Summary
Denne protokol beskriver realtids-iontoforese, en metode, som måler fysiske parametre for hjernens ekstracellulære rum (ECS). Diffusionen af et inert molekyle, der frigives i ECS, anvendes til at beregne ECS-volumenfraktionen og tortuositeten. Det er ideelt til at studere akut reversible ændringer i hjernens ECS.
Abstract
Denne gennemgang beskriver de grundlæggende begreber og protokollen til at udføre realtids-iontoforese-metoden (GTI), guldstandarden til at udforske og kvantificere det ekstracellulære rum (ECS) i den levende hjerne. ECS omgiver alle hjerneceller og indeholder både interstitiel væske og ekstracellulær matrix. Transporten af mange stoffer, der kræves til hjernens aktivitet, herunder neurotransmittere, hormoner og næringsstoffer, sker ved diffusion gennem ECS. Ændringer i volumen og geometri i dette rum forekommer under normale hjerneprocesser, som søvn og patologiske tilstande, som iskæmi. Men strukturen og reguleringen af hjerne ECS, især i syge stater, forbliver stort set uudforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametre af levende hjerne: volumenfraktion og tortuositet. Volumenfraktion er andelen af vævsvolumen optaget af ECS. Tortuosity er et mål for den relative hindring, et stof møder, når det diffunderer gennem en hjerne reGion i forhold til et medium uden forhindringer. I RTI pulses et inert molekyle fra en kilde-mikroelektrode til hjernens ECS. Da molekyler diffunderer væk fra denne kilde, måles den ændrede koncentration af ionet over tid ved anvendelse af en ion-selektiv mikroelektrode placeret omtrent 100 μm væk. Fra den resulterende diffusionskurve kan både volumenfraktion og tortuositet beregnes. Denne teknik er blevet brugt i hjerneskiver fra flere arter (herunder mennesker) og in vivo for at studere akutte og kroniske ændringer i ECS. I modsætning til andre metoder kan RTI bruges til at undersøge både reversible og irreversible ændringer i hjernens ECS i realtid.
Introduction
Det ekstracellulære rum (ECS) er netværket af indbyrdes forbundne kanaler udvendigt til alle hjerneceller og indeholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrix ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen af mange stoffer, der kræves til hjernecellens funktion, herunder næringsstoffer, hormoner og neurotransmittere, forekommer ved diffusion gennem ECS. Ændringer i de fysiske parametre i dette rum, herunder volumen, geometri og ekstracellulær matrix, kan drastisk påvirke diffusion gennem ECS og de lokale ionkoncentrationer, badinghjerneceller, som har en dybtgående indvirkning på hjernecellens funktion 1 , 2 .
Real-time iontoforese (RTI) bruges til at bestemme to strukturelle egenskaber i en hjerneområde: volumenfraktion og tortuosity 3 , 4 ,"Xref"> 5. Volumenfraktion ( α ) er andelen af vævsvolumen optaget af ECS ( V ECS ) i forhold til det totale vævsvolumen ( V væv ) i et repræsentativt elementært volumen;
Tortuosity ( λ ) er den relative hindring, som et stof møder, når det diffunderer gennem en hjernegruppe sammenlignet med et medium uden forhindringer;
Hvor D * (cm 2 s -1 ) er den effektive diffusionskoefficient af stoffet i hjerne og D (cm 2 s -1 ) er stoffets fri diffusionskoefficient i et frit medium, såsom fortyndet agarosegel.
I dag er det mest anvendte probesubstans for RTI-metoden er det lille kationtetramethylammonium (TMA). TMA har en molekylvægt på 74 g / mol, dissocieres fuldstændigt i opløsning og har en positiv ladning. RTI undersøgelser med denne ion har vist at α 
0,2 og λ 1,6 1 , 2 . Det betyder, at ECS er ca. 20% af det samlede hjernevolumen, og at diffusionen af et lille inert molekyle forekommer ca. 2,5 gange langsommere i ECS end i et medium uden forhindringer 3 . Imidlertid varierer både a og λ med hjernens alder, region og tilstand og i patologiske forhold 1 . Ændringer af disse parametre har været forbundet med hjernens udvikling, aldring, søvn, epilepsi og mange andre grundlæggende processer og hjernens sygdomme 1, 6 . Mens andre teknikker måler α og λ , kan RTI måle både i lokaliserede områder af levende væv i realtid. Af denne grund er RTI blevet et uundværligt redskab til at undersøge ændringer i α og λ under akutte og reversible udfordringer.
Teorien til støtte for RTI blev oprindeligt valideret af Nicholson og Phillips, og teknikken er blevet brugt udbredt siden dengang 4 , 7 . Eksperimenter, der anvender RTI, begynder med frigivelsen af en puls af TMA fra en kilde-mikroelektrode ved iontoforese i en fortyndet agarosegel. Når de er udkastet, diffunderer ionerne frit fra punktkilden og vælger fra et potentielt uendeligt antal tilfældige stier ( figur 1d ). Den ændrede koncentration af ionen måles over tid ved anvendelse af en ion-selektiv mikroelektrode (ISM) placeret groft100 μm væk ( figur 1c ). Ændringerne i TMA-koncentrationen er graferet og monteret på en kurve, der gør det muligt at beregne både D og transportnummeret for iontofores mikroelektroden (parametre diskuteret i protokollen). Med disse værdier gentages proceduren i en hjerneområde af interesse for at opnå D * og at beregne både α og λ . Kontrol af iontofores mikroelektroden, dataindsamling, grafing og montering af TMA-koncentrationskurven og beregning af eksperimentelle parametre udføres typisk af programmerne Wanda og Walter, som er specielt designet til dette formål (softwaren og deres manualer er Frit tilgængelig fra forfatterne efter anmodning).
Protokollafsnittet i denne gennemgang beskriver de grundlæggende procedurer, der er nødvendige for at designe og udføre RTI i hjerneskiver af gnavere. Teknikken er også blevet brugt i ikke-stangEnt modeller, herunder humane hjerne skiver og in vivo hjernen præparater 1 , 4 , 6 , 8 , 9 . Afsnittet Repræsentative resultater giver både ideelle og ikke-ideelle resultater for at fremhæve nuancer i datatolkning. Endelig dækker diskussionsafsnittet kortfattet fejlfindingsteknikker, begrænsninger af RTI, alternative teknikker, der bruges til at studere ECS, og fremtidige anvendelser af RTI.
Figur 1: Diagrammer af diffusion gennem ECS. ( A ) Diagram over ECS: Viser størrelsen og placeringen af ECS i en typisk hjerneafdeling. Gul markerer ECS mellem de grå hjernecelleprocesser. Volumenet af ECS er ca. 20% af den samlede vævsvolumen ( dvs. volumenfraktion = 0.2) under fysiologiske forhold. ( B ) Forstørret diagram af ECS: Fremhæver fysiske parametre, der bidrager til tortuositet, herunder hjernecellegeometri (grå) og ekstracellulær matrix (skitseret som et maske af flerfarvede glycosaminoglycaner og proteoglycaner). ( C ) 3D-diagram over diffusion fra en punktkilde: demonstrerer netbevægelsen af inerte molekyler fra en iontoforetisk kilde til en ISM. Udelukkende diffusionsbarrierer og cellulær optagelse diffunde molekyler udad i alle retninger og producerer en sfærisk koncentrationsfront. ISM kvantificerer den lokale koncentration af de inerte molekyler frigivet fra den iontoforetiske kilde. ( D ) Computer simulering af diffusion i hjerne ECS: [langt til venstre] Setup for Monte Carlo simulering; Grønne kugler repræsenterer hjernecelleprocesser, og det røde kors repræsenterer en punktkilde. Denne opsætning modellerer hjernevævet diagrammet i figur 1a . [Mellembilleder] 3 og6 molekyler udfører tilfældige bevægelser, da de diffunderer gennem hjernens ekstracellulære rum, vist i 2 dimensioner. [Langt til højre] Tilfældige vandringer af mange molekyler frigivet fra punktkilden. Netto bevægelsen af alle molekyler fra punktkilden er udad som vist i figur 1c . De kumulative tilfældige gåture skitserer mellemrummene mellem cellerne ( dvs. ECS, se reference 5 for yderligere forklaring). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprocedurer, der bruges til at opnå vævsprøver, blev godkendt af dyreetikudvalget ved SUNY Downstate Medical Center.
1. Fremstilling af løsninger og udstyr
- Forbered en 150 mM NaCl-påfyldningsopløsning til ISM's referencebeholder. Opbevares i en 10 ml sprøjte, der er fastgjort til et 0,22 μm filter (for at fjerne bakterier eller partikler).
- Forbered en 150 mM TMA chlorid (TMA-Cl) -fyldningsopløsning for mikroelektroderne. Opbevares i en 10 ml sprøjte fastgjort til et 0,22 μm filter. Forbered TMA-Cl-opløsningerne (i denne protokol) fra en 5 M producent stamopløsning for at sikre den korrekte koncentration.
- Kloridér mindst fire sølvtråde til fremstilling af mikroelektroder ved at nedsænke ledningerne i blegemiddel (natriumhypochlorit) i mindst 2 timer. Fjern overskydende blegemiddel med ethanol og lad trådene tørre.
- Fremstil 50 ml 0,3% agarose i 150 mM NaCI og 0,5 mM TMA-Cl i et bægerglasOg dække det. Brug agarose, der er pulveriseret og rimeligt frisk for at sikre god diffusionsmåling.
- Varm og bland agaroseopløsningen med en omrøringsstang for at opløse den. Lad opløsningen afkøles til stuetemperatur. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge.
- Forbered en ligegyldig (jord) elektrode lavet af 4% agarose i 1 M KCl (retninger i Supplement A)
- Fremstil en lille, porøs kop, som kan passe ind i forsøgskammeret, og som muliggør elektrisk kontinuitet mellem dens indhold og det ydre miljø ( figur 2a ). Placer en metalring på bunden af denne kop for at forhindre, at den flyder, når den er delvist nedsænket i vand.
- Brug seriel fortynding af en 5 M TMA-Cl lager for at lave fem 100 mL TMA-Cl løsninger til kalibrering af ISM'erne. Opløsninger bør have en slutkoncentration på 0,5, 1, 2, 4 og 8 mM TMA-Cl, alt sammen i 150 mM NaCl. Opbevar kalibreringsopløsningerne i en tætbar kop for at forhindre fordampning. </ Li>
2. Elektronisk opsætning
- Forbind komponenterne i RTI eksperimentelle opsætning i overensstemmelse med blokdiagrammet i figur 2b ; Inklusiv en forstærker med to indgangskanaler (hvoraf den ene skal være meget højimpedans for ISM's ion-selektive tønde), et lavpasfilter indstillet til 10 Hz, en diagramoptager, en A / D + D / A Omformer, en iontoforetisk enhed (eller en forstærker, der er i stand til at levere konstantstrømspulser) og en computer (PC), der kører Wanda og Walter-programmerne. Undersøg den elektroniske opsætning for at bekræfte, at alle tilslutninger er på plads.
- Skyd eksperimentelle opsætninger i et jordet kabinet (f.eks. Faraday-bur), hvis det er nødvendigt, da ISM'er har en høj modstand og er følsomme for artefakter skabt af nærliggende bevægelser.
- Opret en dedikeret ISM-kalibreringsstation bestående af en dual input forstærker, en diagramoptager, en passende ISM-holder og en ligeglad jordelektrode. Hvis det er muligt,Afskærmning af kabinettet. Spring dette trin over, hvis ISM'erne er kalibreret i forsøgsopsætningen (trin 3.29)
Figur 2: Porøs eksperimentel kop og elektronisk opsætning. ( A ) Porøs eksperimentel kop: Et porøst net anvendes til at skabe en eksperimentel kop, der muliggør elektrisk kontinuitet mellem agarosen (indvendig) og den eksperimentelle badevæske (udenfor). En metalring er fastgjort til bunden af koppen for at forhindre, at koppen flyder i badeopløsningen. ( B ) Blokdiagram over RTI-opsætningen (trin 2.1 og 2.2): En ISM er forbundet til en forstærker (amp.). ISM'en har to tønder. En indeholder flydende ionbytter (LIX) i spidsen og genererer en spænding, der er proportional med logaritmen af TMA-koncentrationen ved spidsen sammen med den lokale omgivelsespænding; thE signalvej er repræsenteret af en rød linje. Den anden tønde af ISM er kendt som reference tønde og måler omgivelsespændingen ved spidsen af ISM; Den er forbundet med en blå signalvej. Forstærkeren har to såkaldte hovedfaser, der forbinder ISM'en; Disse enheder har en forstærkning på 1 (x1) og matcher mikroelektrodenes højimpedans til den lave impedans af resten af forstærkerkredsløbet. Hovedfasen forbundet med det ion-selektive tønde skal være i stand til at matche en indfaldende modstand på ca. 1.000 MΩ, medens referencemassens modstand typisk er ca. 10 MΩ. Efter at have forladt hovedtrinnet, er spændingen fra referencebeholderen omvendt og subtraheret fra spændingen på det ion-selektive tønde ved anvendelse af en summeringsforstærker (Σ) for at opnå den rene ionsignalspænding. Udgangene fra forstærkeren passerer til en signalkonditioneringsenhed, som tilvejebringer yderligere forstærkning og et multipol lavpasfilter (≤ 10 Hz, typisk en Bessel fiLter), som fjerner støj og forhindrer signal aliasing ved analog-til-digitalomformeren (A / D). Udgangene fra filteret vises også på en stregdiagramoptager. A / D-konverteren digitaliserer signalerne og sender dem til en personlig computer (PC). PC'en genererer også et digitalt signal, der omdannes af en digital-til-analog-konverter (D / A) til en analog spændingspuls, der tilføres iontoforeseenheden, som omdanner spændingen til en strømimpuls med konstant amplitude og sender det Til iontofores mikroelektroden. Ionforforesignalbanen er repræsenteret af en grøn linje. Datainsamlings- og iontoforesignalet er under kontrol af Wanda-programmet, hvilket genererer en outputfil for hver diffusionspost i form af en spænding versus tidoptagelse sammen med alle de parametre, der definerer eksperimentet. Et andet program, Walter, læser outputfilen og bruger ISM-kalibreringsdata til at konvertere de digitaliserede spændinger til koncentrationer. Koncentrationen veRsus tidskurver monteres derefter i Walter til den passende opløsning til diffusionsligningen. D og n t ekstraheres, hvis mediet er agarose, og A og a ekstraheres, hvis mediet er hjerne. Analoge signaler er faste linjer; Digitale signaler er punkterede linjer. Der er også en ligeglad jordelektrode (ikke vist) i badet, der indeholder skiven. Røde linjer = ion signal, blå linjer = referencesignal, grønne linjer = iontoforese kommando, faste linjer = analog, prikkede linjer = digital. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Fremstilling og kalibrering af ion-selektive mikroelektroder
- Fremstil ISM'er ved hjælp af protokollen under en dag før eksperimentet. Lav ISM'er i batcher for at sikre, at mindst to arbejder på eksperimentets dag.
BEMÆRK: De fleste ISM'er er stabile for en dag ellerto. ISM-fremstilling er følsom over for fugt og atmosfæriske forhold. Ikke alle mikroelektroder kalibrerer med succes. - Chip væk ca. 0,5 cm glas ved enden af en af tønderne af en dobbeltborrelet borosilicatglaskapillær med et gammelt par tang.
- Chip en enkelt tønde på den modsatte ende af kapillæren ( figur 3a ). Sørg for, at septum ikke er beskadiget (kritisk). Forsigtig: Brug beskyttelsesbriller for at forhindre skade på grund af projektilglas.
- Placer kapillæren i en flaske acetone i mindst 1 time for at fjerne forurenende stoffer.
- Fjern kapillæren fra acetonen og puls ren, tør, komprimeret nitrogengas eller luft gennem den for at fjerne eventuelt overskydende acetone. Fjern alt acetone i kapillæren, da resterende acetone kan forstyrre silanisering (afgørende).
- Fremstil toppen af mikropipetten på enten en lodret eller vandret træk. Skræddersy parametrene for at trække en pipette med en lang konisk ogSkarp spids, ca. 1 μm eller mindre i diameter. I slutningen af dette trin vil der blive lavet en kapillær i to pipetter ( figur 3a ).
- Visualiser en enkelt mikropipette under et sammensat opretstående mikroskop med et 10X objektiv. Skær spidsen ud ved hjælp af et glasmikroskop dias, således at spidsens sidste diameter ( dvs. begge tønder) er mellem 2 og 5 μm ( figur 3b ). Denne pipette vil fra nu af blive betegnet som et ISM.
- Fyld den afskårne tønde af ISM'en med 150 mM NaCl-referenceopløsning gennem åbningen på den afskårne side ved hjælp af en 10 ml sprøjte fastgjort til et 0,22 μm filter og en 28 G, 97 mm nål ( Figur 3b ). Fyld ikke tønderen forbi tre fjerdedele af tønderets højde.
- Fyld den ikke-afskårne tønde af ISM'en med 150 mM TMA-Cl-fyldstofopløsning. Tryk let på ISM'en for at banke luftbobler ud af løsningen. Kontroller for bobler under mikrofonenRoscope bruges til chipping tipet.
- Flamme på bagsiden af ISM'en ved hjælp af en Bunsen-brænder for at sikre, at der ikke sker nogen kommunikation af backfill-opløsningen på tværs af septumet bag på ISM'en. Sørg for, at den øverste en fjerdedel af ISM'en er tør efter flammende.
- Indsæt en kloriseret sølvtråd i ISM's referenceopløsning og bøj ledningen ud fra kapillæren for at markere dette som referencetrøret ( figur 3c ). Sørg for, at ledningen er nedsænket i backfill-opløsningen og forbliver i opløsning i løbet af eksperimentets varighed.
- Skub en kort længde af polytetrafluorethylenrør (ca. 20 cm lang) over toppen af en 25 G sprøjtenål. Placer den anden ende af slangen på bagsiden af det ion-selektive tønde. Sørg for, at slangen er i tønde, men over backfill-opløsningen ( figur 3c ).
- Opvarm en tandpasta med en Bunsen-brænder og forsegle både slangen og silenEr ledning i deres respektive tønder ( figur 3c ). Sørg for, at der fremstilles en komplet lufttætning omkring plastrøret i det ion-selektive tønde (kritisk).
- Forbered en lille gennemsigtig glasbeholder (5 ml eller mindre) på 4% chlorotrimethylsilan i xylen. Forsigtig: Xylener og silaner er meget sundhedsfarlige; Håndter begge kemikalier inde i en dampkåbe og kassér på passende måde.
- Placér beholderen foran et stereospredningsmikroskop monteret vandret i en dampplade. Fastgør ISM'en lodret over beholderen ved hjælp af en micromanipulator ( Figur 3d ).
- Dip spidsen af mikroelektroden i chlorotrimethylsilanopløsningen.
- Fastgør en tom 10 ml sprøjte til 25 gauge nålen, der fører til ISM. Påfør positivt lufttryk fra sprøjten, indtil der dannes en boble af TMA-Cl-opløsning; Dette trin skal udføres under direkte visualisering gennem mikroskopet.
- Tryk let på ISM-holderen forsigtigt for at banke boblen af spidsen.
- Træk chlorotrimethylsilanopløsningen til en højde på ca. 1.500 μm i spidsen af ISM'en ved brug af negativt tryk på 10 ml sprøjten.
- Udsæt chlorotrimethylsilanopløsningen fuldstændigt fra ISM-spidsen, indtil der opstår en boble af TMA-Cl-opløsning ved spidsen ( figur 3d ).
- Gentag trin 3.19 og 3,20 fem gange. Sørg for, at en jævn, uafbrudt kolonne af væske trækkes i spidsen hver gang. Hvis der ikke kan hentes nogen løsning i spidsen, skal du kontrollere, om slangen er blokeret, lufttætningen er ufuldstændig, eller spidsen af ISM'en er blokeret.
- Skyl alt chlorotrimethylsilanopløsningen ud af spidsen, indtil der er skabt en boble af TMA-Cl-opløsning.
- Mens du holder et positivt tryk på sprøjten, skal du fjerne ISM'en fra xylenopløsningen. Sørg for, at al xylen-opløsningen udvises fra ISM-tipet, da overskydende xylen vil ødelægge excHængekolonne oprettet i efterfølgende trin.
- Placer spidsen af ISM'en i en lille gennemsigtig beholder (enten den ene skifteren kom ind eller en lille kuvette), der holder væske-ionbytteren (LIX) til TMA. Udfør dette trin under direkte visualisering ved hjælp af det horisontale mikroskopopsætning.
- Påfør en lille smule negativt tryk for at trække en minimal mængde af LIX i spidsen ( dvs. så snart LIX ses i spidsen, stop med at anvende negativt tryk).
- Afbryd 10 ml sprøjten fra slangen og lad ISM'en sidde i 5 minutter. I løbet af den tid kommer LIX ind i den silaniserede spids, indtil den når en ligevægtstilstand.
- Fjern ISM fra LIX. Træk slangen ud af bytterens tønde (mens du fjerner så lidt voks som muligt). Placer en kloriseret sølvtråd i den lille åbning, der er oprettet i bagenden af ISM. Tæt tråden i påfyldningsbatteriets fyldstof med smeltet voks.
- Tillad, at ISM'en sidderI mindst 30 min. Vedhæft udfyldte ISM'er til indersiden af et bægerglas ved brug af et hvilket som helst bøjeligt, midlertidigt klæbemiddel.
- Kalibrere ISM'en ved at registrere den spænding, der måles af ISM'en i hver kalibreringsopløsning, der er lavet i trin 1.8.
BEMÆRK: Kalibrering kan udføres i en kalibreringsstation (se trin 2.3) eller i forsøgsopsætningen. Denne procedure er beskrevet i Supplement B og i Haack et al. 10 . - Hvis ISM-kalibreringen lykkedes for flere ISM'er, skal du sætte en pause heri til den dag, hvor det er beregnet. Hvis ikke, fremstill flere ISM'er.
- På forsøgsdagen kalibreres mikroelektroden igen (se trin 3.29).
Figur 3: Fremstilling af en ion-selektiv mikroelektrode. ( A ) ISM efter chipping tilbage enden af en kapillær og trækker (trin 3.2-3.6): En enkelt tønde i begge ender oFa glas kapillær er flået. En ISM genereres ved at trække en dobbeltglaset kapillær til at generere to mikropipetter med fine tip. ( B ) ISM efter tilbagefyldning af begge tønder (trin 3.7-3.9): Spidsen af et enkelt ISM er flået til en diameter på 2-5 μm. Det ion-selektive tønde fyldes igen med TMA-Cl, og referencecylinderen fyldes tilbage med NaCl. ( C ) ISM før belægning med chlorotrimethylsilan (trin 3.11-3.13): En chlorideret sølvtråd indsættes i referencebeholderen. Polytetrafluorethylen (PTFE) slangen er forbundet til en 25 G nål og indsat i det ion-selektive tønde. En lufttæt forsegling oven på begge tønder er skabt ved hjælp af tandvoks. ( D ) Coating en mikropipette med chlorotrimethylsilan (trin 3.15-3.26): [Lav forstørrelse] En ISM suspenderet i chlorotrimethylsilan i overensstemmelse med et horisontalt monteret stereomikroskop. [Høj forstørrelse] Udsigten gennem en horisontalt monteret stereomikroskopOpe af et ISM tip i chlorotrimethylsilan opløsning. Efter visualisering af spidsen gennem et mikroskop udvises en lille mængde TMA-Cl-opløsning fra det ion-selektive tønde (nok til at generere en lille boble af TMA-Cl-opløsning). ISM-indehaveren tappes for at frigive en TMA-Cl-opløsningsboble og derefter klorotrimethylsilan er udarbejdet i spidsen. Denne cyklus gentages flere gange. Efter at alle chlorotrimethylsilan er udstødt fra ISM, placeres ISM'en i den flydende ionbytter (LIX) for TMA, og LIX trækkes ind i spidsen af det ion-selektive tønde. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Fremstilling af ionophores mikroelektroder
BEMÆRK: Iontopesis mikroelektroder skal fremstilles på forsøgsdagen.
- Træk en dobbeltborrelet borosilicatglaskapillær på lodret eller hoVandret trækker. Skræddersy parametrene til at trække en pipette svarende til mikropipetterne trukket i trin 3.6 ( figur 4a ).
- Placer mikropipetten under det sammensatte mikroskop, der anvendes i trin 3.7, og skar spidsen af ved hjælp af et glasmikroskop dias, så den resulterende diameter ligger mellem 2 og 5 μm ( figur 4a ).
- Fyld begge tønder med 150 mM TMA-Cl-genfyldningsopløsningen ved hjælp af en 10 ml sprøjte fastgjort til et 0,22 μm filter og en 28 G, 97 mm nål ( figur 4a ).
- Tryk let på mikropipetten for at sikre, at der ikke er nogen luftbobler tilbage i løsningen af begge tønder.
- Placer chloriderede sølvtråde i begge tønder af mikropipetten. Sørg for, at ledningerne er dybt nok i backfill-løsninger, så de forbliver i kontakt med løsningerne i løbet af eksperimentets varighed.
- Sæt ledningerne i tønderne ved hjælp af varm dental voks. Tæt forsigtigt t Han slår ved at vride dem rundt hinanden (færdiggjort mikroelektrode vist i figur 4b ).
Figur 4: Fremstilling af en ionophores mikroelektrode. ( A ) Iontophores mikroelektrode efter tilbagefyldning af begge tønder (trin 4.1-4.3): En iontofores mikroelektrode trækkes fra et kapillarrør. Mikroelektroden spidses til en diameter på 2-5 μm. Begge tønder af iontofores mikroelektroden er fyldt med TMA-Cl opløsning. ( B ) Afsluttet iontofores mikroelektrode (trin 4.5-4.6): En iontoforese mikroelektrode med to chloriderede sølvtråde indført i tønderne. Mikroelektroden tønder forsegles med voks, og sølvtrådene snoet sammen på mikroelektrodernes bagside./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
5. Fremstilling af kunstige cerebrospinalvæske og gnavere af gnavevæv
- Forbered 1 liter kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med en sammensætning, der er passende for eksperimentet, og tilsæt 0,5 mM TMA-Cl til det.
BEMÆRK: TMA-Cl er nødvendig for at etablere en baggrundskoncentration af TMA under eksperimentet. - Forbered gnavere hjerneskiver med en tykkelse på 400 μm i henhold til standardprotokollerne 11 , 12 . Brug ACSF forberedt i trin 5.1 til dissektion og vedligeholdelse af hjerneskiver.
6. Real-time iontophorese i agarose
- Tænd for computeren, der kører Walter og Wanda-programmerne.
BEMÆRK: Disse programmer er frit tilgængelige efter anmodning. Mens denne software ikke er afgørende, programmerer lignendeSoftware eller udførelse af analysen med hånden ville ellers være påkrævet. - Kør ACSF gennem nedsænkningskammeret med en passende hastighed ( f.eks. 2 ml / min). Indstil temperaturregulatoren til en ønsket temperatur og boble ACSF med 95% O 2 /5% CO 2 (eller en anden passende gasblanding) i løbet af eksperimentets varighed.
- Monter en ligegyldig (jord) elektrode i en passende holder og nedsænk spidsen i ACSF'en, der løber gennem dykkerkammeret. Tilslut ledningen til jorden for optagelsesopsætningen.
- Fyld den porøse kop (fremstillet i trin 1.7) med den 0,3% agarose, der er fremstillet tidligere, og anbring den i nedsænkningskammeret. Sørg for, at løsningen ikke løber over toppen af koppen.
- Fastgør en kalibreret ISM til pipetteholderen af en mikromanipulator og en iontofores mikroelektrode til den anden. Sæt holderne i en vinkel, der passer til opsætningen ( figur 5a ).
- ForbindeISM- og iontofores mikroelektroden ledes til deres respektive hovedfaser af optageforstærkeren. Alternativt kan du tilslutte direkte til forstærkeren (afhængigt af opsætningen).
- Sørg for, at vægten / positionering af forbindelsesledninger eller -klip ikke forårsager bevægelse af mikroelektroderne, da små udsving i positionering kan påvirke resultaterne.
- Tænd den elektroniske opsætning (fra trin 2). Start Walter og Wanda i separate tilfælde.
- I Wanda GUI skal du klikke på "Kalibrere" ( Figur 6a ). I kalibreringsboksen ( figur 6b ) skal du udfylde spændingerne målt under ISM-kalibrering (trin 3.29) og klikke på "Tilpas data".
BEMÆRK: Dette muliggør montering til følgende repræsentation af Nicolsky-ligningen (alternativt tilpas ligningen med et andet middel for at opnå M og K ):
Hendee, V er den målte spænding (mV), M er Nicolsky hældning (mV), C er koncentrationen af ion (mM), K er interferens (mM), og V 0 er offset spænding (mV) 3. - Klik på "Accept" i boksen Kalibrering for automatisk at overføre hældningen ( M ) og interferensen ( K ), der genereres i trin 6.9 til hovedguiten.
BEMÆRK: Her repræsenterer K Na-indblandingen, som normalt er ubetydelig. - På venstre side af GUI'en skal du sikre dig, at alle forsøgsparametre er angivet i tilsvarende indtastninger ( figur 6a ).
- Indstil kilden til den iontoforetiske kilde (standard), "Record Duration" til "200 s" (standard), "Pulse Start" til "10 s" (standard), "Pulse End" Til "60 s" (standard), "Bias Current" til "20 nA" (standard), den"Main Current" til "100 nA" (standard) og "Konverteringsfaktor" til en passende værdi.
- I måleelektrodeboksen indstilles "Bath C" til koncentrationen af TMA indeholdt i badopløsningen (udtrykt i mM). Indstil "Total Gain", "Output Channel", "ISM Channel" og "Ref. Channel" til passende værdier for det dataindsamlingssystem, der er i brug.
BEMÆRK: "Konverteringsfaktor" skal indstilles til en passende værdi (specifik for den iontoforetiske enhed i brug). Denne værdi angiver mængden af strøm, der er bestået for en given anvendt spænding fra D / A-konverteren (nA / mV).
- Anbring en temperatursonde i agarbeholderen. Optag den målte temperatur i "Temperatur" -indgangen i "Måleelektrode" boksen i GUI'en ( Figur 6a ).
- Tænd for delstrømsbelysningen. Hvis det er nødvendigt, skal du tænde kameraet, der er tilsluttet mikrofonenRoscope og kameraskærm.
- Sænk mikroelektroderne mindst 1000 μm dybt ind i agarosen og centrer dem i koppen ( figur 5b ). Visualiser dem under mikroskopet ved hjælp af et 10X objektiv (vanddypningsmål med lang arbejdsstørrelse).
- Forskyd spændingen på forstærkeren til 0 mV for både reference- og ISM-kanaler for at fastslå spændingen registreret i agarosen som baseline spænding.
- På tv-kanalsforstærkeren skal du manuelt flytte ISM-kanalforbindelsen til spændingssubtraktionsudgangen for at indstille subtraktionen 'på' mellem reference- og ISM-kanalerne.
BEMÆRK: Subtraktion sikrer, at spændingen ændres i ISM-kanalen, afspejler ændringerne i TMA-koncentration alene. - Flyt ISM'en, så den berører spidsen af iontofores mikroelektroden. Centrer spidserne på hinanden i alle tre retningsakser.
- Nul de relative positioner af begge mikroelektroder påMikromanipulator kontrolbokse. Sørg for, at mikroelektroderne er centreret præcist og præcist (kritisk).
- Flyt ISM 120 μm væk fra iontofores mikroelektroden i en akse (venstre højre akse, figur 5b ). Indtast denne afstand i boksen "Måleelektrode" i GUI'en ( Figur 6a ).
- Start en optagelse ved at klikke på "Acquire" i GUI ( Figur 6a ); Tillade programmet at optage en fuld optagelse.
BEMÆRK: Den iontoforese mikroelektrode modtager en konstant bias strøm. Efter klik på "Acquire," er der en kort forsinkelse, før hovedstrømmen anvendes i en begrænset periode. - Gentag trin 6.20 to til tre gange. Vent, indtil TMA-signalet vender tilbage til basislinjen, før du køber nye poster; Programmet gemmer hver post til senere analyse.
- Kontroller afstanden mellem de to mikroelektroder ved at flytte ISM'en tilbage tO den nulstilling, der er angivet af kontrolboksen. Hvis mikroelektroderne ikke længere er centreret, skal du centrere dem igen ved hjælp af samme strategi som i trin 6.17. Optag eventuelle ændringer i elektrodens position.
BEMÆRK: Hvis afstanden ændres med mere end ca. 2%, kan de optegnelser, der er erhvervet i trin 6.19, ikke betragtes som nøjagtige, og nye skal tages.
Figur 5: Opsætning af eksperimenter i agar. ( A ) Opsætning til forsøg i fortyndet agar (trin 6.1-6.5): En lille porøs beholder fyldt med fortyndet agar anbragt i et løbende perfusionskammer. En mikro-elektrode (ionophores) mikroelektrode (venstre side) og en ISM (højre side) holdes af mikroelektrodeholdere; Mikroelektrode holdere er monteret i armene af robot mikromanipulatorer. En temperatursonde placeres i agargel, og en ligeglad jordelektrode er plAced i nedsænkningskammeret. ( B ) Forstørret billede af mikroelektroder i agar: En iontoforese mikroelektrode (venstre side) og en ISM (højre side) visualiseres i agar ved anvendelse af et 10x vanddypningsmål (objektiv nedsænket her i 150 mM NaCl). Mikroelektroder anbringes ved anvendelse af mikromanipulatorer til en dybde på 1000 μm; Afstanden mellem mikroelektroder er 120 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Wanda Computer Software Interface. ( A ) Navigering Wanda grafisk brugergrænseflade (GUI): Skærmen, der vises efter åbning af Wanda-softwaren. I boks (1) vælges det passende medium, iontoforesemolekyle og teknik. (2) "Kalibrere" klikkes for at åbneWanda Calibration boksen. Efter kalibrering af ISM'en (se figur 6b og tillæg B) er ISM'en anbragt i agar eller hjerne som beskrevet i trin 6 og 8 i protokollen. I boks (6) indtastes alle relevante værdier for det udførte forsøg. (7) "Acquire" er klikket for at tage en optagelse; En graf af spænding versus tid vises i øverste højre del af Wanda GUI. ( B ) Kalibrering af ISM i Wanda : Vinduet, der åbnes efter klik på (2) "Kalibrere" i Wanda GUI. Værdierne fra trin 3.29 indtastes i boks (3), og (4) "Fit Data" er valgt. Kalibreringskurven bekræftes at være lineær. (5) "Accept" klikkes for at vende tilbage til Wanda GUI. Klik her for at se en større version af denne figur.
7. Agarose data analyse
- ÅbnWalter program på computeren (pc). I menuen "0. Records From:" skal du klikke på "Wanda / VOLTORO" -knappen for at læse de records, der er genereret af Wanda ( figur 7a ). Hvis du ønsker at uddata til et regneark skal åbnes, skal du åbne den relevante software. Klik på "Sheet 1.3" i "1. Write Excel?" Menu ( figur 7b ).
- I det næste popup-vindue skal du vælge den eller de poster, der skal læses, og klikke på "Åbn" ( Figur 7b ); Bemærk at optegnelserne automatisk bliver tegnet. For at starte monteringsproceduren udfør følgende trin.
- I menuen "2. Indstillinger" skal du klikke på "vælg rec" -knappen. I pop-up-vinduet " Figur 2 " skal du bruge musen til at flytte crosshairs over den første post, der skal behandles ( figur 7c ); Tryk på enten museknappen for at vælge posten.
- Klik på oN "fit curve" i menuen. Vælg det ønskede antal iterationer af montering; Brug mindst 20 iterationer af montering for at opnå en præcis tilpasning af dataene.
- I menuen vælges "alle" for at passe til alle datapunkter og vælge "fortsæt;" Programmet passer til den viste kurve. Overhold montageproceduren og sammenligne forsøgsoptegnelsen med den bedst tilpassede kurve.
- Vælg indstillingen for at skrive resultatet til det relevante regnearksprogram ved at klikke på "Excel" i menuen "7. Resultater" ( Figur 7d ). Bemærk (og optag) følgende kritiske data, der skal bruges til at bestemme mikroforelektronens iontoforese: ' D (E5) ', ' Reference D (E5) ', ' r_app ', transportnummer ' n t ', ' Apparent N t '.
BEMÆRK: " D (E5) ": Målt fri diffusionskoefficienttx 10 5 (cm2 / s); " Reference D (E5) ": Teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 5 (cm 2 / s). Denne værdi er hentet fra en database inden for Walter baseret på ion, mediet og temperaturindgangen. " R_app ": Tilsyneladende mikroelektrodeafstand (cm), beregnet ud fra målt og reference D (E5) . " N t ": Transportnummer (dimensionsløs). Dette tal bestemmer den brøkdel af iontoforese strømmen, der bruges til at frigive TMA 4 . "Tilsyneladende n t": Tilsyneladende transport nummer (dimensionsløs). Dette er et transportnummer beregnet fra r_app . Dette tal skal være tæt på den målte n t . - Gentag trin 7.1-7.3 for hver af optegnelserne for et valgt par mikroelektroder.
- Bestem om iontophores mikroelektroden kan bruges ved at gøre følgende.
- Sammenlign " r_app" med den faktiske r ( dvs. 120 μm); Dette kriterium er opfyldt, hvis gennemsnitsværdierne fra alle forsøg er inden for 4% af hinanden.
- Sammenlign " D (E5)" med reference D (E5) ; Dette kriterium er opfyldt, hvis gennemsnitsværdierne fra alle forsøg er inden for 8% af hinanden.
- Sammenlign " n t " mellem forsøg med den samme mikroelektrode; Dette kriterium er opfyldt, hvis gennemsnitsværdier fra alle forsøg er inden for 10% af hinanden.
- Hvis et af kriterierne fra trin 7.5 ikke var opfyldt, fejlfindes iontophores mikroelektroden eller begynder at teste en anden.
- Hvis iontophores mikroelektroden anses for egnet til eksperimentet, skal du registrere det gennemsnitlige transportnummer fra alle forsøg i feltet "Transport Num N" i Wanda GUI ( Figur 6a ).
Figur 7: Walter Computer Software Interface. ( A ) Valg af dataindsamlingsprogrammet i Walter: Menuen "0. Records From:" åbnes efter start af Walter-softwaren. Muligheden for at indlæse de arkiver, der er gemt af Wanda, vælges ved at klikke på "Wanda / Voltoro" -knappen. ( B ) Valg af data- og dataanalyseplacering i Walter: [Venstre] Når det relevante regnearkprogram er åbnet, vælges "Ark 1,3" for at output alle Walter-dataanalyser til det tidligere åbnede regnearksprogram. [Højre] Når dataanalyseproduktionsstedet er valgt, åbnes et popup-vindue, der giver brugeren mulighed for at vælge de første og sidste optagelser, der skal læses af Walter. ( C ) Valg af optagelse til analyse i Walter: [Højre] Når de filer, der skal læses, vælges, åbnes et popup-vindue med alle valgte records disSpillet som en graf (" Figur 2 "). [Left] I menuen "2.Options" vælges "select rec", og musen bruges til at flytte crosshairs for at identificere den første optagelse til analyse; Enten med museknappen trykkes for at vælge optagelsen. ( D ) Eksportere dataanalysen fra Walter til et regneark: Efter tilpasningen af dataene vises et pop op-vindue og menuen "7. Resultater". [Venstre] Graf af den valgte optagelse (blå) med den monterede diffusionskurve frembragt af Walter (rød). [Right] Menuen "7. Results" giver brugeren mulighed for at skrive dataene fra analysen til et regnearksprogram ved at klikke på "Excel" -knappen. Klik her for at se en større version af denne figur.
8. Real-time iontophorese i hjerneskiver
- Anbring en 400 μm tyk hjerne sLus i optagekammeret, idet det sikres, at det er helt neddykket i den flydende ACSF. Placer skiven med en akvarel pensel og forsigtigt fastgør den med et gitter.
- Flyt både iontofores mikroelektroden og ISM over interessepunktet på hjerneskiven. Dyk både i den flydende ACSF men over skiven.
- Udskift spændingen for både reference- og ionfølerkanalerne til "0" mV. Vent til spændingen i begge kanaler stabiliseres. På diagramoptageren markerer du den spænding, der måles på ISM'ens ionfølingskanal. Brug dette til at beregne baseline V-parameteren i Wanda.
- Placer ISM- og iontofores mikroelektroden 200 μm dyb i skiven og 120 μm væk fra hinanden. Vent til stabilisering af signalet efter at mikroelektroden er flyttet ind i hjerneskiven.
BEMÆRK: Forspændingsstrømmen, der påføres iontophores mikroelektroden, forårsager en lille ophobning af TMA. Det er en almindelig fejl at tage arOptagelse for tidligt og undervurdere signalopbygningen. - På diagramoptageren markerer du den stabiliserede spænding målt i hjerneskiven på ISM'ens ionføler kanal. Beregn spændingsforskellen mellem TMA-signalet målt i trin 8.3 og trin 8.4 og indtast denne værdi i feltet "Baseline V (mV)" i måleelektroderboksen i Wanda GUI ( figur 6a ).
- På venstre side af GUI'en skal du sikre dig, at alle forsøgsparametre er korrekt registreret / indtastet. Indstil "Medium" til "Brain", "Transportnummer" til den gennemsnitlige værdi beregnet for iontophores mikroelektroden i trin 7.4, og "Temperatur" til temperaturen på badet, der indeholder skiven.
BEMÆRK: V skal optages for hvert sæt målinger. Baseline V vil blive konverteret af Wanda til baseline C (mM) parameteren ( dvs. koncentrationen af TMA i hjernevæv). - Start optagelsen ved at klikke på "Acquire" og lad det tage en fuld optagelse. Vent, indtil TMA-signalet vender tilbage til basislinjen, før du får en ny optagelse.
- Tag to til tre på hinanden følgende optagelser, før mikroelektroderne fjernes fra den valgte hjerneplacering. Indtast temperaturen målt i Wanda-softwaren umiddelbart før hver optagelse.
- Flyt begge mikroelektroder diagonalt tilbage til overfladen af skiven. Hæv begge til mindst 50 μm over skiven. Ved hjælp af diagramoptageren skal du bestemme enhver ændring mellem den målte V nu og dens måling fra trin 8.3.
- Centrer tipsene fra ISM og de iontoforetiske mikroelektroder i forhold til hinanden i x-, y- og z-akserne. Få mellemrumsændringer, hvis det er muligt, fra displayet til micromanipulatorens kontrolboks.
9. Hjernedataanalyse
- Åbn et nyt regneark for analyseproduktionen.
- Gentag trin 7.1-7.4 i Walter til analyseE de optagelser taget fra hjernen.
- Skriv dataene på regnearksprogrammet ved at klikke på "Excel" i Walter-menuen. Optag a , volumenfraktionen af hjernen ECS; Λ , tortuosity af hjernen ECS; Og k (s -1 ), ikke-specifik clearance.
10. Kontrol af transportnummer og ISM-kalibrering
- Måle ISM transport nummer (n t) i slutningen af eksperimentet ved anvendelse af protokollen nedenfor. Alternativt kontrollere n t efter kritiske forsøg eller når målinger forekommer unormalt. Men at kontrollere n t for mange gange kan resultere i traumer til hjerneskiven.
- Tag nye optagelser i agarose. Se trin 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 og 6.17-6.22.
- Gentag trin 7.1-7.4 i Walter for at opnå n t fra de nye agaroseoptagelser. Undersøg regnearket: hvis n t er ændret med mereend 10% fra den n t indhentet før hjernen målinger opnået med denne iontoforetiske mikroelektrode data ikke pålidelige.
- Udfør en ny kalibrering (se trin 3.29) for ISM efter at alle hjernedata er blevet indsamlet. Brug nyligt opnåede ISM-kalibreringsdata som input i Wanda Calibrate-boksen (se trin 6.9 og 6.10) og kontroller, at hældningsværdien afviger med mindre end 10% fra den foregående kalibrering.
BEMÆRK: De data, der er opnået med denne ISM, er ikke pålidelige, hvis hældningsværdien adskiller sig med mere end 10% fra den foregående kalibrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen af RTI-teknikken er demonstreret i et eksperiment designet til at måle ændringerne i a og under en hypoosmolær udfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere vist sig, at reduktion af osmolariteten af ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil medføre et fald i α og en stigning i λ 13 .
I dette eksperiment blev RTI udført på rottehjerne skiver under både kontrolbetingelser og under vaskning af hypotonisk ACSF. En ISM blev fremstillet, og dens kalibreringsparametre blev indført i Wanda til montering til Nicolsky-ligningen, som beregnet en hældning ( M ) på 58,21 mV. ISM- og iontofores mikroelektroderne blev anbragt i agar og anbragt 120 μm fra hinanden for at måle transporten number. Tre optagelser blev taget, og kurverne blev monteret og analyseret ifølge fremgangsmåden i trin 6 i protokollen ( figur 8a ). Den tilpassede kurve for hvert forsøg overlappes med den rå kurve ( figur 8a ). Den målte diffusionskoefficient ( D x 1E5 ), transportnummeret ( n t ) og forskellen mellem mikroelektrodernes tilsyneladende afstand ( r_app ) og deres faktiske afstand ( r ) afvigende ikke signifikant mellem de tre optagelser ( figur 8b , Optagelser a1-3). Baseret på disse kriterier blev denne iontofores mikroelektrode anset for acceptabel at fortsætte med eksperimentet.
Når først den stabile iontoforese-mikroelektrode blev valgt, blev kontrolværdier for a og λ i rottehjernsegmentet taget for at etablere en baseline for disse parametre. PreVious undersøgelser fandt kontrolværdier for rotte neocortex at være a = 0,18-0,22 og λ = 1,54-1,65 1 . For at replikere disse værdier i dette eksperiment blev ISM- og iontofores mikroelektroden anbragt 200 μm dybt i rotte-neocortex og 120 μm fra hinanden. Gennemsnittet n t beregnet ud fra dataene i figur 8b blev indført i Wanda-programmet til brug i beregningerne af a og λ . Et skift i basislinien V fra placeringen af de to mikroelektroder omkring 200 μm dybt i hjernen blev registreret, og spændingshoppet blev indført i Wanda for at korrigere baseline TMA ( dvs. baseline C parameter) koncentrationen. Tre optagelser blev taget, og deres kurver blev monteret ( figur 9a , figur 9d og figur 9f ). Passerne afslørede et gennemsnitA = 0,192 og λ = 1,69 ( figur 9e ). Afstand og skift i basislinie V blev kontrolleret efter optagelsen blev taget, og de korrigerede værdier blev indtastet i Wanda for at omanalysere dataene (som beskrevet i trin 8 i protokollen). De genberegnede værdier afvigede ikke signifikant, og de værdier, der blev rapporteret i figur 9d, blev accepteret.
Den normale osmolaritet af ACSF er 300 mOsm. For at teste virkningen af hypotonisk ACSF på α og λ i rotte somatosensorisk neocortex blev ACSF fremstillet med en osmolaritet på 150 mOsm ved at reducere NaCl-koncentrationen. Det blev antaget, at denne hypotoniske ACSF ville føre til hævelse af hjerneceller, hvilket forårsager en lavere a og en potentielt højere λ 13 . Hjerneskiven blev superfusioneret med hypotonisk ACSF i ca. 30 minutter, hvilket tillod detAt ækvilibrere med hjernen. I løbet af denne tid forblev mikroelektroderne på samme sted i neocortex som de var under tidligere målinger af kontrolbetingelser. Fem optagelser blev taget under hypotoniske forhold ( figur 9b og f ). Dette frembragte et gennemsnit a = 0,13 og A = 1,84 ( Figur 9e ). Disse værdier var i overensstemmelse med hypotesen om, at hypoosmolaritet formindsker α og øger λ . Spacing og ændringer i basislinie V blev målt og taget i betragtning under analysen og monteringsproceduren.
Recovery parametre blev også målt ved vask på almindelig ACSF (300 mOsm) og taget nye optagelser på samme sted i neocortex. Da svulmeeffekter skulle være reversible, blev det forventet, at α og λ ville komme sig til kontrolniveauer. Værdierne afBerørt over fire optagelser taget efter 30 min regelmæssig ACSF-vask var α = 0,37 og λ = 1,61 ( figur 9c , figur 9e og figur 9f ). Dette viste, at der var en uventet overskridelse under genopretningen af α under disse betingelser ( Figur 9e og Figur 9f ). Derefter blev mikroelektroderne returneret til agar for at bekræfte, at transporttalet for iontofores mikroelektroden var uændret ( figur 8c ). ISM'en blev derefter rekalibreret, og den nye pasform til Nicolsky-ligningen afslørede hældningen til 58,21 mV.
Dette eksperiment er et klart eksempel på, hvordan RTI ser ud under ideelle forhold. Følgende elementer i eksperimentet var nøglen til dens succes. For det første er eksperimentelle data indsamlet iAgarose og hjernen viste tilstrækkelig overlapning med de teoretiske kurver, der blev genereret af Wanda ( figur 8a og figur 9a og figur 9c ). Ligheden i hældning, top og retur til en lignende basislinje er alle vigtige for at bestemme styrken af kampen. Disse dele af kurven er ofte problematiske ved optagelse i agarose, og det er almindeligt, at flere optagelser skal tages, før man finder de betingelser, der producerer velafstemte kurver ( dvs. gode mikroelektroder). For det andet var de gennemsnitlige transportnumre før og efter eksperimentet inden for 10% af hinanden ( figur 8b og figur 8c ). Hvis dette ikke havde fundet sted, kunne de værdier, der var registreret i hjernen, ikke stole på. Dette er langt det mest almindelige problem, der forekommer i RTI eksperimenter. For det tredje, ISM kalibreringer i standardiserede TMA løsninger før og afFor eksperimentet matchede (data ikke vist). Kalibreringerne af et fungerende ISM er typisk inden for 10%, hvilket gør dette til en usædvanlig kilde til forsøgsfejl.
Figur 8: Ideelle kurvefittingdata i agar før og efter eksperimentering i hjernen. ( A ) Repræsentative data fra et forsøg i agar: [Langt til venstre] Repræsentative data fra en enkelt prøve opnået i agar, der demonstrerer koncentrationskurven for TMA. Før diffusionsmålinger blev en konstant bias strøm på +20 nA påført gennem iontofores mikroelektroden. På tidspunktet = 10 s blev TMA pulset fra iontofores mikroelektroden i agaret ved at påføre en +60 nA hovedstrøm i 50 s. En diffusionskurve blev genereret ved at måle [TMA] over tid ved anvendelse af en ISM placeret 120 μm fra kilden. [Mellem] En monteret kurve opnået fra data sRocessing i Walter. [Højre] Overlapningen af dataene og den monterede kurve demonstrerer, at kurvefitting udført af Walter præcist modellerer diffusion i dette forsøg. ( B ) Agarmålingstabel før forsøg i hjernen: Data opnået fra tre forsøg (a1, graferet ovenfor) forud for hypotoniske stressforsøg ( Figur 9 ). Alle forsøg blev udført med iontofores mikroelektroden og ISM anvendt til hypoosmotiske stressforsøg. Dataene opfyldte de nødvendige kriterier for at fortsætte med eksperimentet i hjerneskiver. Disse kriterier omfatter tilstrækkelig overlapning mellem dataene og den tilpassede kurve (som ovenfor) og mindre end 10% variation i transportnummer. Yderligere kriterier er skitseret i trin 7.6. ( C ) Tabell af agarmålinger efter forsøg i hjernen: Data opnået fra tre forsøg udført i agar efter hypoosmotiske stresseksperimenter ( Figur 9 ). Den består Ency demonstreret mellem forsøgene a1-3 og a4-6 tyder stærkt på, at ISM- og iontofores mikroelektroderne var stabile i hele hjerneforsøg. Rec = optagelse eller prøve; R = afstand mellem ISM og iontofores mikroelektrode; Cb = baseline koncentration; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 5 (cm 2 s -1 ) baseret på en forudberegnet standard; N t = transportnummer (dimensionsløs); D (E5) = målt fri diffusionskoefficient x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = tilsyneladende mikroelektrodeafstand (cm) baseret på den målte og reference D (E5); N t tilsyneladende = tilsyneladende transportnummer baseret på r_app . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Hypoosmotisk stress reducerer alfa og øger lambda
ac. Repræsentative data fra forsøg i hjernen under ( a ) kontrol, ( b ) hypoosmotiske og ( c ) genoprettelsesforhold: Faste linjer repræsenterer data og stiplede sorte linjer er tilpassede kurver. De tre betingelser viser markant forskellige diffusionskurver, herunder forskellige skråninger, amplituder og bredder. ( D ) Datatabel fra kontrolforsøg: Datatabel af tre kontrolforsøg (b1, graferet ovenfor); A og λ er ens i alle forsøg og er i overensstemmelse med offentliggjorte data for rotte neocortex. For alle forsøg i hjernen blev den gennemsnitlige n t fra før og efter eksperiment agarmålinger ( Figur 8b og 8c ) anvendt til hjernen n t D ref blev sat til 1,25 × 10 -5 cm 2 s -1 baseret på en database med diffusionskoefficienter (i Walter), der blev opnået i rottehjernen, når T = 34,5 [° C]. Parameteren k ' [s -1 ] tegner sig for den lille mængde TMA, der er tabt fra ECS'en under diffusionsmålingerne. Selv om k ' typisk er meget lille, herunder parameteren i kurvefitting forbedrer nøjagtigheden af RTI-metoden. Tab-parameteren k ' repræsenterer sandsynligvis cellulær optagelse eller tabet af TMA til ACSF. ( E ) Sammenligning af kontrol-, hypoosmotiske og genoprettelsesforhold: Gennemsnitsværdier fra alle forsøg i hjernen under kontrol, hypoosmotiske og genoprettelsesforhold. Dataene viser, at hypoosmotisk stress reducerer α og øger λ . Under en restitutionsperiode efter hypoosmotiske tilstande, a overshoots baseline (kontrol), mens λVender tilbage til basislinjen. Resultaterne tyder på, at ændringer i ECS under hypoosmotiske udfordringer er delvist reversible. RTI-metoden er ideel til at studere denne type akut reversibel effekt. ( F ) Graf viser dataklyngning: Volumenfraktionen (x-akse) og tortuositet (y-akse) fra hvert forsøg er plottet som et enkelt punkt. Grafen demonstrerer klyngning af data inden for hver gruppe ( dvs. kontrol, hypoosmolar og genopretning), hvilket tyder på, at RTI har følsomheden til at detektere de reproducerbare virkninger af en hypoosmolær udfordring i hjernens ECS. Rec = optagelse eller prøve; R = afstanden mellem ISM og iontofores mikroelektrode; Cb = baseline koncentration; Alfa = volumenfraktion Lambda = tortuosity; K ' = ikke-specifik klaring af probe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende filer: Klik her for at downloade filerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Figur 10: Ikke-ideelle data, der viser almindelige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer af fælles tekniske problemer med iontofores mikroelektroder: Sammenligning af den normale frigivelse af TMA fra en fungerende iontofores mikroelektrode med tre kilder, der viser tekniske problemer. [Høj forstørrelse, a1] Strømmen i en ideel iontoforetisk kilde bæres lige ved TMA frigivelse og chloridoptagelse. [Høj forstørrelse, a2] En iontoforese mikroelektrode med lav n t frigiver mindre TMA og optager mere chlorid end normalt. [Høj forstørrelse, a3] En iontoforese mikroelektrode, der viser elektroosmos, frigiver TMA, chlorid og opløsningsmiddel. [Høj forstørrelse, a4] En iontoforese mikroelektrode med voksende udgivelse over tid ( dvs. "opvarmning"). ( B ) Graf af ikke-ideelle data oOpbygget i agar: Dataene er ikke tilstrækkeligt modelleret af den kurve, der er monteret af Walter og kan derfor ikke fortolkes nøjagtigt; Den nøjagtige årsag til uoverensstemmelsen er uklar. C ) Tabel over ikke-ideelle data opnået i agar: Normale eller forventede resultater i agar vises i øverste række (vist i figur 8a ) til sammenligning med de ikke-ideelle data i anden række (vist i figur 10b ). De fattige overlapper mellem dataene og den monterede kurve i figur 10b betyder, at den monterede kurve ikke præcist modellerer diffusionsdataene; Derfor kan de beregnede værdier (markeret med *) ikke tolkes. Dette kunne have været forårsaget af problemer med iontophores mikroelektroden ( f.eks. Opvarmning) eller ISM ( f.eks. Langsom reaktion). Fejlfinding: udskift mikroelektroder en ad gangen, begyndende med iontophores mikroelektroden. Rec = optagelse eller prøve; r= Afstand mellem ISM og iontoforese mikroelektrode Cb = baseline koncentration; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 5 (cm 2 s -1 ) baseret på en forudberegnet standard; N t = transportnummer (dimensionsløs); D (E5) = målt fri diffusionskoefficient x 10 5 (cm 2 s -1 ); R_app = tilsyneladende mikroelektrodeafstand (cm) baseret på den målte og reference D (E5); N t tilsyneladende = tilsyneladende transportnummer baseret på r_app . Klik her for at se en større version af denne figur.
Mens eksperimentet vist i figur 8 og figur 9 havde en stabil og fungerende iontoforese mikroelektrode og ISM, er der mange eksperimenter, hvor enten eller boTh mikroelektroder er kompromitteret og giver ikke ideelle resultater. En "normal" TMA iontoforese mikroelektrode har en værdi på n t 0.3. Figur 10a viser tre almindelige problemer med iontophores mikroelektroden, som kan opstå under RTI eksperimenter.
Lav frigivelse. Den iontophorese mikroelektrode frigiver meget lille TMA, når bias strøm eller hovedstrøm anvendes, hvilket resulterer i n t <0,1. Strømmen går stadig igennem spidsen, men det meste bæres af Cl anionen, der kommer ind i spidsen og meget lidt ved TMA-kationen, der forlader spidsen. Hvis n t er stabil i flere på hinanden følgende forsøg, kan disse iontofores mikroelektroder anvendes. Dette anbefales dog ikke, da de ikke virker optimalt, hvilket betyder at yderligere problemer kan udvikle sig. En endnu større ekstremeOpstår, når spidsen af den iontoforetiske mikroelektrode er blokeret og ingen ioner forlader eller kommer ind i spidsen. I dette tilfælde vil der ikke blive produceret nogen kurve. I sådanne tilfælde skal iontophores mikroelektroden kasseres efter at have kontrolleret, at alle elektriske forbindelser er sikre og sikre.
Høj frigivelse (elektroosmos). Ud over TMA frigiver iontophores mikroelektroden også vand, hvilket resulterer i n t > 0,5. Hvis n t er stabil over flere forsøg, kan disse iontofores mikroelektroder anvendes, men det anbefales ikke, da yderligere problemer kan udvikle sig. Det eneste fejlfindingstrin, der skal tages, er at reducere strømmen. Dette eliminerer undertiden vandfrigivelsen og forårsager, at n t falder under 0,5.
Voksende frigivelse ("opvarmning"). I dette tilfælde øges TMA-frigivelsen over tid. Når "opvarmning" er hurtig,Diffusionskurven har en form svarende til den, der er vist i figur 10b , og den kan ikke monteres pålideligt. I dette tilfælde demonstrerer diffusionskurven en langsom stigning i TMA-koncentrationen under den primære strømmets indledende fase, og TMA-koncentrationen er ikke plateau. En upålidelig pasform skaber en unøjagtig målt D , som påvirker sammenhængen i det målte transportnummer og r_app værdierne. Når "opvarmning" er mere gradvis, er det ikke har en væsentlig indvirkning på formen af individuelle diffusion kurver, men det manifesterer i en n t der øger over successive forsøg. En "opvarmning" tilstand kan undertiden afhjælpes ved at "pulsere" iontofores mikroelektroden i et tidsrum (ca. 30 minutter). Dette sker ved at skifte mellem en bias strøm og en høj strøm (+200 nA) i nogle få sekunder ad gangen. Hvis en iontofores mikroelektrode stadig ikke giver en stablE transport nummer, er det bedst at blot teste en ny.
Præcis måling af transportnummer og stabilitet under hele eksperimentet er afgørende for at sikre en nøjagtig værdi for α . Opretholdelse af afstanden mellem mikroelektroder er afgørende for bestemmelsen af både a og λ . Hvis afstanden ændrer sig efter en måling, enten i agarose eller i hjernen, kan den lige linjeafstand mellem mikroelektrodernes tip indføres i output-regnearket og genanalyseres af Walter. Hvis værdierne er for store, må målingen kasseres. Temperaturudsving kan også være en medvirkende faktor til unøjagtighed, så det er vigtigt at bruge en præcis temperatursonde og et pålideligt kammervarmeelement.
Den iontophorese mikroelektrode er den hyppigste kilde til problemer i RTI-teknikken; At lave og bruge en stabil ISM er afgørende for at opnå gode data. ONe mulig problem med ISM kan være et svagt svar, hvilket kan skyldes meget høj impedans i spidsen. Med et langsomt reagerende ISM vil alle iontophores mikroelektroder synes at have en "opvarmning" effekt ( figur 10b ), men kurven skyldes simpelthen, at ISM'en ikke har evne til at opdage de skiftende TMA-koncentrationer hurtigt nok. Forøgelse af afstanden mellem mikroelektroderne (op til 150 μm) kan give mere tid til ISM'en til at reagere og kan forbedre kurvepasningen. Et svagt reaktion kan indikere, at ionbytteren er trukket op inden i spidsen. Dette kan ses under et sammensat mikroskop, og hvis det er til stede betyder silaniseringen var dårlig, og at ISM skal kasseres. Dertil kommer, at drift i ISM-signalet kan medføre unøjagtige tilpasninger af dataene. Det er op til eksperimentet at afgøre, om driften påvirker dataene uden tolerance.
Begrænsninger af RTI
THer er adskillige begrænsninger for RTI-metoden på grund af antagelser bag dataanalysen. Disse antagelser indbefatter et krav til vævshomogenitet og vævsisotropi i både hjerneområdet af interesse og et sfærisk volumen, der omgiver denne region. I forbindelse med RTI kræver vævshomogenitet, at diffusionsparametrene er konstante inden for det område af interesse. Væv isotropi betyder, at en enkelt værdi af D * gælder for alle tre rumlige akser. Hvert molekyle, der frigives fra en kilde-mikroelektrode, tager en tilfældig vej, inden den kommer til stillingen af optagelsen ISM. Spændingen på ISM, der repræsenterer antallet af molekyler ( dvs. koncentration) registreret på et enkelt tidspunkt, omfatter molekyler, der har rejst i alle tre rumlige akser, såvel som nogle molekyler, der har rejst ud over ISM'en og er vendt tilbage til målingerne Punkt ( figur 1c ). Under RTI data analyse, Walter programmet generAtes gennemsnit a og λ , som omfatter diffusion af alle molekyler, der rejser i alle akser fra en punktkilde til ISM. Hvis diffusionshastigheden er signifikant forskellig i en af de tre rumlige akser (anisotropi) eller hvis vævet er ikke-homogent, kræves yderligere dataindsamling og dataanalyse for at beregne a og λ 8 , 14 .
Ud over de ovennævnte vævsforudsætninger kræver RTI-metoden, at afstanden mellem en punktkilde og ISM, der omtales som r , er ca. 80-130 um. Når r er faldet under 50 μm, er ISM-responset muligvis ikke hurtig nok til at registrere diffusionsafhængige ændringer i koncentrationen af probemolekylet. Dette kan afhjælpes i fremtiden ved hjælp af koncentriske ISM'er med hurtigere responstider 10 , 15 . Større rAfstande minimerer også hjernens regionuafhængige forskelle i ECS-miljøet, ISM-tipstørrelsen og hjernevævskader under ISM-placering. Omvendt, når r er forøget ud over 150 μm, er diffusionen af molekyler fra den iontoforetiske punktkilde mere modtagelig for indflydelse af ikke-isotrope, inhomogene elementer, der omgiver hjerneområdet af interesse eller vævsperfusionsgrænsen 14 .
Indeholder RTI og alternative teknikker til at udforske ECS
RTI-metoden tilhører en større gruppe af teknikker, der anvender en molekylær probe til at studere ECS'en; Hver metode har sine egne fordele og mangler. Mens RTI muliggør en nøjagtig beregning af både α og λ i realtid, kræver metoden en ladet molekylær probe, der kan detekteres af en ionbytter. I eksperimenter, hvor iontoforese ikke er egnet, såsom undersøgelsen af en uladet probe, iOntophorese kan erstattes af trykudkastning. Uheldigvis tillader nuværende teknikker ikke beregningen af α med trykudkastning, fordi det frigivne volumen afhænger af det injicerede mediums 16 egenskaber. For at anvende en probe, som ingen veksler eksisterer, kan sonden være fluorescensmærket og dens diffusion gennem ECS målt ved epifluorescerende mikroskopi. Denne teknik, kendt som integrativ optisk billeddannelse (IOI), er begrænset af størrelsen og tilgængeligheden af fluorescensmærkede molekyler og potentialet for cellulær optagelse 17 , 18 . IOI-teknikken har den fordel, at makromolekyler kan anvendes som prober, og det har vist, at λ stiger med molekylær størrelse. Endelig har en vigtig klasse af diffusionsmetoder anvendt radiotracere, men de er ikke længere til fælles brug 2 .
Fremtidige applikationer af RTI
in vivo og udvide dens potentiale 1 , 4 , 6 . Det kan også bruges til at teste virkningerne af en bred vifte af ændringer i hjernens fysiologi, såsom dem der er forårsaget af ændringer i det kemiske miljø, farmakologi, traume eller genetisk knockout 1 . Så længe ændringen induceret i ECS varer i en periode på ca. 2 minutter eller mere, kan RTI give en præcis kvantificering af ECS volumenfraktion og tortuositet.
Mens der er sket betydelige indsigter i strukturen og funktionen af hjernens ECS i de sidste 50 år, er derForbliver mange ubesvarede spørgsmål. For eksempel er det stadig uklart, om og hvordan homeostatiske mekanismer regulerer α og hvordan ændringer i α påvirker hjernefunktionen. Computermodeller har hjulpet med at estimere de relative bidrag fra cellegeometri og andre faktorer, der påvirker λ , men der er brug for mere arbejde 1 . Endelig er ECS 'rolle i patogenesen af neurologisk sygdom (og omvendt) stort set uudforsket. I den nærmeste fremtid kan RTI-målinger forbedre målrettet lægemiddellevering til bestemte hjerneområder 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af NIH NINDS tilskud R01 NS047557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A/D and D/A converter | National Instruments Corporation | NI USB-6221 DAQ | The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available. |
| agarose | Lonza | NuSieve GTG Agarose #50081 | to prepare dilute agarose gel for RTI measurements |
| amplifier for ISM | Dagan | Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier | ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages |
| biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) | for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope | ||
| borosilicate theta capillary glass tubing | Harvard Apparatus | Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 | double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm |
| brush | Winsor & Newton | University Series 233, size 0 | round shoft handle brush, available from Amazon |
| bunsen burner | Fisher | ||
| camera for visualizing micropipettes | Olympus | OLY-150 | requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional |
| chart recorder | to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished | ||
| chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% | Sigma-Aldrich | catalog # 92360 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| Commercial Software | The MathWorks | MATLAB, Data acquisition toolbox | for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available. |
| eye protective goggles | Fisher | ||
| fixed-stage compound microscope | Olympus | BX51WI | can use other compound microscopes with fixed stages |
| forceps | Fine Science Tools | #11251-10 | to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work |
| fume hood | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab | ||
| glass microscope slide | Fisher | #12-550A | to chip microelectrode tips |
| heater/stirrer | Fisher | Corning PC-420D | to prepare dilute agarose gel and stir solutions |
| iontophoretic unit | Dagan | ION-100 and PS-100 | ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites) |
| liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium | World Precision Instruments | IE190 Potassium Ion Exchanger | Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight. |
| microelectrode holder | WPI | M3301EH | to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH. |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition |
| micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing |
| microprobe thermometer | Physiotemp | Model BAT-12R | fine probe of this thermometer is placed close to recording site |
| needle | BD | Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) | for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm) |
| objective 5X dry | Olympus | MPlan N | |
| objective 10X water immersion | Olympus | UMPlan FL N | 10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm |
| plastic containers (with lids) | Fisher | #14-375-148 | to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes |
| platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope | EXFO | Gibraltar Burleigh | platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability |
| porous minicup | for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade | ||
| reusable adhesive | Bostik | Blu-Tack | for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon |
| robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning | Sutter Instruments | MP-285 | two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text). |
| signal conditioning unit with low-pass filter | Axon Instruments | CyberAmp 320 or 380 | no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed. |
| silver wire | A-M Systems | #7830 | diameter 0.015", bare (no coating) |
| slice chamber | Harvard Apparatus | Warner Model RC-27L | this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber |
| stereomicroscope | for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers | ||
| syringe, 10 mL | BD | Syringes and Needles #309604 | to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip |
| syringe filter 0.22 µm pore | Whatman | #6780-1302 | to filter backfill solutions; available from Fisher |
| syringe needle, 28 gauge, 97mm | World Precision Instruments | MicroFil MF28G-5 | to backfill microelectrodes |
| Teflon (=PTFE) tubing | Component Supply | STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) | for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax. |
| temperature control system | Harvard Apparatus | Warner Models TC-344B and SH-27A | TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers |
| tetramethyammonium (TMA) chloride | Sigma-Aldrich | T-3411 | 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1000S | to cut brain slices |
| xylenes | Fisher | X5-1 | for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description |
References
- Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
- Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
- Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
- Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
- Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
- Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).
- Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
- Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
- Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
- Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).
- Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
- Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
- Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
- Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
- Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
- Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
- Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
- Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).
