Påvisning af østrogene ligander i produkter til personlig pleje ved hjælp af en gær østrogen skærm optimeret for Undergraduate undervisning laboratorium

Summary

Denne artikel præsenterer en optimeret gær østrogen skærmen for kvantificering ligander i personlig plejeprodukter (PCPs) der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder to kolorimetriske substrat muligheder, en seks-dages nedkølet inkubation til brug i undergraduate kurser og statistiske værktøjer til dataanalyse.

Abstract

Gær østrogen skærm (ja) bruges til at påvise østrogene ligander i miljøprøver og er blevet bredt anvendt i undersøgelser af endokrine desintegratorer. Østrogene ligander omfatter både naturlige og menneskeskabte "miljømæssige østrogen" (EBS) findes i mange forbrugsvarer herunder produkter til personlig pleje (PCPs), plastik, pesticider og fødevarer. Ebs forstyrre hormon signalering i mennesker og andre dyr, potentielt reducere frugtbarhed og øget risiko for sygdom. Trods vigtigheden af EBS og andre hormonforstyrrende forstyrre kemikalier (EDC) for den offentlige sundhed, er hormonforstyrrelser ikke typisk inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af en mangel på relevante laboratorieaktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Denne artikel præsenterer en optimeret Ja for kvantificering ligander i produkter til personlig pleje, der binder østrogen receptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden indeholder en af de to kolorimetriske substrater (ortho- nitrophenylfosfat-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller chlorphenol rød-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som er kløvet af β-galactosidase, en 6-dages nedkølet inkubation trin til lette brugen i undergraduate laboratorium kurser, en automatiseret program for LacZ beregninger og R kode for den tilknyttede 4-parameter logistic regressionsanalyse. Protokollen er udviklet til at tillade studerende at udvikle og gennemføre eksperimenter hvor de skærmen produkter af deres valg til østrogen efterligner. I processen lærer de om endokrine desintegratorer, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Samtidig, de også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder, såsom: beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; seriel fortynding standarder; konstruere og interpolering standard kurver; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre. Således tilskynder gennemfører dette assay eleverne til at deltage i undersøgelse-baseret læring mens udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.

Introduction

Gær østrogen skærm (ja) er almindeligt anvendt til at kvantificere ligander, der efterligner estradiol (E2 eller 17β-estradiol) i en række forskellige matricer, herunder vand, plantevæv, forbrugerprodukter og fødevarer^{1,2,3, 4}. Kollektivt, benævnes disse ligander "Miljømæssige østrogen (EBS)." Ja blev oprindeligt udviklet som en lav pris, in vitro- alternativ til i vivo test som den gnaver uterotrophic assay^5,6 og regnbueørred fodring assay⁷. Formålet med disse test er at afgøre, om et produkt indeholder kemikalier, der stimulerer eller blokere østrogen-afhængige mekanismer. Påvisning af EBS er kritisk, fordi de kan forstyrre normale endogene østrogen signalering, især i løbet af fostrets udvikling. Denne indblanding kompromiser sundhed ved at øge risikoen for fedme, infertilitet, kræft og kognitive tab⁸.

Trods vigtigheden af EBS og andre EDC for folkesundheden, er hormonforstyrrelser ikke almindeligt inkluderet i undergraduate læseplaner. Denne mangel er dels på grund af mangel på aktiviteter, der illustrerer principperne involveret samtidig også være tilgængeligt for studerende. Derudover flere variationer af ja-protokollen findes^{9,10,11,12,13}, og denne mangfoldighed gør assay optimering tidskrævende for laboratoriet koordinatorer ikke specifikt uddannet i de relevante teknikker. Endelig, ja assays er normalt afsluttet mere end 1 lang dag eller 2 dage i træk med en O/N inkubation. Denne timing er ikke kompatibel med formatet for undergraduate laboratorium kurser, som typisk mødes én gang / uge i flere timer.

Svar på disse behov rapporter dette manuskript en optimeret 96-nå ja protokol, der omfatter ethanoliske udvindingsmetoder for produkter til personlig pleje (PCPs)³ og en 6-dages køle skridt til at rumme ugentlige laboratorium møder. Absolut ethanol er en alsidig organisk opløsningsmiddel, der kan opløse en lang række polære og upolære opløste stoffer. Derudover er det egnet til bachelor kurser, fordi det er let tilgængelige, relativt ugiftige, overkommelig, og blandbar med vand; det fordamper også nemt uden specialudstyr. Men ethanol er ikke ideelt til at udtrække kraftigt hydrofobe hormonforstyrrende stoffer eller mange olier og voks, de to sidstnævnte er almindelige ingredienser i PCPs. fattige ekstraktionseffektivitet øger risikoen for falsk negative resultater. Med denne begrænsning i tankerne, bør efterforskere vælge ekstraktion procedurer (fx, ethanoliske udvinding eller faste fase udvinding) at adresse prøve karakteristika og opfylde undersøgelse mål (forskning versus bachelor instruktion).

Ja er afhængig af rekombinant Saccharomyces cerevisiae oprindeligt lavet af Dr. Charles Miller ved Tulane University. Se venligst Miller et al. (2010) for et komplet kort over manipuleret plasmid¹⁴. Gær omdannet med disse plasmider constitutively express menneskelige nukleare ERα eller ERβ (også kaldet ESR1 og ESR2, henholdsvis) når der dyrkes i medier indeholdende galactose (for ERα) eller enten glucose eller galactose (for ERβ). Hvis østrogene kemikalier findes i medierne, binder de til receptorer, oprettelse af ligand-receptor komplekser, der aktiverer β-galactosidase (lacZ) udtryk på et niveau, der er proportional med koncentrationen af østrogene kemikalier. Gærceller er så mængden for at frigive den akkumulerede β-galactosidase. Lysisbuffer indeholder enten ONPG eller CPRG, som er kløvet af β-galactosidase at give gule eller røde produkter, henholdsvis. Kolorimetrisk produkter kan kvantificeres ved måling af absorbans ved hjælp af en microwell plade Spektrofotometer. Graden af farveskift er proportional med koncentrationen af østrogene ligander, gæren blev udsat.

Valget af substrat (CPRG eller ONPG) afhænger af potentialet for baggrundsabsorbansen som følge af de prøver, der testes. For eksempel planteekstrakter ofte vil tilføje en gul nuance til medierne, der kunstigt oppustet estrogenicity foranstaltninger, hvis ONPG (kvantificeres ved 405 nm) er brugt som substrat for β-galactosidase. Med plante ekstrakter, CPRG (kvantificeres på 574 nm) kan være et mere passende kolorimetriske substrat. CPRG er dyrere end ONPG men bruges på en tiendedel af molariteten. Denne artikel præsenterer estrogenicities af PCP ekstrakter kvantificeres ved hjælp af både ONPG og CPRG.

Kvantificere estrogenicity af miljøprøver ved hjælp af både ERα og ERβ er en mere omfattende tilgang end ved hjælp af kun én af disse receptorer. I dyr udstille disse receptorer differential væv distribution, reguleringsvirksomhed og bindende tilhørsforhold til østrogene og anti-østrogene ligander¹⁵. For eksempel, bind plante-baserede fytoøstrogener typisk ERβ mere kraftigt², mens syntetiske kemikalier kan vise præference for enten ERα eller ERβ eller kan binde begge receptorer lige så godt¹⁵. Derfor forudsige binding til en østrogen receptor ikke nødvendigvis binding til den anden.

Selv om EBS er fundet i mange forbrugerprodukter (f.eks.pesticider, vaskemidler, klæbemidler, smøremidler, plast, fødevarer og lægemidler) samt planter, de præsenterede data blev indhentet ved hjælp af et udvalg af PCPs. PCPs er overbevisende, let tilgængelige budget-venlige og miljømæssigt relevante for studerende. Eleverne kan opfordres til at bringe deres foretrukne PCPs fra hjem til test i laboratoriet. De kan også søge i huden dyb databasen udviklet af Environmental Working Group¹⁶ for at generere hypotese-drevet sammenligninger af PCPs med høj og lav toksicitet scores. På denne måde, kan studerende samtidig udvikle avancerede laboratorium færdigheder; engagere sig i selvstyret, undersøgelse baseret læring; og udforske nye problemstillinger på miljø og sundhed.

Protocol

1. making reagenser

1. Forberede glucose og galactose medier ved at blande 6,7 g gær nitrogen base, 20 g dextrose eller galactose, 20 mg adenin sulfat (tilføjet som 10 mL af en 200 mg/100 mL vandig stamopløsning), 20 mg uracil (tilføjet som 10 mL af en 200 mg/100 mL vandig stamopløsning) , 60 mg leucin (tilføjet som 6 mL af en 1 g/100 mL vandig stamopløsning), og 20 mg histidin (tilføjet som 2 mL af en 1 g/100 mL vandig stamopløsning) i ionbyttet vand til en endelige mængden af 1 L. Sterilize ved filtrering (0,2 µm filter). Medierne kan opbevares ved 4 ° C i flere uger.
2. Forberede estradiol (E2) standarder ved at opløse pulveriseret E2 i vandfri ethanol og fortynding til de relevante arbejdsgruppe koncentrationer (227.5 nM & 9,75 nM) i 50% ethanol.
   Bemærk: Hvis estradiol er købt som et hætteglas af 1 mg, tilsættes 1 mL ethanol direkte til hætteglas opløses estradiol pulver. Dette giver en 3,67 mM bestand #1.  Fortyndet 10 μL af stock #1 i 990 μL ethanol at gøre 1 mL af 36.71 μM stock #2.  Derefter fortyndes 10 μL af stock #2 990 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 367.13 nM stock #3.  For at gøre arbejder bestande, fortyndes 619.7 μL stock #3 i 380.3 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 227.5 nM arbejder stock bruges til at oprette standard kurver med gær udtryk for ERα.  Fortynd 26.56 μL stock #3 i 973.44 μL 50% ethanol at gøre 1 mL af 9,75 nM arbejder stock bruges til at oprette standard kurver med gær at udtrykke ERβ. Forsegle standarder med parafilm og opbevares ved -20 eller -70 ° C.
   Forsigtig: E2 er en formodet kræftfremkaldende og reproduktive giftstoffet. Det er skadeligt hvis indåndes, sluges eller optages gennem huden. E2 kan forårsage skade på amning børn og fostre. E2 er meget giftige for vandlevende organismer. Bruge relevante personlige værnemidler (handsker, stinkskab, støvmaske) og undgå eksponering under graviditet og amning. Afhænde E2 som farligt affald og ikke frigive i miljøet.
3. Forberede LacZ buffer ved at blande 8,52 g Na₂HPO₄, 5.52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95.21 mg MgCl₂, 745.5 mg KCl, 2 g N-lauroylsarcosine natriumsalt, og enten ONPG (400 mg) eller CPRG (77,7 mg) i ionbyttet vand til en finale bind 1 L. butik LacZ buffer i 20 mL alikvoter ved-20 ° C.
   Bemærk: En 20 mL alikvot er tilstrækkelig for en 96-brønd plade.
4. Forberede natriumcarbonat ved at blande 105.9 g natriumcarbonat i ionbyttet vand til en endelige mængden af 1 L. butik på RT.
5. Forberede 1 M dithiothreitol (DTT) i vand. Fryse 25 µL delprøver af DTT ved-20 ° C.
   Forsigtig: DTT er en akut hud og øje irriterende. Bruge relevante personlige værnemidler (handsker, stinkskab, støvmaske) for at undgå hud og øjenkontakt, indånding og indtagelse.
   Bemærk: Hver delprøve er tilstrækkelig for en 96-brønd plade.

2. forberedelse af prøver og udvinding kontrol

1. Vælg prøver at teste.
   Bemærk: Denne artikel præsenterer data for femten PCPs, herunder sæbe, hår creme, shampoo, solcreme, læbepomade, foundation, barberskum, neglelak og lotion.
2. Kombiner 1 g af prøven med 10 mL af vandfri ethanol i en 15 mL konisk slange. Forberede en negativ udvinding kontrol består af 11 mL ethanol i en 15 mL konisk slange. Forberede flergangsbestemmelser, efter behov.
   Bemærk: For præsenteres eksperimentelle design, tre delprøver af alle 15 PCPs og tredobbelt udvinding styringsløsninger blev udarbejdet, giver i alt 48 prøver, som hver blev analyseret i tre eksemplarer med protokollen i afsnit 4. En enkelt plade kan rumme op til 23 prøver i tre. Vandfri ethanol anvendes i dette trin, fordi det fordamper let. Brug negative udvinding kontrol til at kontrollere, at østrogener ikke udvaskning i prøver fra de koniske rør.
3. Homogeniseres tube indholdet i 30 min ved en kombination af manuel omrystning og vortexing eller ved at ryste rør på en multi tube vortexer.
4. Centrifugeres koniske rør ved den maksimale tilladte hastighed i en spand centrifugeres i 10 min. Decant supernatanten fra hver tube gennem en 40 µm celle si i en 50 mL konisk slange. Tom indholdet af hver 50 mL tube i et glas scintillation hætteglas.
5. Efterlad hætteglas åbne i en ventileret hood for en uge at tillade ethanol til at fordampe fuldstændig. Alternativt, tørre prøver i en ventileret hood under nitrogen eller med en rotationsfordamper. For at undgå nedbrydning af lys følsomme vælgere, beskytte tørring prøver fra lys (f.eks.sted uigennemsigtigt stof over ventilerede hood døren).
6. Rekonstruere prøver i 1,0 mL 50% ethanol og vortex at homogenisere.

3. dyrkning og podning gær¹⁴

1. Opretholde aktive gær kulturer (rekombinante W303a stamme af S. cerevisiae¹⁴) ved at inkubere gær i filter-steriliseret glukose medier ved 30 ° C. Subkultur gær ugentligt i frisk filter-steriliseret glukose medier.
2. To nætter (ca 42 h) før forberede ja plader, subkultur gær ved at tilføje 0,1 mL af aktive gær kulturer til 10 mL af filter-steriliseret glukose medier ved hjælp af steril teknik.  Der inkuberes ved 30 ° C i to nætter.  Ryster er ikke påkrævet, hvis gær er vokset som lavvandede kulturer i sterile 250 mL Erlenmeyerkolbe kolber.
   Bemærk: Gær kan også være gemt på nedkølet agar plader i flere måneder. For længere opbevaring (år), kombinere O/N kulturer med 15-50% steril glycerol, vortex og fryse ved-70 ° C. For at forberede steril glycerol, skal du bruge en sprøjte til at overføre 300 µL glycerol til en cryovial og autoklave med fælles landbrugspolitik løsnes. Derefter tilføje 1.200 µL O/N gær kultur ved hjælp af steril teknik.

4. forberedelse ja plader (dag 1 i analysen)

1. I et sterilt bæger og ved hjælp af steril teknik, fortyndes gær fra trin 3.2 til en optisk tæthed af 0.065 ±0.005 på 610 nm (OD₆₁₀) i filter-steriliseret galactose medier.
   1. Bekræfte Ekstinktionen af pipettering 120 μL af hver gær prøve i tre eksemplarer samt tredobbelt galactose tomme felter i en klar polystyren plade (plade behøver ikke at være steril).  Bruge Spektrofotometer plade til at kontrollere, at den fortyndede gær kultur har en netto OD₆₁₀ af 0.065 ±0.005 trækker OD610 aflæsninger af galaktose blanks fra gær OD₆₁₀ aflæsninger at bestemme netto OD₆₁₀ af gær. Forberede en endelige mængden af mindst 30 mL fortyndet gær for hver 96-brønd plade.
      Bemærk: Spektrofotometer filtre måling af absorbans mellem 595 og 610 nm kan bruges til denne måling.

En omtrentlige 1:6 v: v ratio af gær: medier typisk giver en OD₆₁₀ tæt på 0,065, så start ved at føje 4,5 mL gær til 30 mL medier og tilføje mere gær eller medier som hensigtsmæssigt at opnå en netOD₆₁₀ mellem 0.060 og 0.070.

Brug steril teknik, tilføje denne fortyndede gær suspension til brønde i en steril, polypropylen, 96-brønd mikrotiterplade ifølge plade layout (figur 1). Under pipettering, holde kilden gær suspenderet af løbende hvirvlende beholderen eller blande med pipetten. For dette trin er det nyttigt at bruge en gentaget pipette med en steril sprøjte spids.
Bemærk: Polypropylen plader er steriliseret ved autoklavering to stablede skilte i folie.  Den øverste plade tjener som et låg til prøve plade og kan blive vasket, re-autoklaveres og genbruges.

Tilføje 120 µL filter-steriliseret galactose medier til 3 yderligere wells (H10 - 12) efter plade layout (figur 1). Disse brønde fungere som medier kontrol for at tage højde for absorbans bidraget af medierne alene.

Konstruere en standardkurve i hver tallerken ved seriel fortynding af tre af E2 arbejdsstandarder (227.5 nM for ERα, 9,75 nM for ERβ) i wells indeholdende gær suspension (A1 - G3) Ifølge plade layout (figur 1).  Indledningsvis ved at tilføje 5 µL af E2 standarder brønde A1 gennem A3. Bland microwell indholdet af pipettering, og derefter seriefremstillede fortyndes denne suspension ved at flytte 205 µL fra brønde A1 - 3 i boringer B1 - 3. Gentag blanding og overførsel af 205 µL gennem rækken G.
Bemærk: Efter seriel fortynding er afsluttet, kassere 205 μL fra brønde G1 - 3. I slutningen af dette skridt, bør alle standard wells indeholder 120 μL. Seriel fortynding vil give de endelige E2 koncentrationer der er anført i tabel 1. For seriel fortynding skridt er det nyttigt at bruge en mulitkanalpipette med steril tips.

Tilføj 5 µL af køretøjet (50% ethanol) til køretøjet kontrolhullerne indeholdende gær suspension (H1 - 3) Ifølge plade layout (figur 1).
Bemærk: Køretøj kontrolhullerne bruges til at kvantificere baggrundsabsorbansen forbundet med gærceller og medier. Derudover cytotoksicitet eller vækst fremme effekter af test prøver kan påvises ved at sammenligne OD₆₁₀ værdier af test brønde med de af køretøjets kontrolhullerne.

Tilføje 5 µL tre prøver og negative udvinding kontrolelementer til brønde indeholdende gær suspension efter plade layout (figur 1).
Bemærk: Noter som prøver eller negative udvinding kontrolelementer er tilføjet til hver brønd.  At holde styr på hvilke brønde med prøver og som ikke, starter med en frisk kasse med tips og bruge tips fra de samme steder i boksen som placeringen af de tilsvarende brønde i pladen. En 96-brønd plade kan rumme op til 23 prøver i tre eksemplarer.

Bland indholdet af prøven, udvinding kontrol og køretøj kontrolhullerne af pipettering. Justere mængden af disse brønde til 120 µL af fjerner 205 µL af hver, som beskrevet i forklaringen til figur 1.

Forsegle skilte med en steril, selvklæbende, porøse film. Etiket plader og inkuberes i 17 h ved 30 ° C. Pladen behøver ikke at blive rystet under inkubation

5. forarbejdning ja plader (dag 2 af analysen)

1. Efter 17 h inkubation ved 30 ° C, skal du fjerne plader fra rugemaskinen. Hvis plader vil blive behandlet straks, Fortsæt til trin 5.1.1. Hvis plader vil blive behandlet på et senere tidspunkt, skal du gå videre til trin 5.1.2.
   1. Bruge en mulitkanalpipette for at blande indholdet af hver række af brønde, og derefter overføre 50 µL af gær suspension fra hver brønd til tilsvarende godt af en klar, polystyren, 96-brønd mikrotiterplade.
      Bemærk: Polystyren plader behøver ikke at være steril men bør have et låg. Brug nye pipette tips for hver række i wells for at undgå cross-forurenende wells, selv hvis pipettering på tværs af tre med en 8-tip multikanalpipette, tips kun skal ændres mellem tredobbelt sæt.
      1. Mærke den nye plade. Fortsæt til trin 5.2.
   2. Hvis du vil gemme plader før behandling, pak dem i plastikfolie. Opbevares i køleskab indpakket plader ved 4 ° C for 6 d. bagefter, fjerne pladerne fra køleskabet, pak dem og overføre indholdet af alle brønde af pipettering som i trin 5.1.1. Fortsæt til trin 5.2.
2. Tilføj 20 µL 1 m DTT til 20 mL af optøede, stuetemperatur LacZ buffer til en endelig koncentration på 1 mM DTT. Mix LacZ buffer godt. Hvis brug af en multikanal-pipette, dispensere til et reagens reservoir.
   Forsigtig: Brug handsker og arbejde med DTT i en hætte, hvis det er muligt
3. Ved hjælp af enten en multikanalpipette eller gentage pipette, tilføje 200 µL af LacZ buffer indeholdende DTT og enten ONPG eller CPRG til alle pladens huller, polystyren, og straks måle og registrere OD₆₁₀ af alle brønde ved hjælp af en plade Spektrofotometer. Gentag efter behov for ekstra plader.
   Bemærk: OD₆₁₀ aflæsninger anvendes som nævner i beregningen LacZ (trin 6.1). Derfor får behandlinger umiddelbart efter pipettering og før celler settle eller er mængden af LacZ buffer. Hvis OD₆₁₀ værdier for prøven brønde er mærkbart højere eller lavere end OD₆₁₀ værdier for køretøjet kontrolhullerne, er prøveekstrakter enten vækstfremmende eller cytotoksiske til gær, henholdsvis. LacZ beregning vil korrigere for små forskelle i celle tætheder på tværs af brønde, men hvis forskelle overstiger 30% i begge retninger, derefter fortyndes den rekonstituerede prøve (fra trin 2.6) i yderligere 50% ethanol og teste prøven ved at vende tilbage til trin 3.2 ¹².
4. Dække plader med låg. Inkuber plader der indeholder gær at udtrykke ERα¹⁴ ved 30 ° C i 40 min (for ONPG) eller 3 h (for CPRG). Inkuber plader der indeholder gær at udtrykke ERβ¹⁴ ved 30 ° C til 70 min. (til ONPG) eller 4 h (for CPRG).
   Bemærk: Når du arbejder med CPRG, inkubation times er fleksibelt; inkubere for 2-4 h giver passende resultater med både receptorer, med længere inkubationer stigende assay følsomhed.
5. Efter inkubation plader, skal du bruge en multikanalpipette eller gentagne pipette til Tilsæt 100 µL af natriumcarbonat til hver brønd. Natriumcarbonat hæver pH og stopper β-galactosidase reaktion.
6. Måle og registrere OD₄₀₅ (for ONPG) eller OD₅₇₄ (for CPRG) i alle brønde ved hjælp af en plade Spektrofotometer.

6.Beregning af LacZ værdier

Bemærk: LacZ værdier kvantificere graden af farveskift for hver prøve og tilbyde en standardiseret metode til sammenligning af værdier blandt separat assays af regnskab for flere variabler (fx, gær optisk tæthed, medier optisk tæthed og inkubering tid hvis Dette adskiller sig blandt brønde på den samme plade)¹².

1. Beregne middel til tredobbelt OD₆₁₀ værdier for medier (galactose) kontrolhullerne (H10-12), og beregne tredobbelt OD₄₀₅ eller OD₅₇₄ værdier for køretøjet (50% ethanol) kontrolelementer (H1-3). Bruge disse midler og Inkubationstiden (t) i timer for pladen til at ændre farve (trin 5.5) for at beregne LacZ værdier (svarende til graden af farveændring i hver brønd) for alle standard og prøve brønde ved hjælp af følgende ligninger:
   
   
   1. Alternativt, brug den automatiseret program i tillæg 1 til at beregne LacZ værdier for standarder og prøver.
      Bemærk: Plade layout bruges sammen med ansøgningen skal være identisk med layoutet plade præsenteret i figur 1. Hvis nogle prøve wells ikke blev brugt, bevare absorbans aflæsninger fra de tomme brønde som sted indehavere i absorbans datasættet er indsat i tillæg 1 LacZ ansøgning.  Dette bevarer den rumlige layout af pladen i ansøgningen og sikrer, at media-kontrolhullerne i deres krævede placering.  Derudover vil programmet ikke køre hvis der er tomme celler.
2. Beregne middel til tredobbelt LacZ værdier for hver E2 standard og hver prøve. Rapport LacZ middelværdier som µL^-1h^-1. Log-transform koncentrationerne af hver standard E2, og generere et regnearksdokument formateret som i filen template.csv (tillæg 2).

7. interpolering prøve Estradiol ækvivalenter (EEQs) bruge 4-Parameter logistisk Regression

Bemærk: EEQs vedrører prøve LacZ værdier (farveændring) LacZ værdier på standardkurven lavet med E2. EEQs således afgøre, hvor meget er forpligtet til at fremkalde den samme farve ændring reaktion som en kendt koncentration af E2.

1. For at beregne EEQs for prøver, først plot standardkurven. Passer LacZ middelværdier for E2 standarder (y-akse) og de tilsvarende log-transformeret E2 koncentrationer (x-aksen) til en fire-parameter logistisk regressionsmodel.
2. Bruge modellen til at interpolere EEQs for test stikprøven LacZ værdier. Gennemføre logistisk regression beregninger af EEQs ved hjælp af statistisk software som beskrevet i tillæg 2.

8. standardisering EEQs (ng/mL) til PCP prøve masse

1. For at relatere EEQs til mængden af PCP prøve tilføjes hver godt i trin 4.5, formere EEQ (ng/mL) af den samlede mængde belagt i stikprøven brønde (325 µL) og derefter dividere med udpakkede prøvemængden tilføjet til hver brønd (5 µL).
   Bemærk: Disse værdier repræsenterer EEQ pr. mL af udtrukne udsnit. Hvis prøverne er fremstillet ved hjælp af 1 g af PCP, repræsenterer disse værdier også EEQ per gram af PCP (ng/g). Udtrykt på denne måde, kan EEQ værdierne (ng/g) sammenlignes på tværs af forskellige PCPs. EEQ (ng/g) værdier for personlig plejeprodukter testet i denne undersøgelse er vist i tabel 2, og prøveeksemplar data indsamlet i hele den hele protokol er inkluderet i Tillæg 3.

Representative Results

Estrogenicities tredobbelt prøver af 15 PCPs blev evalueret ved hjælp af protokollens ja. Som bemærket af Miller et al. (2010), var assays med gær at udtrykke ERβ mere end en størrelsesorden mere følsomme end assays med gær udtrykker ERα (figur 2)¹⁴. Østrogene aktivitet var derfor oftere fundet med ERβ-udtrykker gær (tabel 2). Otte PCPs udstillet østrogene aktivitet med ERβ og 5 PCPs udstillet østrogene aktivitet med ERα. Hår fløde, solcreme, lotion og lip balm prøver var østrogene med begge receptorer, mens foundation, barberskum og neglelak var kun østrogene med ERβ på de afprøvede koncentrationer. Syv andre PCPs (4 shampoo, 2 sæber og 1 læbepomade) var ikke østrogene med enten receptor på de testede koncentrationer.

Ud over receptor følsomhed forskelle afveg EEQs for hver prøve afhængigt af de kolorimetriske substrat (ONPG eller CPRG) anvendes i analysen (tabel 2). I alle undtagen én prøve var EEQs bestemmes ved hjælp af ONPG højere end de bestemt ved CPRG. Desuden variation blandt udvinding replikater var lavest for EEQs målt med ERβ og CPRG og højeste for EEQs bestemmes med ERα og ONPG (tabel 2).

Ud over at sammenligne kolorimetriske substrater, var 1 formålet med den aktuelle undersøgelse at teste inkubation varighed gange, der er kompatible med tidsplanen for en bachelor laboratorium kursus. Typiske ja analysen kræver en 17 h inkubation umiddelbart efterfulgt af inkubation i LacZ buffer for 40 min - 4 h en tidsplan, der er umulig at gennemføre i en undervisning laboratorium begrænset af en enkelt ugentlig session. For at lette anvendelsen af denne analyse i undervisningen, er analysen blevet ændret ved at indføre et 6 d køle periode (trin 5.1.2) efter 17 h inkubation. Standard kurver fra nedkølet plader var sammenlignelige med dem fra ikke-nedkølet plader (figur 2 & 3), bortset fra at standardfejl parametre skønnes ved hjælp af fire-parameter logistisk regression modeller blev alle mindre for kølede plader end for nonrefrigerated plader (tabel 3). Således køle plader til 6 d reducerer fejl og forbedrer nøjagtigheden af EEQ skøn.

Figur 1. Microwell plade Layout og Standard fortynding kurve forberedelse til Ja Assay. E2 standarder (lys grå wells), prøver og negativ udvinding kontrolelementer (hvid wells), og køretøjet (H1 - 3) og galactose medier (H10 - 12) kontrolelementer (mørk grå wells) blev alle testet i tre eksemplarer. En E2 standardkurven (lys grå wells) blev bygget af plating 320 µL af gær i brønd A1 gennem A3 og 120 µL af gær i boringer B1 gennem G3. Derefter, 5 µL af E2 (227.5 nM for gær, der udtrykker ERα; 9,75 nM for gær, der udtrykker ERβ) blev føjet til gær i wells A1 gennem A3. Gær + E2 suspension var seriefremstillede fortyndet ved at overføre 205 µL fra hver brønd til langt under det, hvilket giver de endelige E2 koncentrationer i tabel 1anførte. Bemærk, at enden af seriel fortynding proces skal kasseres 205 µL fra brønde G1 gennem G3 at opnå en endelige mængden af 120 µL i hver brønd. Prøve og negative udvinding kontrolhullerne blev udarbejdet ved at tilføje 5 µL af hver ekstrakt (opløst i 50% ethanol) til 320 µL af gær. Køretøjet kontrolhullerne (H1 - 3) blev udarbejdet ved at tilføje 5 µL af 50% ethanol til 320 µL af gær. Alle prøve og kontrol wells blev mixet af pipettering, og 205 µL blev fjernet og kasseret for at justere godt diskenheder til 120 µL. Endelig blev media kontrol udarbejdet af plating 120 µL af galaktose medier i wells H10 - 12.  Hvis du vil bruge LacZ lommeregner i tillæg 1 og R-baseret program beskrevet i tillæg 2, E2 skal standardkurven og køretøj og galactose medier Kontroller være forgyldt som vist.  Prøver og negative udvinding kontrolelementer kan forgyldt i nogen af de hvide brønde, så længe rækkefølgen af plating er noteret.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Standard kurver for ja plader genereret via 4-parameter logistisk Regression. To substrater (ONPG & CPRG) blev testet ved hjælp af gær udtrykker en af to menneskelige østrogenreceptorer (ERα eller ERβ) begge uden (A) og (B) et 6 d køle periode efter 17 h inkubation med 17β-østradiol og prøve ekstrakter. Alle E2 standarder og medier og køretøj kontrol blev testet i tre eksemplarer. Punkter repræsenterer middel til tredobbelt LacZ værdier, hvor LacZ værdier afspejler graden af farveskift induceret af β-galactosidase. Logistisk regression model parametre er angivet i tabel 3. ONPG = ortho- nitrophenylfosfat-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorphenol rød-β-D-galactopyranoside. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Eksempler på udviklede ja plader. To substrater (ONPG & CPRG) blev testet ved hjælp af gær udtryk for menneskelige østrogenreceptorer (ERα eller ERβ), enten uden (venstre) eller med (højre) en seks-dages køle periode efter 17 h inkubation med 17β-østradiol eller prøve ekstrakter. Alle E2 standarder, medier og køretøj kontrol blev testet i tre. Plader blev arrangeret med den højeste E2 koncentration i den øverste række i hver tallerken og kontrol (50% ethanol + gær på den venstre og galactose medier til højre) i den nederste række af hver plade i henhold til figur 1. ONPG = ortho- nitrophenylfosfat-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorphenol rød-β-D-galactopyranoside.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Standard antallet	[E2] for ERα gær (pM)	[E2] for ERβ gær (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37.6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9.45

Tabel 1. Endelige koncentrationer af E2 standarder anvendes i ja.
Pulveriseret E2 blev opløst i vandfri ethanol og derefter fortyndes til arbejder stock koncentrationer af 227.5 nM (for gær, der udtrykker ERα) og 9,75 nM (for gær, der udtrykker ERβ) i 50% ethanol.Der arbejder bestande blev derefter tilføjet mikrotiterplade brønde indeholdende gær i galactose medier og seriefremstillede fortyndet til de koncentrationer, der er vist i tabellen.

Stikprøver, der undersøges		Assay betingelser		Østrogene ækvivalenter (EEQs) af PCPs
PCP #	Prøvetypen	Receptor	Substrat	EEQ 1 (ng/g)	EEQ 2 (ng/g)	EEQ 3 (ng/g)	Betyde EEQ (ng/g)
1	Hår fløde	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Hår fløde	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Hår fløde	ERΒ	ONPG	0.528	0.338	0.363	0,410
1	Hår fløde	ERΒ	CPRG	ND	0.215	ND	< 0.215
4	Solcreme	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Solcreme	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Solcreme	ERΒ	ONPG	1.321	0.838	0.818	0.992
4	Solcreme	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Foundation	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Foundation	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Foundation	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0.158
7	Foundation	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Barbere fløde	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Barbere fløde	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Barbere fløde	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0.295	< 0,276
9	Barbere fløde	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0.560	0.486
10	Neglelak	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Neglelak	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Neglelak	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0.554	0.658
10	Neglelak	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0.585
11	Lotion	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lotion	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lotion	ERΒ	ONPG	Overskrider område	2.599	1.845	> 2,222
11	Lotion	ERΒ	CPRG	--	1.986	1.236	1.611
13	Solcreme	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11.917
13	Solcreme	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Solcreme	ERΒ	ONPG	Overskrider område	2.580	Overskrider område	> 2.580
13	Solcreme	ERΒ	CPRG	0.292	0.240	ND	< 0.266
15	Læbepomade	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Læbepomade	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Læbepomade	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0.887	1.050
15	Læbepomade	ERΒ	CPRG	0.820	0.871	0.851	0.847

Tabel 2. EEQs af PCPs med nul EEQs. Tre delprøver af 15 PCPs og tre udvinding kontrol blev homogeniseret i vandfri ethanol, fordampet og rekonstitueret i 50% ethanol i alt 48 prøver, som hver blev analyseret i tre eksemplarer med ja assay. Otte PCPs havde mindst 1 nul EEQ, mens 7 PCPs ikke fandtes for at være østrogene på de testede koncentrationer. EEQ 1, EEQ 2 og EEQ 3 henviser til de tre delprøver af hver PCP, hver testet i tre eksemplarer på en separat plade. Værdier for EEQ 1, EEQ 2 og EEQ 3 er middel til tre for hver delprøve. Gær anvendes i analysen udtrykt 1 af 2 isoformer af menneskelige østrogenreceptorer (ERα eller ERβ). To kolorimetriske substrater, ONPG og CPRG, blev testet ved hjælp af ikke-nedkølet protokollen. EEQs blev bestemt ved hjælp af fire-parameter logistiske regressioner (med R² værdier ≥ 0,98) af LacZ værdier på hver af 7 koncentrationer af E2. ND = under detektionsgraensen for analysen.--= tabt replikeres.

Assay betingelser			Model parametre
Receptor	Substrat	Anholdelse ved 4 ° C for 6 d	Model R2	Vækstrate (LacZ enheder/ng/ml)	Vendepunkt (ng/mL)	Lavere Asymptote (LacZ enheder)	Øvre Asymptote (LacZ enheder)
ERΑ	ONPG	Nej	> 0,99	8.548 ±1.633	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	Ja	> 0,99	7.618 ±0.758	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	Nej	> 0,99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0.853 ±3.333	62.52 ±3.473
ERΑ	CPRG	Ja	> 0,99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	Nej	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	Ja	> 0,99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	Nej	= 0,99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	28.05 ±2.334
ERΒ	CPRG	Ja	> 0,99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabel 3. Model-parametrene for 4-parameter logistiske regressioner for Standard kurver i figur 2. To substrater, ONPG og CPRG, blev testet ved hjælp af gær udtrykker 1 af 2 menneskelige østrogenreceptorer (ERα eller ERβ) både uden og med en seks-dages køle periode efter 17 h inkubation. Parametre er rapporteret som skøn ±standard fejl.

Tillæg 1. Program til beregning af LacZ værdier.  For at bruge programmet, først downloade gratis Java software (som anført i Tabel af materialer). Derefter åbne programmet LacZ. Plade layout bruges sammen med ansøgningen skal være identisk med den plade layout præsenteret i figur 1. Hvis nogle prøve wells ikke blev brugt, bevare absorbans aflæsninger fra de tomme brønde som sted indehavere i absorbans datasættet er indsat i programmet LacZ.  Dette bevarer den rumlige layout af pladen i ansøgningen og sikrer, at media-kontrolhullerne i deres krævede placering.  Derudover vil programmet ikke køre hvis der er tomme celler. Indsæt i OD₄₀₅ aflæsninger (for ONPG) eller OD₅₇₄ aflæsninger (for CPRG) i alle brønde ved hjælp af tastaturkommando "kontrol (ctrl) + v" eller "kommando + v," afhængig af computerplatform bliver brugt. Angiv mængden af inkubationstiden i timer for analysen at producere farve (fra trin 5.4; for eksempel, 0.66667 h til 40 min). Klik på næste. Indsæt i OD₆₁₀ aflæsninger fra trin 5.3. Klik på Send. LacZ resultater vises og kan kopieres ved at trykke på "kontrol (ctrl) + c" eller "kommando + c," afhængig af computerplatform bliver brugt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tillæg 2. Statistisk Software muligheder for beregning af EEQs. EEQs kan beregnes ved hjælp af tre præsenteres muligheder.  Retninger for at bruge 1. JMP software eller 2. R kode er fastsat i tillæg 2.  Koden R konverteres også til 3. en ansøgning format tilgængelig på https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tillæg 3. Sample Data indsamlet ved hjælp af gær at udtrykke ERα og CPRG som substrat. Målinger af OD₆₁₀ og OD₅₇₄ for hver syv E2 standarder, køretøj og medier kontrol, og en enkelt repræsentativ for PCP er inkluderet, sammen med beregnede LacZ værdier. LacZ værdier af standarder blev brugt til at konstruere en fire-parameter logistisk regressionsmodel af standardkurven, som beskrevet i trin 7A & B ovenfor. Modellen blev brugt til at interpolere tredobbelt skøn over EEQs af den repræsentative prøve i ng/mL i mikrotiterplade brønde. Disse værdier blev derefter omdannet til EEQs udtrykt i ng/g af prøven (trin 8,1). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Ja er en billig metode til at registrere østrogene ligander i miljøprøver, såsom vand, mad, plantevæv eller produkter til personlig pleje. Data præsenteres her Sammenlign 2 østrogenreceptorer (ERα og ERβ), 2 substrater (ONPG og CPRG) og 2 tidslinjer (2 d-uden køling) og syv-dages protokollen med køleanlæg til måling af estrogenicity i personlig plejeprodukter via ja assay. 7 d, nedkølet protokollen ved hjælp af CPRG og gær udtryk for ERα og/eller ERβ bedste kvantificerer EEQs mens også er kompatibel med tidsbegrænsninger pålagt af bachelorstuderende laboratorium kurser, som mødes én gang / uge i flere timer. Faktisk var i forhold til 2 d assayet uden køling, syv-dages nedkølet analysen forbundet med reduceret variansen på tværs af plade replikater. Den lineære del af standardkurven var derudover lidt udvidet for data indsamlet ved hjælp af den kølede assay. Den lineære del af standardkurven definerer assay registreringsområde og er den eneste del af standardkurven, der kan bruges til at interpolere prøve EEQs.

I alle, men en af de testede prøver var EEQs målt ved hjælp af CPRG lavere end de tal med ONPG. Med en højere extinction koefficient og lavere K_m og V_maxer CPRG ti gange mere følsom end ONPG¹⁷. Således CPRG kan anvendes ved lavere koncentrationer og kan bruges til at registrere lavere mængder af β-galactosidase. Af disse grunde er CPRG generelt foretrækkes over ONPG^18,19. Større substrat følsomhed forklarer imidlertid ikke de lavere EEQ værdier fundet med CPRG. De højere EEQ værdier fundet med ONPG kan skyldes matrix interferens med analysen, som bemærket af andre forfattere^2,18. Gule pigmenter fra personlig pleje produkt ekstrakter kunne puste EEQ værdier fundet med ONPG. Andre har omgået dette problem ved at inkludere pigment kontrol i deres eksperimentelle design², en tilgang, der fordobler antallet af plader i et eksperiment. Når matrix forstyrrelser kan være problematisk, kan CPRG være at foretrække substrat for ja assay, selvom det er dyrere og kræver længere inkuberingstider end ONPG. Derudover er farveændringen induceret af kløvningen af substrat af β-galactosidase mere dramatisk med CPRG, hvilket gør det lettere for studerende at visualisere resultater.

Miller et al. (2010), der manipuleret gæren bruges i denne protokol, bemærkes, at gær at udtrykke ERβ var 30 x mere følsomme over for 17β-østradiol end gær udtryk for ERα, en konstatering, underbygget af vores data¹⁴. Bortset fra potentielle nuancerne i plasmid konstruktion, Miller et al. (2010) kunne ikke forklare denne forskel i følsomhed¹⁴. En forskel mellem de to plasmid konstruktioner er at ERα udtryk er reguleret af galaktose, hvorimod ERβ udtryk er reguleret af enten glucose eller galactose. Gæren bruges i ja assay er kulturperler i glucose medier og kun givet galaktose, når de er fortyndet i starten af analysen. Derfor, gær at udtrykke ERβ kan akkumulere højere kopi numre af receptorproteiner forud for starten af analysen, hvilket giver højere følsomhed over for østrogene ligander.

Den lavere følsomhed af ERα-udtrykker gær kan forklare de højere priser for ikke-påvisning af estrogenicity i prøverne målt med ERα sammenlignet med ERβ. For at øge sandsynligheden for vil at prøve EEQs blive opdaget, brugernes kunne ansætte forskellige ekstraktionsmidler og metoder eller tilføje større mængder af prøven til gæren. Hvis højere prøve diskenheder bruges, bør koncentrationen af E2 standarder justeres således, at den samme mængde af standarder og prøver kan bruges i analysen. En begrænsning af tilføjer flere prøve er, at gæren kan tåle kun 6-10% ethanol, med bedre tolerance ved inkubation temperaturer på 30 vs 35 ° C²⁰. For at kontrollere for virkningerne af ethanol på gær, bør efterforskere tilføje tredobbelt "gær kun" brønde til plade layout og bekræfte, at OD₆₁₀ af disse "gær kun" wells er sammenlignelig med OD₆₁₀ af køretøjet kontrolhullerne straks efter tilsætning af LacZ buffer. Alternativt, prøver opløst i ethanol kan føjes til tørre microwell plader og ethanol fordampet ud før gær er tilføjet. Dimethylsulfoxide (DMSO) er også brugt som prøve opløsningsmiddel i ja-undersøgelser, men den endelige arbejde koncentration af DMSO med gær bør begrænses til 1%¹².

Ja assay er en kraftfuld screeningsværktøj til påvisning af estrogenicity i miljøprøver. Specifikt, registrerer ja ligander, der binder nukleare østrogen-receptorer, der interagerer med østrogen svar elementer til direkte gene expression¹⁴. Ja har imidlertid også vigtige begrænsninger. Ja registrerer ikke EBS, der arbejder gennem ikke-nukleare mekanismer såsom membran østrogenreceptorer eller mekanismer, der indebærer yderligere elementer som aktivator Protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktorer. Desuden, fordi gær ikke har de samme metaboliske kapacitet som pattedyrceller, ja ikke kan registrere ligander, der kræver metabolisk aktivering skal østrogene.

Derudover kan ja assay let skelne mellem østrogene og anti-østrogene ligander i komplekse prøver. I stedet, det måler net estrogenicity, som er den samlede effekt af østrogene og anti-østrogene ligander. For at kvantificere koncentrationen af ER antagonister eller evaluere de hæmmende aktivitet af blandinger, kan analysen ændres ved at inkubere gær med både den standard agonist (17β-estradiol) og en række test stikprøven koncentrationer¹². Denne proces bestemmer hvis antagonister i prøverne kan mindske agonist-induceret reporter aktivitet og giver en nyttig skærmen for at identificere tilstedeværelsen af ER antagonister i prøver.

Protokollen præsenteres her kan rumme en række forskellige typer prøve, selvom nogle prøver kan kræve ændringer i forberedelsestrin udvinding og prøve. For eksempel, EEQs varierede meget blandt replikater af nogle produkter til personlig pleje. De mere variable prøver en tendens til at indeholde olie dråber eller ellers var ikke helt homogen, der angiver, at en mere lipofile opløsningsmiddel som diethylether ville være nyttigt. Alternativt, olier og voks i produkter til personlig pleje kan udelukkes ved at udtrække prøver med 50% ethanol i stedet for 100% ethanol.En 50% ethanol udvinding vil også fange mere vandopløselige østrogene ligander (fx, nogle pigmenter). Men 50% ethanol fordamper langsommere end 100% ethanol og dermed kan forlænge udvindingen tid. Derudover var nogle prøver (såsom sæber) cytotoksiske til gær, hvilket resulterer i reducerede celle tæthed målinger (OD₆₁₀). Fox et al. (2008) tyder på, at prøverne fortyndes og testes igen hvis celle tæthed forskelle overstiger 30% i forhold til koeretoejets styring wells¹².

Hvis ja analysen bruges til analytiske forskning, kan fortynding kurver af prøven puljer testes Bestem preemptively passende mængde ekstrakt tilføjes til gær i trin 4.5. Alternativt, ekstrakter kan testes samtidigt på flere diskenheder (f.eks.5 µL og 20 µL ekstrakt tilsættes gær i trin 4,5) eller fortyndinger, der spænder over størrelsesordener (f.eks.0,2 µL, 2 µL og 20 µL). "Passende" bind af ekstrakt er dem, der identificerer estrogenicity af tilsvarende LacZ værdier langs den lineære del af standardkurven. Optimering forhindrer problemer forårsaget ved at tilføje for meget eller for lidt prøve gær, som cytotoksicitet, falske negativer eller estrogenicity, der overstiger standardkurven. Som nævnt ovenfor, bør mængder af prøver og E2 standarder justeres, når forskellige mængder af ligand bruges sådan, at gær er udsat for en konsekvent mængde og koncentration af ethanol eller andre køretøjer i hele pladen.

Trods potentialet for falske negativer, er ja assay blevet identificeret som en Tier 3 test værktøj for hormonforstyrrende stoffer af Schug et al. (2013), der har udviklet en omfattende differentieret protokol for endokrine forstyrrelser (TiPED)²¹. For uddannelsen af de studerende er analysen værdifulde til undervisning i begreber i relation til hormonforstyrrelser, cellekultur, receptor binding, enzymaktivitet, genteknologi, statistik og eksperimenterende design. Studerende, der bruger analysen også øve grundlæggende og bredt anvendelige laboratorium færdigheder såsom seriel fortynding standarder; uddrager prøver; at lave løsninger; konstruere og interpolering standard kurver; beregning af koncentrationer; at lave løsninger; demonstrere steril teknik; dyrkning af celler; identificering af variabler og kontrol; indsamle, organisere og analysere data; opbygge og fortolke grafer; og ved hjælp af fælles laboratorieudstyr såsom micropipettors og spektrofotometre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.