 2+ overlOad 18 .
Aplicações futuras
Além de estudos eletrofisiológicos com eletrodos afiados e arrays de microeletrodos, que podem ser utilizados para experimentos farmacológicos para analisar o impacto de drogas sobre propriedades potenciais de ação e propagação de excitação 11 , estudos de desenvolvimento 19 ou caracterização de cardiomiócitos transplantados 15 como mostrado acima, fatias ventriculares de neonatal Os corações foram utilizados para medidas de contração forçada 10 , que também podem ser aplicadas em fatias adultas. Outras aplicações futuras potenciais incluem (I) estudos de microscopia de longo prazo em fatias cultivadas, por exemplo , para avaliar a integração estrutural de cardiomiócitos derivados de células estaminais injetadas, (II) injeção de corantes permeáveis de junção gap para estudos de acoplamento intercelular investigados (III) de endotélias E função vascular da coronaDentro das fatias.
Em conclusão, as fatias ventriculares são um modelo de tecido multicelular valioso com estrutura in vivo preservada, o que pode ajudar a superar as limitações dos modelos comuns de cultura celular e é aplicável a uma ampla gama de estudos farmacológicos, fisiológicos, de desenvolvimento e de terapia celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio prestado pelas oficinas e a instalação animal do Instituto de Neurofisiologia. Este trabalho foi apoiado por Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune e Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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