Summary
小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典转基因( 即转基因的随机整合)和CRISPR介导的基因靶向。该协议审查显微注射的最新发展,特别强调质量控制和基因分型策略。
Abstract
使用转基因小鼠对生理和病理体内过程的研究有显着的贡献。将DNA表达构建体的原核注射到受精卵中仍然是产生用于过表达的转基因小鼠的最常用技术。随着用于基因靶向的CRISPR技术的引入,原核注入受精卵母细胞已经扩展到敲除和敲入小鼠的产生。这项工作描述了用于注射的DNA的制备和用于基因靶向的CRISPR指南的产生,特别强调质量控制。识别潜在创始人所需的基因分型程序至关重要。本文介绍了利用CRISPR“复用”能力的创新型基因分型策略。还概述了外科手术。一起,协议的步骤将允许生成gen以及随后建立的大量研究领域的小鼠集落,包括免疫学,神经科学,癌症,生理学,发育等。
Introduction
在脊椎动物和无脊椎动物中的动物模型已经有助于检查人类病情如阿尔茨海默病1,2的病理生理学。他们也是寻找疾病修饰剂的最宝贵的工具,并最终开发出新的治疗策略,希望得到治愈。虽然每个模型都有固有的局限性,但是使用动物作为整个系统模型对于生物医学研究至关重要。这是因为组织培养不能完全模拟代谢和复杂的生理环境。
迄今为止,鼠标仍然是用于遗传操作的最常见的哺乳动物物种,因为它具有几个优点。与疾病相关的生理过程和基因在小鼠和人之间是高度保守的。小鼠是第一个拥有全基因组测序的哺乳动物(2002年),人类基因组前一年我(2003)。除了丰富的遗传信息,小鼠具有良好的育种能力,快速的开发周期(从受精到断奶6周)和合理的大小。所有这些优点,加上生理指标,如独特的外套颜色(交叉策略所需),使得鼠标成为遗传操作的有吸引力的模型。值得注意的是,在现代遗传学的很早的时代,格雷戈尔·门德尔(Gregor Mendel)开始对老鼠进行植物移植3 。
基因转移技术导致在三十年前第一代转基因小鼠的产生4 ,最初使用病毒递送。然而,研究人员很快意识到,小鼠转基因的主要挑战之一是无法控制外源DNA的命运。因为转基因向小鼠卵母细胞的病毒递送导致随机地整合到基因组中的多个拷贝,这是可能的建立后续转基因株系的限制。
当Gordon 等人通过显微注射产生第一个转基因小鼠系列5,6 。这开始了重组DNA技术的时代,影响显微注射结局的参数已被广泛研究7 。虽然显微注射不允许控制转基因的整合位点(最终导致每个创始人小鼠的特异性表达水平),但是原核显微注射的主要优点仍然是形成连续体( 即,转基因的多个拷贝的阵列,在基因组整合前5) 。多年来已经使用这种特征来建立数千个过表达感兴趣的基因的转基因小鼠品系。从那时起,转基因,a生物体基因组的人工修饰已广泛用于鉴定单一基因在疾病发生中的作用。
当马里奥·卡佩奇奇成功地破坏了小鼠中的单个基因时,达到了操纵小鼠基因组的另一个关键成果,打开了基因靶向时代8 。然而,基于ES细胞的基因靶向快速出现主要缺点,包括培养ES细胞的挑战,嵌合体的程度有所不同,以及进程的长度( 即 12-18个月,最小化获得小鼠) 。
最近,已经出现了诸如工程内切核酸酶( 例如锌指核酸酶(ZFN),转录激活物样效应核酸酶(TALEN))和聚集的定期交织的短回文重复序列(CRISPR / Cas9)的新技术的进展,作为替代方法加速麦克风中基因靶向过程e 9,10 。这些核酸内切酶可以通过显微注射容易地注入小鼠卵母细胞,从而在短短6周内产生基因靶向的小鼠。
自从关于使用CRISPR进行基因组编辑的第一份报告11以来,这种细菌适应性免疫系统由于具有许多优点而取代了ZFN和TALEN,包括易于合成和一次靶向多个基因座的能力(简称“复用” “)。 CRISPR首先用于小鼠12中的基因靶向,并已被应用于从植物到人类的无数种类13,14 。迄今为止,还没有关于抗CRISPR基因组编辑的单一物种的报道。
产生转基因小鼠的两个主要限制步骤是注射卵母细胞和再植入的这些卵母细胞变成假怀孕的雌性。尽管我们已经描述了这种技术15和其他16 ,但是近来在小鼠胚胎学和基因转移技术方面的技术改进已经改变了生产转基因小鼠的过程。这里将描述这些改进。
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Protocol
所有程序已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准。
1.准备转基因(随机整合)
- 分析琼脂糖凝胶电泳。
- 根据制造商的建议,使用合适的酶(1小时孵育)或快速消化酶(15至30分钟孵育)在热循环仪中消化质粒以切割转基因(参见图2A及其图例)。
- 加入1%三醋酸乙二胺四乙酸(EDTA)(TEA)琼脂糖凝胶,用0.5-1.0μg/ mL溴化乙锭(EtBr)染色。
注意:使用EtBr时要小心;它是一种有效的诱变剂。请使用适当的个人防护装备(参见材料安全数据表)。 - 加载1 kb分子量标记。
- 加载线性化片段( 即转基因和骨架)。 在100V下运行电泳45分钟。
- 可视化紫外线(UV)透射仪上的凝胶,以检查消化是否完整并确认转基因的正确大小( 即 7,338 bp; 见图2A )。
- 制备琼脂糖凝胶电泳。
- 注射1%TAE琼脂糖凝胶,用低毒凝胶染色剂染色。加载不含分子量标记物的8等份(每个1μg)线性化转基因,并在100V下运行45分钟。使用手术刀切除对应于线性化转基因的所有8个带。
- 根据制造商的建议,使用凝胶提取试剂盒提取DNA(参见材料表 )。
- 将凝胶碎片在50℃在1.5-mL管中熔化至少15分钟。用异丙醇沉淀,然后加入结合缓冲液。
- 结合整个DNA将其全部移入一列。洗脱到不含核酸酶的显微注射缓冲液(8mM Tris-HCl和0.15mM EDTA)中。通过0.22微米离心过滤器过滤并以12,000 x g离心60秒。
- 使用分光光度计测量DNA的浓度和质量。检查A260 / A280的比例在1.8左右( 即没有蛋白质污染),A260 / A230的比例至少为2.0( 即没有有机溶剂污染)。在无核酸酶的显微注射缓冲液中稀释至3ng /μL,等分(20-50μL),并在-20℃下冷冻。
2. CRISPR成分的合成(基因靶向)
- Cas9 mRNA。
- 在无核酸酶的显微注射缓冲液中,将Cas9 mRNA(从商业来源获得,参见材料表)稀释至1μg/μL的浓度。
- 等份在2μL和免费在-80°C。
- 单向导向RNA(SgRNA)。
- 使用计算设计工具识别所需的双靶基因组序列(指南),允许最小的潜在脱靶活动17 。
- 对于基因敲除,系统地选择位于相反方向上几百个碱基对(bp)的两个指南,并且包括感兴趣的基因的起始密码子。对于同源性直接修复,选择两个重叠的引导(尽可能),在相反的方向。
注意:例如,以下指南最近已成功地共同注射以破坏TPM4.2基因的第一个外显子:
指南1:5'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
指南2:5'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
- 对于基因敲除,系统地选择位于相反方向上几百个碱基对(bp)的两个指南,并且包括感兴趣的基因的起始密码子。对于同源性直接修复,选择两个重叠的引导(尽可能),在相反的方向。
- 订购一组如表1所示的引物。
- 合成线性DNA模板。
- 稀释px330不含核酸酶的水中的质粒为10ng /μL。
- 准备主混合物,如表1所示 。最后添加聚合酶,并将主混合物保持在冰上。
- 混合并分成8个PCR管(19μL/管)。每管加入1μL的px330,并在以下条件下进行PCR:98℃1分钟; 98℃10秒,64℃30秒和72℃15秒的40个循环;最后在72℃延伸5分钟。保持在4°C。
- 使用PCR纯化试剂盒(参见材料表 ),歧管和真空源(用于更快的处理)来纯化PCR产物。应用最大真空强度( 即 8毫巴)。
- 向1体积的PCR样品中加入5体积(100μL)的结合缓冲液并混合。
- 将(提供的)二氧化硅膜旋转柱放置在(提供的)2-mL收集管中用于离心,或在歧管上进行真空处理ING。为了结合DNA,将所有8个样品连续施加到柱上,并对每个负载以12,000 xg进行真空或离心60秒。
- 为了洗涤,向柱中加入0.75mL洗涤缓冲液(缓冲液PE),真空或以12,000xg离心60秒。以12,000 xg离心柱60 s,以消除残留的乙醇。
- 将色谱柱置于干净的1.5 mL微量离心管中。为了洗脱DNA,将30μL无核酸酶的水加入到膜的中心,让柱静置1分钟,并以12,000g离心60秒。
- 使用分光光度计测量浓度;通常浓度应为100ng /μL或更高。检查A260 / A280的比例在1.8左右( 即没有蛋白质污染),A260 / A230的比例至少为2.0( 即没有有机溶剂污染)。
- 使用T7 RNA合成试剂盒进行体外转录。
- 准备t他的主要混合物,如表1所示 ,并在37℃下在热循环仪中孵育3小时。加入28μL无核酸酶水和2μLDNA酶I,并在37℃下在热循环仪中孵育另外15分钟。
- 使用旋转柱进行RNA纯化。
- 将所提供的旋转柱中包含的粉末溶解在650μL不含核酸酶的显微注射缓冲液中,小心地清除所有气泡。在室温下盖上管子并水化5-15分钟。
- 取出底部的蓝色帽子,并将色谱柱放入2-mL管中。以750 xg和室温离心2分钟。将色谱柱放入新鲜的1.5 mL管中,并将50μLRNA溶液逐滴加入中心,而不要接触柱壁。在750 x g下旋转色谱柱2分钟。
- 使用分光光度计测量RNA浓度(一个反应的典型产率为30 - 50μg)。检查A260 / A280比率是否为( 即没有蛋白污染),A260 / A230比例至少为2.0( 即没有有机溶剂污染)。将sgRNA存储在-80°C直到使用。
- 使用常规用于DNA电泳的1%TAE凝胶评估RNA的质量。运行200-400 ng的DNA模板和相应的sgRNA并行。 RNA带(≈100bp)应略大于DNA条带( 见图3A )。
- 使用计算设计工具识别所需的双靶基因组序列(指南),允许最小的潜在脱靶活动17 。
捐助者模板
- 订购商业合成的单链寡核苷酸(ssOligos,参见材料表 ),用于点突变或用于整合至50 bp的小序列;同源臂通常为60-90 bp长。
- 对于较大的插入,使用供体质粒作为模板。使用经典的克隆方法或从头孢菌素合成生成合适的质粒商业来源。
注意:建议每个同源臂至少800 bp。主干的大小对同源直接修复(HDR)的效率没有影响。
4.注射混合
- 使用不含核酸酶的显微注射缓冲液进行基因敲除实验,将Cas9 mRNA稀释至50ng /μL,sgRNA至12.5ng /μL(总共为25ng /μL)。添加浓度为200 ng /μL的供体模板(ssOligo或质粒),用于基于同源性直接修复的基因组编辑实验。
注意:可以使用在线工具(如重悬浮计算器18)轻松确定稀释量。 - 在显微注射会话期间将每个等分试样保持在冰上,然后丢弃(不要重新冷冻注射组合)。
5.阴道输精管切除术
注意:两种类型的输精管切除术通常在小鼠中进行:腹部和阴囊。后者是较少侵入性的,之前已经描述过15 。
- 高压灭菌所有不锈钢手术器械。
- 使用称重确定小鼠的体重,并用注射麻醉药(氯胺酮100mg / kg,赛拉嗪10mg / kg)腹膜内(ip)注射麻醉麻醉男性。
- 监测脚趾反射的损失,一旦鼠标被镇静放置在加热垫的顶部。
- 用局部消毒剂如氯己定和70%乙醇的交替擦拭来消毒睾丸周围的皮肤。
- 将睾丸推入阴囊,并用手术刀进行皮肤切口。
- 可视化睾丸,睾丸附睾和输精管。
- 用镊子抓住输精管,握住镊子并在镊子的两侧灼烧,以移除3 mm的输精管。
- 对第二睾丸执行相同的程序。
- 用伤口夹闭合皮肤切口并监视鼠标紧密直到完全恢复。
6.超排卵(卵母细胞供体)和时间交配(假怀孕女性)
注意:在其他地方已经描述了产生合适数量的受精卵母细胞和插入寄生雌虫进行再植入的技术。
- 在第1天下午12点左右,注射10只雌性ip与5IU的怀孕母马血清促性腺激素(PMSG;100μL)。
- 在46-48小时后(第3天上午11点左右),用5IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG;100μL)注射雌性ip。
- 在一夜之间立即与单身男性交配的女性。
原核(随机整合)和细胞质(基因靶向)注射
- 如先前所述,通过颈部脱位剔除超排卵小鼠,暴露腹部,并进入卵巢和输卵管。解剖o导管并在立体构架仪15下收获卵丘 - 卵母细胞复合物(COCs)。将它们放入一滴补充有氨基酸(KSOMaa)的单纯疱疹优化培养基,按照传统方法15 。
- 通过使用吸气嘴口将近似的1μL透明质酸酶(10mg / mL)添加到KSOMAA培养基的滴中并将培养皿放置在37℃/ 5%CO 2培养箱中30秒至1分钟来净化卵母细胞。
- 使用吸气嘴口用4个新鲜的KSOMAA培养基洗涤卵母细胞,并将其转移到用矿物油(约2mL)覆盖的最后一滴KSOMaa培养基中。将盘放在37°C / 5%CO 2培养箱中,直至卵母细胞准备注射。
- 原核注射(随机整合)。
- 在立体显微镜下可视化鸡蛋,并将大约50个鸡蛋转移到注射室p的M2介质用矿物油覆盖)使用吸气嘴。
- 将注射室转移到倒置显微镜,并注射受精的卵母细胞(两个可见原核)与几个注射液混合物,靶向原核(任何原核可以靶向)。通过观察原核的肿胀来观察成功的注射。
- 细胞质注射(基因靶向)。
- 使用口器将大约50个卵转移到含有5μg/ mL细胞色素B的KSOMaa的一滴,并在37℃/ 5%CO 2培养箱中孵育5分钟。
- 使用嘴巴将鸡蛋转移到注射室。
- 使用自动化显微注射器的补偿压力尽可能在极低压(50-100hPa))将注射混合物的少量皮下注射入细胞质。
- 注射后,将卵母细胞转移到一滴KSO中哇哇哇哇哇哇哇哇哇哇咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔咔
8.重新植入
- 高压灭菌所有不锈钢手术器械。
- 使用称重确定小鼠的体重,并通过注射麻醉剂(氯胺酮100mg / kg,赛拉嗪10mg / kg)腹膜内(ip)注射雌性麻醉。
- 监测脚趾反射的损失,一旦鼠标被镇静放置在加热垫的顶部。
- 将大部分皮毛围绕在雌鼠的背部中线上。
- 用局部消毒剂如氯己定和70%乙醇的交替擦拭来消毒暴露的皮肤。
- 按照传统方法15暴露生殖道。做一个1厘米长的皮肤切口平行于背部中线,切割肌肉,并抓住脂肪垫wi镊子,然后轻轻拉出卵巢,直到其附着的输卵管和子宫清晰可见。
- 用容器夹固定脂肪垫。在立体显微镜下可视化输卵管,并使用一把微型剪刀在壶腹上游几毫米的输卵管壁上进行切口。
- 在立体显微镜下,将25个微注射的卵装入连接到口部的玻璃毛细管(毛细管的内径应为120μm宽)。将玻璃毛细管引入输卵管并排出直到壶腹内可见气泡。
- 轻轻取出玻璃毛细管并将生殖道放回腹部。用3-0不可吸收的外科缝合线缝合切口,然后用伤口夹闭合。密切监视鼠标直到完全恢复。
基因分型策略/排序
注意:隔离基因组根据相关动物伦理规定,从2毫米尾部或耳朵活组织检查DNA。
- 快速基因组DNA提取(随机整合)。
- 在100μL碱性裂解试剂(25mM氢氧化钠和0.2mM EDTA,pH = 12)中将组织样品(〜2mm)在95℃下裂解1小时。
- 加入100μL中和剂(40 mM Tris-HCl,pH = 5)。
- 在12,000g和4℃下离心5分钟。
- 高质量的基因组DNA提取(基因靶向)。
- 加入500μL尾缓冲液(50mM Tris,pH = 8; 100mM EDTA,pH = 8; 100mM NaCl; 1%SDS和0.5mg / mL蛋白酶K,新鲜加入)。
- 在55℃下孵育过夜。
- 通过反转混合5分钟(不要旋涡)。
- 加入250μL饱和NaCl(6 M),倒置搅拌5分钟(不要旋涡)。
- 在12,000 xg和4℃下旋转5-10分钟,将上清液倒入新管中。 加入500μL异丙醇,倒置搅拌5 min(不要旋涡)。
- 在12,000 xg和室温下旋转10分钟。
- 倾倒上清液(颗粒不可见,粘在管上)。
- 用1 mL 70%乙醇洗涤。
- 在12,000 xg和室温下旋转5-10分钟。去除上清液,小心,因为白色颗粒不粘,可以丢失。
- 空气干燥〜1 h。
- 加入400μLTE缓冲液(10mM Tris和1mM EDTA,pH = 8)。
- 将DNA在55-60℃溶解2小时。
- 底漆设计。
- 使用计算工具设计引物至少20 bp长。
注意:对于随机整合,引物应与转基因杂交,产生200-800bp的不同片段。为了基因靶向,设计引物使其与基因组DNA杂交,产生不同的f在切割地点周围数百bp的碎片。对于大的插入,引物可以位于转基因上,但是随后使用引物步行或类似技术来进行靶向整合的确认。
- 使用计算工具设计引物至少20 bp长。
- PCR基因分型。
- 对于每个基因组修饰,设计一个新的PCR方案并经验检验。考虑产生的片段的长度和每对引物的解链温度(Tm)。
- 测序。
- 对于基因定位,将PCR产物发送给Sanger测序服务提供商。
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Representative Results
下面描述了在随机整合和CRISPR介导的基因靶向的情况下显微注射的工作流程( 图1 )。
图1:产生转基因小鼠的典型工作流程。对于随机整合,将纯化的转基因注射入受精卵母细胞的原核,然后输卵管转移到插入的寄养雌性中。在快速的基因组DNA提取后,通过PCR进行后代的分析。对于CRISPR基因靶向,使用本文所述的非克隆方法合成sgRNA,并将两个指南与受精卵母细胞共同注射(与Cas9 mRNA一起)。该策略用于后续的基于PCR的分析,后者需要高度纯化的g核糖体DNA。 请点击此处查看此图的较大版本。
虽然卵母细胞的显微注射和这些注射的卵的再植入是需要技术技能和培训的两个主要限制步骤,但注射组合的质量对于成功生产转基因小鼠是至关重要的。应在分析琼脂糖凝胶上系统评估转基因纯化的质量( 图2A )和sgRNAs合成( 图3A )。当使用分光光度计测量浓度时,还应检查混合物的潜在污染物,因为不同的吸收值直接取决于溶液的纯度(见步骤1.2.3,2.2.3.5和2.2.5.3)。
图2B )和基因靶向( 图3B )的显微注射会话的典型读数。取决于实验的类型,DNA提取方案也不同。随后的PCR依赖于分别在转基因或基因组DNA上杂交的引物。这里提出的策略允许简单的故障排除和精简生产转基因小鼠所需的每个步骤。
虽然显微注射会话的定量结果取决于实验者的经验,但是一旦方案的每个步骤被优化,获得的转基因小鼠的百分比通常应当达到10-25%,用于随机整数比例如图2B所示 (4名创始人中有15名小孩出生= 26.6%)。这种“低”效率与CRISPR组件编辑小鼠基因组的可靠能力形成对比。实际上,当使用CRISPR进行基因靶向时,创建者的数量通常更高,范围从25-100%( 见图3B ; 13个幼仔中的3个创始人= 23%)。获得使用CRISPR编辑的成功纯合子的整个后代并不罕见。
图2:成功生产转基因小鼠过表达的质量控制和基因分型策略。 ( A )质粒用PvuI和NotI消化1小时。完全消化和正确的大小( 即转基因= 7,338 bp,主链= 1,440+ 896bp)在分析凝胶(1)上检查。从制备型凝胶(2)中提取几种消化产物产生增加的转基因浓度。应避免长时间暴露于紫外线,并建议使用蓝光代替UV透照器。 (B)基因分型策略(1):引物应位于转基因上,应设计为产生200 - 800 bp的片段。当进行基因分型时(2),建议包括阳性对照( 即用于显微注射的注射混合物)和阴性对照( 即来自WT小鼠的基因组DNA)。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3:质量控制和基因分型Stra为基因靶向(KO)小鼠的成功生产而努力。 ( A )通过体外转录产生的sgRNA的质量通过对每个指南并行运行DNA模板和产生的RNA来评估。 RNA的大小略大于DNA。如果质量满意( 即没有涂片带),则测量浓度。 ( B )(1)包含外显子1中起始密码子的两个引导物(相反方向)的设计。选择引物以与由两个引物最终切除的区域外的基因组DNA杂交。通常,该策略允许使用PCR(2)直接鉴定杂合(#5和9)和纯合(#3)KO创始人。纯合动物的PCR产物不显示任何WT带。 请点击此处查看此图的较大版本。
(2.5)
gttttagagctagaaatagcaagttaaaata
aggctagtc 3'
(2.6)
表1:本研究中使用的不同主混合物的组成。线性DNA模板的合成:T7启动子最小序列(TTAATACGACTCACTATAG)在20-bp序列(指南;使用CRISPR设计工具鉴定的N20)的上游和与表达载体互补的序列(gttttagagctagaaatagcaagttaaaaggaggagag)上游。 体外转录(IVT):根据DNA模板的浓度,最终体积应调整到20μL,不含核酸酶的水。
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Discussion
协议中的关键步骤
已知基因修饰的小鼠的产生在技术上是具有挑战性的。然而,这里提出的协议是一种优化和简化的方法,可以在记录时间内掌握和排除故障。成功完成技术需要两个步骤。首先,不用氯化镁(MgCl 2 )可以实现线性DNA模板的合成(用于合成sgRNA)。然而,强烈建议系统地将MgCl 2加入到主混合物中,因为在没有MgCl 2的情况下经常防止正向引物的部分杂交。此外,靶基因组序列不存在于供体模板的任何部分(在靶向整合的情况下)至关重要,否则Cas9核酸酶将切割它,从而防止HDR的发生。
修改和故障排除
尽管多年来这种用于产生转基因小鼠的方案已被优化和精简,但是对于用于显微注射的优质卵母细胞的产量和育成雌性的插入率有一些考虑。背景应变的选择对于由显微注射会话产生的活的幼仔的数量至关重要。 C57BL / 6是小鼠模型疾病最常用的背景。然而,它也是抵抗显微注射20的效率较低的背景之一。此外,女性的年龄对产生大量卵母细胞也至关重要;建议避免5-8周龄小鼠,无论背景如何,因为这是对激素刺激反应最不利的时期21 。根据我们的经验,3至4周龄的C57BL / 6小鼠可靠地产生每只雌性20-30只鸡蛋。重要的是要请注意,一种新技术(称为超超排卵)每位雌性产生100个卵,最近已被用于产生显微注射的卵母细胞22 。然而,由于需要人为施肥( 体外受精 )这样大量的鸡蛋,通常会阻碍使用超超排卵进行显微注射。
为了获得适合再植入的插管寄养女性,雌性小鼠与输精管切除的男性配对(这些小鼠的背景不是关键的)。为了增加收容人的数量,可以仔细检查发情期和选择合适的女性23 。女性周期的同步也可以通过在交配前两天将女性暴露于输精管切除的男性(所谓的“Whitten效应”) 24中诱发。
技术的局限性
非常小的基因组修饰,如点突变,相对容易产生,但是难以识别。当进行基因分型时,PCR产物通过Sanger测序直接测序。然而,CRISPR成分直接显微注射到小鼠卵母细胞中通常会产生马赛克动物,因为Cas9在相当长的时间内保持活性,并且在卵母细胞的第一次分裂后可能发生不同的基因组修饰。这种混杂的影响使各种等位基因中的离散突变的鉴定复杂化,下一代测序(NGS)可以帮助挑战阅读。敏感的技术,如四引物ARMS-PCR, 25也可以帮助通过测序识别创始人之后对殖民地进行基因分型。
相反,以目标方式插入大片DNA仍然是挑战性的。外源DNA越大,HDR效率越低。因此,目前正在开发诸如使用长ssOligos供体(代替质粒) 26或HDR独立目标集成27等新策略。
协议的意义
该协议提出了重大进展,因为在我们的实验室中已经优化,测试和验证了四个主要步骤( 即,准备转基因或CRISPR组分,显微注射,再植入和基因分型)。
转基因的随机整合被广泛用于过表达研究,主要有两个原因。首先,确定潜在的“位置效应”,使用CRISPR在“安全港”地带(如Rosa26 28和Col1a 29位点)中靶向整合的转基因仍然是非常有挑战性的,因为HDR的效率很低。克服这个问题的策略即将到来26,27 ,但随机整合迄今证明更有效率。此外,过度表达具有不同表达水平的相同转基因的多个转基因品系的产生在涉及逆转表型30的治疗策略的研究中是令人感兴趣的。基于质粒的转基因通过克隆产生,使用特异性限制酶来组装用于表达目标蛋白质的必需片段。通常,转基因由至少三种元素制成:合适的启动子(有时加入增强子区域);编码序列(cDNA),有或没有内含子区域;和PolyA尾部稳定mRNA表达31 。
一旦组装,将转基因插入含有细菌复制元件的质粒中,并在转化后通常在培养基中扩增(通常以热休克为基础)。用于显微注射的转基因的纯化方法是至关重要的。这项工作描述了使用新一代(低毒性)DNA污渍,以更准确地观察凝胶上的感兴趣片段(与传统结晶紫相比)和低诱变暴露(与溴化乙锭相比)。
本文所述的用于基因靶向的非克隆方法非常快,并且允许在5-6小时内合成几种sgRNA。只需要四个步骤:鉴定目标序列,合成含有T7启动子的线性DNA模板和选择的靶序列,合成o通过体外转录(IVT)的sgRNA和使用旋转柱纯化sgRNA。
在CRISPR小鼠基因组编辑的初期,系统评估了潜在的脱靶效应,尽管它已显示在小鼠胚胎32中非常有限,并且可以通过育种方案容易地稀释,其中选择的小鼠仅携带所需的基因组修饰。目标活动也在体外进行系统预评估,使用不同的指南并选择更活跃的一个。这种做法现在不太常见,原因有几个。首先,使用编码CRISPR的质粒转染永生化小鼠细胞系(通常为N2a或NIH3T3)评估靶向活性。这与将CRISPR RNA组分注射入小鼠卵母细胞的方法不同。因此, 体外发现的结果并不总是平等地翻译到卵母细胞。此外,高通量实验表明,大多数指南是活跃的33 。因此,目标活动没有得到评估,到目前为止,还没有迹象表明小鼠卵母细胞没有活动。再加上合成sgRNAs的非克隆方法,这样可以大大简化和简化工作流程,并且可以在一天内无缝地合成多个主动指南。
CRISPR被认为是一种“破坏性技术”,这是一种改变技术执行方式的创新。当显微注射成立时,Brinster 等显示细胞质转基因虽然可以实现,但仍然主要是低效7 。因此,原核显微注射仍然是近30年来唯一常见的做法,直到首次证明CRISPR成功靶向小鼠为止。本研究显示细胞质显微注射离子可以产生与原核递送相比相似或更好的结果12 。显然,由于CRISPR成分通常由RNA制成,所以显然细胞质是靶向的。然而,即使注射到细胞质中,供体模板也可以成功地诱导HDR。高细胞质浓度的模板使其能够扩散到细胞核中。此外,不需要使用压电驱动的细胞质显微注射16 。卵母细胞与细胞骨架抑制剂(例如细胞松弛素B)的短暂孵育增加了卵母细胞34,35的存活,使其足以在没有压电冲击驱动系统的情况下进行细胞质注射。同样地,使用改良的培养基如KSOMaa,减少了在两细胞阶段的阻塞,并改善了与M16培养基相比胚胎的发育能力xref“> 36。
单细胞或双细胞(当培养过夜时)胚胎可以转移到输卵管。常规手术是相当有创的,因为它需要撕裂保护卵巢的囊。在技术上也是具有挑战性的,因为玻璃毛细管需要插入漏斗15 。这里提出的方法更容易学习,不会诱发潜在的出血,并保持卵巢的完整性。它是基于熊本大学开发的工作37 。
基因分型策略和测序技术对于识别潜在的创始人至关重要。对于随机整合,基因组DNA的提取是基于Truett 等人改编的简单方法。 38 。这种快速提取方法足以识别潜在的创始人,因为引物被设计为与转基因杂交(通常是整合的)作为多个副本)。相反,基因靶向需要高度纯化的基因组DNA,因为PCR产物包含修饰的基因组区域。
对于基因敲除,注射单个sgRNA的传统方法产生小的缺失(indel)或插入,最终敲出感兴趣的基因12 。这些小的修饰难以鉴定,并且通常需要耗时的连接酶非依赖性克隆和测序来确认这些突变的性质。
在这个协议中,我们利用CRISPR复用来开发系统共同注射包含目的基因起始密码子的两个sgRNA。这不仅增加了基因敲除的可能性,而且增加了预定义大小(100-300bp)的大量基因组DNA的切除,从而通过简单的PCR方便地识别创始人。值得注意的是,不携带预期基因组e的小狗当只有一个sgRNA被证明是活性的时,xcision仍然可以被分析用于小的移码突变。同样,在基因编辑的情况下,由于细胞修复机制优先使用两条链39之一,所以两个重叠的sgRNA在相反方向的系统共同注射将增加HDR的效率。
未来的应用
本协议利用了小鼠胚胎学和基因靶向的最新进展,以简化和简化生成人类条件的各种复杂的老鼠模型的过程。这些模型在帮助发展我们对病理机制的理解方面发挥关键作用,最终有助于治疗策略的发展2 。基因靶向或随机整合所需的试剂的优化和优化被广泛和容易地应用到任何其他哺乳动物物种,如大鼠,兔子,甚至大型动物,如牛。
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Disclosures
作者通过新南威尔士大学Mark Wainwright分析中心为小鼠提供学术转基因服务。
Acknowledgments
作者感谢动物设施(BRC)的工作人员不断的支持。这项工作由国家卫生和医学研究理事会和澳大利亚研究理事会资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Micropipette 0.1-2.5 μL | Eppendorf | 4920000016 | |
Micropipette 2 - 20 μL | Eppendorf | 4920000040 | |
Micropipette 20 - 200 μL | Eppendorf | 4920000067 | |
Micropipette 100 - 1,000 μL | Eppendorf | 4920000083 | |
Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - Dilute to 1x |
Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
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