Summary
Her beskriver vi forberedelsen af levedygtige ventrikulære skiver fra voksne mus og deres anvendelse til skarpe elektrode-actionpotentialer. Disse multicellulære præparater tilvejebringer en bevaret in vivo- lignende vævsstruktur, hvilket gør dem til en værdifuld model for elektrofysiologiske og farmakologiske undersøgelser in vitro .
Abstract
Murine-kardiomyocytter er blevet anvendt i vid udstrækning til in vitro- undersøgelser af hjertefysiologi og nye terapeutiske strategier. Imidlertid er multicellulære præparater af dissocierede cardiomyocytter ikke repræsentative for den komplekse in vivo struktur af cardiomyocytter, ikke-myocytter og ekstracellulær matrix, som påvirker både mekaniske og elektrofysiologiske egenskaber i hjertet. Her beskriver vi en teknik til at forberede levedygtige ventrikulære skiver af voksne mushjerter med en bevaret in vivo- lignende vævsstruktur og demonstrere deres egnethed til elektrofysiologiske optagelser. Efter udskæring af hjertet separeres ventrikler fra atrierne, perfusioneres med Ca2 + -fri opløsning indeholdende 2,3-butandionmonoxim og indlejret i en 4% lavmeltig agaroseblok. Blokken er anbragt på en mikrotome med et vibrerende blad, og vævsskiver med en tykkelse på 150-400 μm er forberedt og holder vibrationen friBladets klinge ved 60-70 Hz og flytter bladet fremad så langsomt som muligt. Tykkelsen af skiverne afhænger af den videre anvendelse. Skiver opbevares i iskold Tyrode's opløsning med 0,9 mM Ca 2+ og 2,3-butandionmonoxim (BDM) i 30 minutter. Derefter overføres skiver til 37 ° C DMEM i 30 minutter for at vaske ud BDM. Skiver kan anvendes til elektrofysiologiske undersøgelser med skarpe elektroder eller mikroelektroder, til kraftmålinger til analyse af kontraktil funktion eller for at undersøge interaktionen mellem transplanterede stamcellerafledte cardiomyocytter og værtsvæv. Til skarpe elektrodeoptagelser placeres en skive i en 3 cm cellekulturskål på varmepladen af et inverteret mikroskop. Skiven stimuleres med en unipolær elektrode, og intracellulære aktionspotentialer af cardiomyocytter inden for skiven registreres med en skarp glaselektrode.
Introduction
Tynde vævsskiver er blevet brugt ofte i grundforskningen, da Yamamot og Mcllwain i 1966 viste, at elektrisk aktivitet af hjerneskiver bevares in vitro 1 . Siden da er elektrofysiologiske og farmakologiske undersøgelser blevet udført på skiver fra hjerne 2 , lever 3 , lunge 4 og myokardvæv 5 , 6 , 7 . Første patch-clamp-optagelser i ventrikulære skiver fra neonatale rottehjerter blev beskrevet i 1990 8 , men denne teknik faldt i glemsel i nogen tid. Mere end et årti senere etablerede vores gruppe en ny metode til at forberede murine embryonale 9 , neonatal 10 og voksne 11 hjerte skiver. Disse levedygtige vævsskiver kan anvendes til akutte forsøg (voksen skiveS kan dyrkes i flere timer) eller kortsigtede kulturforsøg (embryonale og neonatale skiver kan dyrkes i nogle dage). Skiver viser in vivo som elektrofysiologiske karakteristika og en homogen excitationsudbredelse som vurderet ved skarpt elektrode-actionpotentiale og mikroelektrode-optagelser 11 . På grund af deres "todimensionelle" morfologi tillader de direkte adgang til optagelektroder til alle områder i ventriklen, hvilket gør dem til et interessant redskab til elektrofysiologiske undersøgelser og rejser nye forsøgsmuligheder i forhold til Langendorff-perfuserede hjerter. Lægemiddelrespons af skiverne til ionkanalblokkere som verapamil (L-type Ca 2+ -kanalblokker), lidokain (Na + -kanalblokker), 4-aminopyridin (ikke-spændingsafhængig K + -kanalblokker) og linopirdin (KCNQ K + -kanalblokker) 9 , 11 10 . Disse resultater viste, at murine ventrikulære skiver er egnede som en in vitro vævsmodel til fysiologiske og farmakologiske undersøgelser. Desuden har ventrikulære skiver af modtagers hjerter i kombination med skarpe elektrodeoptagelser vist sig at være et meget nyttigt redskab til karakterisering af elektrisk og mekanisk integration samt modning af transplanterede føtal 12 , 13 , 14 og stamceller afledte 15 cardiomyocytter.
Sammenfattende er ventrikulære skiver en værdifuld og veletableret multicellular vævsmodel og bør betragtes som komplementære til dissocierede cardiomyocytter og Langendorff-perfuserede hjerterI kardiovaskulær forskning med den største fordel ved at tilvejebringe en in vivo- lignende vævsstruktur (i modsætning til dissocierede celler) samt direkte adgang til måle teknologier som skarpe elektrodeoptagelser til alle områder i hjertet (i modsætning til hele hjertepræparater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrehåndtering skal være i overensstemmelse med retningslinjerne fra det lokale dyrevelfærdsudvalg og til Europa-Parlamentets direktiv 2010/63 / EU.
1. Forbered løsninger
- Forbered Tyrode's opløsning uden Ca 2+ (sammensætning i mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH2P03 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butandionmonoxim (BDM) 30. Juster pH til 7,4 Med NaOH ved 4 ° C.
- Klargør Tyrode's opløsning med Ca2 + (sammensætning i mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH2P03 0,33, MgCl2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Juster pH til 7,4 med NaOH ved 4 ° C.
- Forbered 4% lavmeltig agarose: Sæt 0,6 g lavmeltig agarose i 15 ml Tyrode's opløsning uden Ca 2+ . Opvarm blandingen i en mikrobølgeovn to gange ved 750 W i 10-15 s, indtil agarosen er opløst. Opbevar opløsningen ved en konstant temperatur på 37 &# 176; C og omrør kontinuerligt.
- Opbevar Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uden serum ved 37 ° C boblet med carbogen (5% CO 2 , 95% O 2 ).
2. Forbered mikrotomen
- Tænd for mikrotomen.
- Fyld det ydre mikrotomkammer med is.
- Fyld det indre mikrotomkammer med iskold Tyrode's opløsning uden Ca 2+ og kontinuerlig oxygenere opløsningen med 100% O 2 .
- Placér et stålblad i mikrotomens bladholder.
3. Mouse Heart Isolation
- Injicer 2,500 U heparin subkutant. Vent 15 min.
- Offer dyret ved cervikal dislokation.
- Åbn brystet ved sternotomi.
- Omhyggeligt dissekere perikardiet ved hjælp af små saks og en pincet # 5.
- Indsæt en kanyle i den stigende aorta og perfusér kranspulsårerne in situ med iskold Tyrode sOpløsning uden Ca 2+, indtil det resterende blod fjernes.
- Forsigtigt resekter hjertet med en tang og saks og overfør hjertet i iskold Tyrode's opløsning red uden Ca 2+ .
- Adskil atrierne fra ventriklerne med en skalpel eller saks.
4. Embedding af ventriklerne i 4% lavmeltig agarose
- Placer ventriklerne med apexet vendt opad i agaroseformen ( figur 1 ). Placer tappen i midten af formen i venstre ventrikulær kammer.
- Fyld støbeformen med 4% lavmeltig agarose ved 37 ° C, indtil hjertet er helt dækket.
- Placer formen på is for hurtigere hærdning af agarosen, der forhindrer vævets flydende.
- Fjern agaroseblokken, der indeholder ventriklerne fra formen med en skalpel.
- Drej blokken på hovedet og fyld ventrikulære kamre og mellemrummet på bagsiden af agaroseblokken, som jegS efterladt af smeltestiften, med 4% lavmeltig agarose ved anvendelse af en sprøjte med en 20 G nål.
- Trim agaroseblokken med en skalpel for at opnå en flad bund af blokken og oprejst position af hjertespidsen.
5. Skæring af ventrikulært væv
- Fastgør blokken på mikrotomens prøveholder med en dråbe cyanoacrylatlim. Ansigt hjertespidsen opad.
- Placer prøveholderen i mikrotomens indre prøvekammer, som er fyldt med iskold tyrode uden Ca 2+ . Helt dækker agaroseblokken med Tyrode's opløsning.
- Klargør kortakse skiver med en tykkelse på 150-400 μm afhængigt af den videre anvendelse (til skarpe elektrodeoptagelser 150-200 μm), hold vibrationens frekvens på 60-70 Hz og flyt bladet fremad så langsomt som muligt .
- Brug en fin børste til forsigtigt at fjerne den resterende agarose fra skiverne.
- Forsigtigt transfeR skiver med en Pasteur pipette ind i Tyrode's opløsning med 0,9 mM Ca 2+ luftet med 100% O 2 og opbevar dem i mindst 30 min på is for at komme sig efter skæreproceduren.
- Derefter opbevares skiver i 30 minutter i DMEM ved 37 ° C, luftet med carbogen, for at vaske BDM før yderligere brug.
6. Forberedelse af Sharp Electrode Setup
- Til forvarmning skal alle elektriske apparater tændes 30 min. Før optagelsen starter.
- Sæt en 3 cm cellekulturskål på varmepladen placeret på det inverterede mikroskop.
- Placer den specialfremstillede ringelektrode ( figur 2 ) i parabolantenne og tilslut forstærkerenes jordforbindelser og stimuleringselektroden.
- Tilslut de fleksible rør i perfusionssystemet til parabolantenne.
- Fyld reservoiret i perfusionssystemet med DMEM, luftet med carbogen.
- Tænd perfusionspumpen og indstil perfusionsradenTe til 2-3 ml / min.
- Indstil DMEM'ens temperatur i skålen til 37 ° C ved at regulere flowvarmeren og varmepladen.
7. Optagelse af potentielle optagelser
- Placer et ventrikulært skive i DMEM-fyldet skål.
- Kontroller strukturelle integritet og levedygtighed (baseret på kontraktile funktion) af vævet med det inverterede mikroskop.
- Fyld en optagelseselektrode med 3 M KCL.
- Fyld en stimuleringselektrode med DMEM.
- Anbring optagelektroden og stimuleringselektroden på elektrodeholdere.
- Placer stimuleringselektroden forsigtigt på skiven og tænd den elektriske stimulator. Start med en stimuleringsfrekvens på 1-2 Hz.
- Flyt optagelektroden med mikromanipulatoren over den ønskede optagestilling.
- Sænk langsomt optagelektroden, indtil spidsen rører vævet.
- Påfør en kort rektangulær elektrisk puls gennemOptageelektroden til at trænge ind i cellemembranen.
- Genoptag optagelseselektroden forsigtigt, indtil der er sikret et stabilt signal.
- Start optagelse af handlingspotentialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myokardieinfarkt fører til et næsten uopretteligt tab af kardiomyocytter. Celleudskiftningsterapi ved anvendelse af stamcellerafledte cardiomyocytter til eksogen hjerteregenerering er en lovende terapeutisk tilgang. Elektrisk integration og modning af de transplanterede celler er afgørende for sikkerhed og effektivitet af celleudskiftningsterapi.
For at vurdere integration og modning, transplanterede vi kardiomyocytter afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPSCM; 2 injektioner på 0,5 x 106 iPSCM / 10 μl), der udtrykker forøget grønt fluorescerende protein (eGFP) i raske hjerter hos voksne mus (se Peinkofer et al. For en detaljeret beskrivelse af fremgangsmåder 15 ). Seks dage efter transplantation blev ventrikulære skiver af modtagerhjerter fremstillet under anvendelse af den beskrevne protokol. En repræsentativ optagelse vises iFigur 3. Et skive indeholdende transplanteret iPSCM blev anbragt i DMEM ved 37 ° C og stimuleret fokalt af en unipolær elektrode anbragt i værtsvæv ( figur 3A , venstre). Intracellulære aktionspotentialer blev registreret med skarpe glasmikroelektroder fyldt med 3 M KCl i eGFP-positivt transplanteret iPSCM og nabostatvæv i skiverne ( Figur 3A , højre).
Persistens og elektrisk integration af transplanteret iPSCM i modtagerhjerter kunne påvises. IPSCM blev anset for at være elektrisk integreret, hvis en midlertidig indbyrdes afhængighed af stimuleringsartefakter og aktionspotentialer optaget intracellulært i transplanterede kardiomyocytter var til stede ( figur 3B ). Kvaliteten af den elektriske integration kunne kvantificeres ved forsinkelsen af elektrisk aktivering, dvs. forsinkelsen mellem stimulus og igangsætning af thE optræningspotentiale, og den maksimale stimuleringsfrekvens uden ledningsblokke, dvs. den maksimale stimuleringsfrekvens, der fører til en 1: 1 generation af potentialer efter hver stimulus.
Transplanteret iPSCM i dette repræsentative eksperiment blev elektrisk integreret som angivet ved en maksimal stimuleringsfrekvens uden ledningsblokke på omkring 5 Hz ( figur 3B , højre), men kvaliteten af koblingen var ikke så god som inden for værtsvævet som angivet af det længere Forsinkelse mellem stimuleringsartefakt og aktionspotentiale upstroke (værtsvæv: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Aktionspotentialer for værts-kardiomyocytter havde 84 mV amplitude, -74 mV maksimalt diastolisk potentiale, 11 ms varighed ved 50% repolarisation, 108 ms varighed ved 90% repolarisation og en opslagshastighed på 114 V / s. Forøgelse af stimuleringsfrekvensen fra 1 til 5 Hz medfører et fald i handlingspotentialet duratIon ved 90% repolarisering (86 ms). Transplanteret iPSCM viste signifikante forskelle i virkningspotentialeegenskaber. I sammenligning med værtsceller var amplitude mindre (53 mV), maksimal diastolisk potentiale mindre negativ (-54 mV), varighed ved 50% repolarisering forøget (14 ms), varighed ved 90% repolarisering kortere (90 ms) og opstødningshastighed Langsommere (57 V / s). En stigning i stimuleringsfrekvensen fra 1 til 5 Hz forårsagede et fald i aktionspotentialetid ved 90% repolarisering (67 ms). Som konklusion viste det analyserede iPSCM i dette repræsentative eksempel 6 dage efter transplantationen typiske egenskaber ved umodne kardiomyocytter. Dette anekdotiske fund er i overensstemmelse med målinger i et statistisk tilstrækkeligt antal celler og præparater, som er blevet rapporteret før 15 .
Figur 1: Skræddersyet skimmel til indlejring af ventrikler i agarose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skræddersyet ringelektrode (jord) til Sharp Electrode-optagelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Elektrisk integration af transplanteret iPSCM . ( A ) Ventrikulær hjerte skive (venstre) indeholdende eGFP positiv iPSCM (højre). SE:Stimuleringselektrode. Røde prikker markerer placeringen af optagelserne. ( B ) Optagelsespotentiale i sund hostvæv (øvre spor) og transplanteret iPSCM (lavere spor). Skiven blev stimuleret fokalt med en stimuleringselektrode anbragt i værtsvæv ved ca. 2 Hz (venstre spor) og 5 Hz (højre spor). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ventrikulære skiver muliggør elektrofysiologiske, farmakologiske og mekaniske undersøgelser med en bevaret in vivo- lignende vævsstruktur og direkte adgang til målteknologien til alle områder i hjertet. Fysiologiske virkningspotentiale egenskaber er blevet påvist i embryonale, neonatale og voksne skiver 9 , 10 , 11 . Skiveens vitalitet, bortset fra overfladelagene, der er direkte beskadiget af skæreproceduren, er blevet bekræftet af vitalitetsfarvning 9 . Handlingspotentialeoptagelser i skiverne ved hjælp af skarpe glaselektroder kan anvendes til at undersøge integration og modning af transplanterede kardiomyocytter som beskrevet her eller for farmakologiske undersøgelser efter tilsætning af cardioaktive forbindelser. Langsigtige optagelser med en varighed på en time eller mere i en individuel celle er mulige. Denne registreringsvarighed er tilstrækkelig til at testeVirkningen af forskellige farmakologiske forbindelser på en celle ved sekventiel perfusion og udvaskning.
Kritiske forberedelsestrin
For at optimere skivekvaliteten bør iskæmisk vævsskade undgås. Derfor er perfusion af hjertet in situ med Tyrode's opløsning, hurtig hjerte resektion og øjeblikkelig konservering i iskold oxygeneret Tyrode's opløsning betragtes som afgørende. Immobilisering af det slagende hjerte under anvendelse af 2,3-butandionmonoxim kan yderligere reducere følsomheden over for iskæmi og er nødvendig for en fast indlejring i lavmeltig agarose. Indlejring i lavmeltig agarose kan hæmme vævsforsyningen ved at begrænse diffusion, men er afgørende for at stabilisere det bløde hjertevæv inden skæring. Små hulrum i prøveblokken, f.eks. Ventrikulære kamre, der ikke fyldes fuldstændigt med agarose eller resterende luftbobler, kan hæmme vævsstabilisering. Ustabiliseret myokardvæv giver ikke tilstrækkelig resisTance til det vibrerende blad, hvilket forårsager alvorlig vævsforstyrrelse og beskadigelse. For at sikre et tydeligt snit og for at minimere vævsskader skal knivene være skarpe ( dvs. ikke genanvendt mere end tre gange), og fremadgående bevægelse af bladet gennem prøveblokken skal være så langsomt som mulig, da kedelige blade eller overhastighed kan løsne Indlejrede ventrikler eller lakere vævet.
For at sikre pålidelige og reproducerbare resultater skal kvaliteten af skiver opfylde specifikke kriterier, herunder vævets strukturelle integritet, som kan bekræftes ved mikroskopi og reaktion på elektrisk stimulering ved fysiologiske slagfrekvenser op til 10 Hz.
Skiver kan skæres i en tykkelse på 150-400 μm afhængigt af yderligere anvendelse. Mens tyndere skiver kan forhindre hypoxiske tilstande i vævskernen og muliggøre lettere påvisning af transplanterede celler med et fluorescensmikroskop såvel som mere præcis placering afOptagelseselektroder 15 kan tykkere skiver tilvejebringe en bedre integritet af vævsstrukturen og højere stabilitet af vævet, hvilket vil være fordelagtigt for kraftmålinger 10 og yderligere histologisk behandling efter optagelser.
For at forhindre potentielle påvirkninger af høje BDM-koncentrationer på ionkanaler og Ca 2+ -håndteringsproteiner 16 , 17 anbefales BDM-udvaskning ved inkubation af skiver i BDM-fri DMEM i mindst 30 minutter før yderligere anvendelse. Overraskende hindrer sammentrækning og efterfølgende bevægelse af vævet efter BDM-udvaskning ikke kraftige elektrodeoptagelser.
Begrænsninger
I modsætning til almindelige cellekulturmodeller tilvejebringer skiver en intakt vævsstruktur indeholdende bevaret elektrisk og mekanisk celle til celleforbindelser, ekstracellulær matrix og distribution af kardiomyociTes og ikke-myocytter inden for det native væv 6 . Imidlertid svarer hjertevævsskiverne ikke nøjagtigt til in vivo- situationen, da de kun er 150-400 μm tykke, leveret af kunstigt medium og kan blive beskadiget under fremstillingsprocessen. Trypanblåt farvning og immunhistologisk evaluering af aktivt caspase-3 og PARP p85 fragment afslørede, at celler inden for embryoniske skiver, bortset fra dem i overfladelagene, var levedygtige efter skæring 9 .
Ledningssystemet bevares ikke i ventrikulære skiver, og excitationsudbredelsen er todimensionel snarere end tredimensionel i de flade skiver. Skiver fra embryoniske hjerter viser spontan slagning i op til to uger i kultur 9 . Spontane sammentrækninger af voksne skiver kan også forekomme, og det er uklart, om de induceres af celler i ledningssystemet eller kan indikere celleskader og Ca 2+ overlOad 18 .
Fremtidige applikationer
Ud over elektrofysiologiske undersøgelser med skarpe elektroder og mikroelektrodearrayer, der kan anvendes til farmakologiske eksperimenter til analyse af virkningen af lægemidler på aktionspotentialeegenskaber og excitationsudbredelse 11 , udviklingsstudier 19 eller karakterisering af transplanterede kardiomyocytter 15 som vist ovenfor, ventrikulære skiver af neonatal Hjerter er blevet brugt til kraftkontraktion målinger 10 , som også kunne anvendes til voksne skiver. Yderligere potentielle fremtidige anvendelser omfatter (I) langsigtede mikroskopi undersøgelser i kultiverede skiver, fx til vurdering af strukturel integration af injicerede stamcellerafledte cardiomyocytter, (II) injektion af mellemliggende permeable farvestoffer til undersøgt intercellulær kobling eller (III) undersøgelser af endotel Og vaskulær funktion af coronaRy-fartøjer inden i skiverne.
Afslutningsvis er ventrikulære skiver en værdifuld flercellular vævsmodel med bevaret in vivo- lignende struktur, som kan bidrage til at overvinde begrænsninger af almindelige cellekulturmodeller og kan anvendes på en bred vifte af farmakologiske, fysiologiske, udviklingsmæssige og celleterapiundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Vi anerkender den støtte, der ydes af workshoppen og dyreanlægget hos instituttet for neurofysiologi. Dette arbejde blev støttet af Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune og Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
