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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55765
Automatic Translation
1, 1
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

Summary

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Abstract

Die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen hat wesentlich zu Studien an physiologischen und pathologischen In-vivo- Prozessen beigetragen. Die nukleare Injektion von DNA-Expressionskonstrukten in befruchtete Oozyten bleibt die am häufigsten verwendete Technik, um transgene Mäuse für die Überexpression zu erzeugen. Mit der Einführung der CRISPR-Technologie für das Gen-Targeting wurde die nukleare Injektion in befruchtete Oozyten auf die Erzeugung von Knockout- und Knockin-Mäusen ausgedehnt. Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von DNA für die Injektion und die Generierung von CRISPR-Guides für das Gen-Targeting mit besonderem Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle. Die für die Identifikation von potentiellen Gründern erforderlichen Genotypisierungsverfahren sind entscheidend. Innovative Genotypisierungsstrategien, die die "Multiplexing" -Fähigkeiten von CRISPR nutzen, werden hier vorgestellt. Auch chirurgische Verfahren werden skizziert. Gemeinsam werden die Schritte des Protokolls die Erzeugung von Gen ermöglichenEtikodisch modifizierte Mäuse und für die anschließende Etablierung von Mauskolonien für eine Fülle von Forschungsfeldern, einschließlich Immunologie, Neurowissenschaften, Krebs, Physiologie, Entwicklung und andere.

Introduction

Tiermodelle, sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen, waren maßgeblich für die Untersuchung der Pathophysiologie menschlicher Zustände wie der Alzheimer-Krankheit 1 , 2 . Sie sind auch unschätzbare Werkzeuge, um nach Krankheitsmodifikatoren zu suchen und letztlich neue Behandlungsstrategien in der Hoffnung auf eine Heilung zu entwickeln. Obwohl jedes Modell intrinsische Einschränkungen hat, ist die Verwendung von Tieren als ganze systemische Modelle für die biomedizinische Forschung unerlässlich. Denn die metabolische und komplexe physiologische Umgebung kann nicht vollständig in der Gewebekultur simuliert werden.

Bis heute bleibt die Maus die häufigste Säugetierart, die für die genetische Manipulation verwendet wird, da sie mehrere Vorteile aufweist. Die physiologischen Prozesse und Gene, die mit Krankheiten assoziiert sind, sind zwischen Mäusen und Menschen hoch konserviert. Die Maus war der erste Säugetier, um sein volles Genom sequenziert zu haben (2002), ein Jahr vor dem menschlichen GenoIch (2003). Abgesehen von diesem Reichtum an genetischer Information hat die Maus gute Zuchtkapazitäten, einen schnellen Entwicklungszyklus (6 Wochen von der Befruchtung bis zur Entwöhnung) und eine vernünftige Größe. Alle diese Vorteile, verbunden mit physiologischen Indikatoren, wie unterschiedliche Fellfarben (erforderlich für Crossing-Strategien), machte die Maus ein attraktives Modell für die genetische Manipulation. Vor allem in der frühen Zeit der modernen Genetik begann Gregor Mendel, an Mäusen zu arbeiten, bevor er zu Pflanzen ging 3 .

Gentransfer-Techniken führten zur Erzeugung der ersten transgenen Maus über drei Jahrzehnte her 4 , die anfänglich mit viraler Verabreichung hergestellt wurde. Allerdings erkannten die Forscher bald, dass eine der Hauptaufgaben der Maus-Transgenese die Unfähigkeit war, das Schicksal der exogenen DNA zu kontrollieren. Weil die virale Abgabe von Transgenen in Maus-Oozyten dazu geführt hat, dass mehrere Kopien zufällig in das Genom integriert wurden, die MöglichkeitY der Herstellung nachfolgender transgener Linien war begrenzt.

Eine solche Einschränkung wurde überwunden, als Gordon et al. Erzeugte die erste transgene Mauslinie durch Mikroinjektion 5 , 6 . Dies begann die Ära der rekombinanten DNA-Technologie, und die Parameter, die das Ergebnis einer Mikroinjektionssitzung beeinflussen, wurden weitgehend untersucht 7 . Obwohl die Mikroinjektion keine Kontrolle über die Integrationsstelle des Transgens erlaubt (was schließlich zu spezifischen Expressionsniveaus für jede Gründermaus führt) bleibt der Hauptvorteil der vorkernigen Mikroinjektion die Bildung von Concatemern ( dh Arrays von mehreren Kopien des Transgens, Verknüpft in Serie) vor der genomischen Integration 5 . Dieses Merkmal wurde im Laufe der Jahre verwendet, um Tausende von transgenen Mauslinien zu etablieren, die ein Gen von Interesse überexprimieren. Seitdem, transgenese, die aRtificiale Modifikation des Genoms eines Organismus wurde weitgehend verwendet, um die Rolle einzelner Gene beim Auftreten von Krankheiten zu identifizieren.

Eine weitere wichtige Errungenschaft bei der Manipulation des Mausgenoms wurde erreicht, als Mario Capecchi erfolgreich ein einziges Gen in der Maus unterbrach und die Ära des Gen-Targeting 8 öffnete. Allerdings traten grundsätzliche Nachteile schnell aus dem ES-zellbasierten Gen-Targeting hervor, einschließlich der Herausforderungen der Kultivierung von ES-Zellen, des etwas variablen Chimäritätsgrades und der Länge des Prozesses ( dh 12-18 Monate, minimal, um die Maus zu erhalten) .

In jüngster Zeit haben sich Fortschritte bei neuen Technologien wie z. B. konstruierte Endonukleasen ( z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALEN) und gruppierten regelmäßig zusammengesetzten kurzen palindromischen Wiederholungen (CRISPR / Cas9) als alternative Methoden ergeben Beschleunigen den Prozess der Gen-Targeting in micE 9 , 10 Diese Endonukleasen können durch Mikroinjektion leicht in Mausozyten injiziert werden, was die Erzeugung von Gen-gezielten Mäusen in nur 6 Wochen ermöglicht.

Seit dem ersten Bericht über die Verwendung von CRISPR für die Genombearbeitung 11 hat dieses bakterielle adaptive Immunsystem ZFN und TALEN aufgrund seiner vielen Vorteile, einschließlich der Leichtigkeit der Synthese und der Fähigkeit, mehrere Loci auf einmal (als "Multiplexing" bezeichnet) ersetzt "). CRISPR wurde zuerst für Gen-Targeting in Mäusen 12 verwendet und ist seitdem auf unzählige Arten angewendet worden, von Pflanzen auf Menschen 13 , 14 . Bisher gibt es keinen Bericht über eine einzige Art, die gegen CRISPR-Genom-Bearbeitung resistent ist.

Die beiden Hauptbegrenzungsschritte der Erzeugung von transgenen Mäusen sind die Injektion von Oozyten und die ReimplantationDieser Oozyten zu pseudo-schwangeren Frauen. Obwohl diese Technik von uns 15 und anderen 16 beschrieben worden ist, haben die jüngsten technischen Verbesserungen bei der Mausembryologie und den Gentransfertechniken den Prozess der Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen revolutioniert. Diese Verbesserungen werden hier beschrieben.

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Protocol

Alle Verfahren wurden von der University of New South Wales Animals Care und Ethics Committee genehmigt.

1. Vorbereitung des Transgens (Random Integration)

  1. Analytische Agarose-Gelelektrophorese.
    1. Das Plasmid wird unter Verwendung geeigneter Enzyme (1 h Inkubation) oder Fast-Digest-Enzymen (15 bis 30 min Inkubation) in einem Thermocycler nach den Empfehlungen des Herstellers untersucht (siehe Abbildung 2A und seine Legende).
    2. Es wurde ein 1% iges Trisacetat-Ethylendiamintetraessigsäure- (EDTA) (TEA) -Affarosegel gegossen, das mit 0,5-1,0 μg / ml Ethidiumbromid (EtBr) gefärbt ist.
      HINWEIS: Bei der Verwendung von EtBr Vorsicht walten lassen. Es ist ein starkes mutagen. Bitte geeignete Schutzausrüstung verwenden (siehe Sicherheitsdatenblatt).
    3. Laden Sie eine 1 kb Molekulargewichtsmarkierung.
    4. Laden Sie die linearisierten Fragmente ( dh Transgen und Backbone). Führen Sie die Elektrophorese bei 100 V für 45 min.
    5. Visualisieren Sie das Gel auf einem Ultraviolett- (UV) Transilluminator, um zu überprüfen, ob die Verdauung vollständig ist, und um die korrekte Größe des Transgens zu bestätigen ( dh 7,338 bp, siehe Abbildung 2A ).
  2. Präparative Agarose-Gelelektrophorese
    1. Gießen Sie ein 1% TAE-Agarosegel, gefärbt mit einem niedrigen Toxizitätsgelfleck. Laden Sie 8 Aliquots (je 1 μg) linearisiertes Transgen ohne Molekulargewichtsmarker und führen Sie die Elektrophorese bei 100 V für 45 min durch. Verwenden Sie ein Skalpell, um alle 8 Bänder, die dem linearisierten Transgen entsprechen, zu exzimieren.
    2. Extrahieren Sie die DNA mit einem Gel-Extraktionskit, indem Sie den Empfehlungen des Herstellers folgen (siehe Tabelle der Materialien ).
      1. Die Gelfragmente bei 50 ° C in 1,5-ml-Röhrchen für mindestens 15 min schmelzen. Mit Isopropanol abfließen und dann den Bindungspuffer zugeben.
      2. Kombiniere die gesamte DNA durch Pipettieren alles in eine Spalte. Eluieren in nukleasefreien Mikroinjektionspuffer (8 mM Tris-HCl und 0,15 mM EDTA). Durch einen 0,22 μm Mikrozentrifugenfilter filtrieren und 60 s bei 12.000 x g zentrifugieren.
    3. Messen Sie die Konzentration und die Qualität der DNA mit einem Spektrophotometer. Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis etwa 1,8 beträgt ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis mindestens 2,0 ( dh keine Kontamination durch organische Lösungsmittel). Bis zu 3 ng / μl in nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer, Aliquot (20-50 μl) und bei -20 ° C einfrieren.

2. Synthese von CRISPR-Komponenten (Gen-Targeting)

  1. Cas9-mRNA
    1. Verdünnen Sie die Cas9-mRNA (erhalten aus einer kommerziellen Quelle, siehe Tabelle der Materialien ) bis zu einer Konzentration von 1 μg / μL in nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer.
    2. Aliquot in 2 μl und frei Ze bei -80 ° C.
  2. Single-Guide-RNA (SGRNA).
    1. Identifizieren Sie die gewünschten Zwei-Ziel-Genom-Sequenzen (Guides) mit einem rechnerischen Design-Tool ermöglicht minimale potenzielle Off-target-Aktivität 17 .
      1. Für Gen-Knockout, systematisch wählen Sie zwei Führer, die ein paar hundert Basenpaare (bp) auseinander, in entgegengesetzte Richtungen, und enthalten die Start-Codon des Gens von Interesse. Für die Homologie direkt reparieren, wählen Sie zwei überlappende Führungen (wann immer möglich), in entgegengesetzte Richtungen.
        HINWEIS: Als Beispiel wurden die folgenden Guides vor kurzem erfolgreich zusammengespritzt, um das erste Exon des TPM4.2- Gens zu stören:
        Leitfaden 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
        Leitfaden 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
    2. Bestellen Sie einen Satz von Primern wie in Tabelle 1 beschrieben.
    3. Synthese einer linearen DNA-Matrize.
      1. Verdünnen px330Ref "> 12 Plasmid auf 10 ng / μL in nukleasefreiem Wasser.
      2. Bereiten Sie den Master-Mix wie in Tabelle 1 angegeben vor. Füge die Polymerase am Ende hinzu und halte die Mastermischung auf Eis.
      3. Mischen und auf 8 PCR-Röhrchen (19 μl / Tube) aufteilen. Füge 1 μl px330 pro Röhrchen hinzu und laufe die PCR unter folgenden Bedingungen: 1 min bei 98 ° C; 40 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 64 ° C für 30 s und 72 ° C für 15 s; Und eine Enddehnung bei 72 ° C für 5 min. Bei 4 ° C halten.
      4. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Tabelle der Materialien ), einer Mannigfaltigkeit und einer Vakuumquelle (für eine schnellere Verarbeitung). Die maximale Vakuumstärke ( dh 8 mbar) auftragen.
        1. Füge 5 Volumina (100 μl) Bindungspuffer zu 1 Volumen der PCR-Probe hinzu und vermische.
        2. Legen Sie eine (vorgesehene) Siliciumdioxid-Membran-Spin-Säule in ein (mitgeliefertes) 2-ml-Sammelrohr für die Zentrifugation oder auf den Verteiler für Vakuumverfahren einIng. Um DNA zu binden, sukzessive alle 8 Proben auf die Säule auftragen und vakuumieren oder für 60 s bei 12.000 xg für jede Ladung zentrifugieren.
        3. Zum Waschen werden 0,75 ml Waschpuffer (Puffer PE) in die Säule gegeben und für 60 s bei 12.000 x g vakuumiert oder zentrifugiert. Die Säule für 60 s bei 12.000 xg zentrifugieren, um restliches Ethanol zu entfernen.
        4. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die DNA zu eluieren, füge 30 μl nukleasefreies Wasser in die Mitte der Membran hinzu, lasse die Säule 1 min stehen und zentrisch für 60 s bei 12.000 g
      5. Messen Sie die Konzentration mit einem Spektrophotometer; Typischerweise sollte die Konzentration 100 ng / μL oder höher betragen. Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis etwa 1,8 beträgt ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis mindestens 2,0 ( dh keine Kontamination durch organische Lösungsmittel).
    4. In-vitro- Transkription unter Verwendung eines T7-RNA-Synthesekits.
      1. Vorbereitung tEr mischte, wie in Tabelle 1 angegeben, und inkubieren für 3 h bei 37 ° C in einem Thermocycler. Füge 28 μl nukleasefreies Wasser und 2 μl DNase I hinzu und inkubiere weitere 15 min bei 37 ° C in einem Thermocycler.
    5. RNA-Reinigung mit Spin-Säulen.
      1. Lösen Sie das in der bereitgestellten Spinsäule enthaltene Pulver in 650 μl nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer, wobei alle Luftblasen sorgfältig entfernt werden. Das Röhrchen umhüllen und 5 bis 15 min bei Raumtemperatur hydratisieren.
      2. Entfernen Sie die blaue Kappe an der Unterseite und legen Sie die Säule in ein 2-ml-Rohr. 2 min bei 750 xg und Raumtemperatur zentrifugieren. Die Säule in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen geben und 50 μl der RNA-Lösung tropfenweise in die Mitte geben, ohne die Säulenwand zu berühren. Spin die Säule für 2 min bei 750 x g.
      3. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer (die typische Ausbeute einer Reaktion beträgt 30 - 50 μg). Prüfen Sie, ob das A260 / A280-Verhältnis a istRunde 2.0 ( dh keine Verunreinigung durch Proteine) und das A260 / A230-Verhältnis beträgt mindestens 2,0 ( dh keine Verunreinigung durch organische Lösungsmittel). Die sgRNAs bei -80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      4. Beurteilen Sie die Qualität der RNA unter Verwendung der 1% TAE-Gele, die routinemäßig für die DNA-Elektrophorese verwendet werden. Führen Sie 200-400 ng der DNA-Matrize und die entsprechende sgRNA parallel aus. Die RNA-Bande (≈ 100 bp) sollte etwas größer sein als die DNA-Bande (siehe Abbildung 3A ).

3. Spendervorlage

  1. Bestellen von kommerziell synthetisierten einzelsträngigen Oligonukleotiden (ssOligos, siehe Tabelle der Materialien ) für Punktmutationen oder für die Integration von kleinen Sequenzen bis zu 50 bp; Homologiearme sind typischerweise 60-90 bp lang.
  2. Für größere Insertionen verwenden Sie ein Spenderplasmid als Vorlage. Erzeugung eines geeigneten Plasmids unter Verwendung der klassischen Klonierungsmethode oder der de novo - Synthese aus einemKommerzielle Quelle.
    HINWEIS: Es werden mindestens 800 bp pro Homologiearm empfohlen. Die Größe des Rückgrats hat keinen Einfluss auf die Effizienz der Homologie-Direktreparatur (HDR).

4. Injektionsmischung

  1. Verdünnen Sie die Cas9-mRNA auf 50 ng / μl und die sgRNAs auf 12,5 ng / μL (insgesamt 25 ng / μL) unter Verwendung von nukleasefreiem Mikroinjektionspuffer für Gen-Knockout-Experimente. Fügen Sie die Spender-Matrize (ssOligo oder Plasmid) in einer Konzentration von 200 ng / μL für Genom-Editing-Experimente auf der Grundlage von Homologie direkte Reparatur.
    HINWEIS: Verdünnungsvolumina können mit Hilfe von Online-Tools, wie z. B. einem Resuspensionsrechner, leicht ermittelt werden.
  2. Halten Sie jedes Aliquot auf Eis während der Mikroinjektionssitzung und verwerfen Sie danach (nicht wieder einfrieren die Einspritzung Mischung).

5. Skrotal-Vasektomie

ANMERKUNG: Zwei Arten von Vasektomie werden häufig bei Mäusen durchgeführt: Bauch und Skrotal. LetztereIst weniger invasiv und wurde zuvor beschrieben 15 .

  1. Autoklav alle chirurgischen Instrumente aus rostfreiem Stahl.
  2. Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit einer Waage und betäubt die Männchen durch intraperitoneale (ip) Injektion mit injizierbarem Anästhetikum (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg).
  3. Überwachen Sie den Verlust des Zehen-Quetsch-Reflexes und sobald die Maus sediert ist, legen Sie sie auf ein Heizkissen.
  4. Desinfizieren Sie die Haut um die Hoden mit wechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums wie Chlorhexidin und 70% Ethanol.
  5. Schieben Sie die Hoden in den Skrotalsack und machen Sie einen Hautschnitt mit einem Skalpell.
  6. Visualisierung der Hoden, Cauda-Nebenhoden und Vas deferens.
  7. Greife die Vas deferens mit Pinzette, halte sie und kauterisiere auf jeder Seite der Pinzette, um 3 mm der Vas deferens zu entfernen.
  8. Führen Sie das gleiche Verfahren auf dem zweiten Testis durch.
  9. Schließen Sie die Hautinzisionen mit Wundclips und überwachen Sie dieMaus bis zur vollständigen Erholung.

6. Superovulation (Oozytenspender) und Zeitmessung (Pseudo-schwangere Frauen)

HINWEIS: Die Technik zur Erzeugung einer geeigneten Anzahl von befruchteten Oozyten und verstopfte Pflegefrauen zur Reimplantation wurde an anderer Stelle beschrieben 15 .

  1. Injizieren Sie 10 Frauen mit 5 IE des Serum Gonadotropins der schwangeren Stute (PMSG; in 100 μl) um 12 Uhr am Tag 1.
  2. Injizieren Sie die Weibchen ip mit 5 IE menschlichem Choriongonadotropin (hCG, in 100 μl) 46-48 h später (um 11 Uhr am Tag 3).
  3. Sofort beruhigen die Weibchen mit Eingeborenen über Nacht.

7. Pronukleare (zufällige Integration) und zytoplasmatische (Gene-Targeting) Injektionen

  1. Cull die superovulierten Mäuse durch zervikale Versetzung, entlasten den Bauch und greifen auf die Eierstöcke und Ovidukte, wie zuvor beschrieben 15 . Dissect die oViducts und ernten die Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) unter einem Stereomikroskop 15 . Legen Sie sie in einen Tropfen Kalium-Simplex-Optimierungsmedium, ergänzt mit Aminosäuren (KSOMaa) nach dem traditionellen Verfahren 15 .
  2. Die Oozyten werden durch Zugabe von ca. 1 & mgr; l Hyaluronidase (10 mg / ml) zum Tropfen KSOMaa-Medium unter Verwendung eines Aspirationsmundstücks zugegeben und die Schale in einen 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator für 30 s bis 1 min gegeben.
  3. Die Oozyten mit 4 frischen Tropfen KSOMaa-Medium mit dem Aspirator-Mundstück waschen und auf einen endgültigen Tropfen KSOMaa-Medium überführen, der mit Mineralöl (ca. 2 ml) überzogen ist. Legen Sie die Schale in den 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator, bis die Oozyten zur Injektion bereit sind.
  4. Pronukleare Injektion (zufällige Integration).
    1. Die Eier unter dem stereoskopischen Mikroskop visualisieren und ca. 50 Eier in die Injektionskammer bringen (a droP von M2 Medium mit Mineralöl überlagert) mit dem Aspirator Mundstück.
    2. Übertragen Sie die Injektionskammer auf das invertierte Mikroskop und injizieren Sie die befruchteten Oozyten (zwei sichtbare Vorkerne) mit einigen Picolitern der Injektionsmischung, die auf einen Vorkern abgestimmt sind (jeder der Vorkern kann gezielt werden). Manifestiere eine erfolgreiche Injektion durch Beobachtung der Schwellung des Vorkerns.
  5. Zytoplasmatische Injektion (Gen-Targeting).
    1. Übertragen Sie etwa 50 Eier zu einem Tropfen KSOMaa mit 5 μg / ml Cytochalasin B mit dem Mundstück und inkubieren für 5 min im 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator.
    2. Übertragen Sie die Eier mit dem Mundstück in die Injektionskammer.
    3. In den Zytoplasma bei sehr niedrigem Druck (50-100 hPa) wenige Pikoliter der Injektionsmischung einspritzen, wobei der Kompensationsdruck des automatisierten Mikroinjektors nach Möglichkeit möglich ist.
    4. Nach der Injektion die Oozyten wieder in einen Tropfen KSO überführenMaa (mit dem Mundstück) und halten sie im 37 ° C / 5% CO 2 -Inkubator, bis zur Reimplantation in den Eileiter der pseudo-schwangeren Frauen geladen.

8. Reimplantation

  1. Autoklav alle chirurgischen Instrumente aus rostfreiem Stahl.
  2. Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit der Waage und betäubt die Weibchen durch intraperitoneale (ip) Injektion mit injizierbarem Anästhetikum (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg).
  3. Überwachen Sie den Verlust des Zehen-Quetsch-Reflexes und sobald die Maus sediert ist, legen Sie sie auf ein Heizkissen.
  4. Clip eine große Fläche des Pelzes um die dorsale Mittellinie der weiblichen Maus.
  5. Desinfizieren Sie die exponierte Haut mit abwechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums wie Chlorhexidin und 70% Ethanol.
  6. Exponieren Sie den Fortpflanzungstrakt nach der traditionellen Methode 15 . Machen Sie einen 1 cm langen Hautschnitt parallel zur dorsalen Mittellinie, schneiden Sie den Muskel ab und packen Sie den fetten Pad wiTh eine Pinzette, dann sanft ziehen die Eierstöcke aus, bis seine beigefügten Eileiter und Uterus deutlich sichtbar sind.
  7. Fix das Fett-Pad mit einer Gefäßklemme. Visualisieren Sie den Eileiter unter dem stereoskopischen Mikroskop und verwenden Sie ein Paar Mikro-Schere machen einen Einschnitt in die Wand des Ovidukt wenige Millimeter stromaufwärts der Ampulle.
  8. Unter dem stereoskopischen Mikroskop laden 25 mikroinjizierte Eier in die Glaskapillare, die mit dem Mundstück verbunden ist (der Innendurchmesser der Kapillare sollte etwa 120 μm breit sein). Füge die Glaskapillare in den Eileiter ein und vertreibe, bis eine Luftblase in der Ampulle sichtbar ist.
  9. Entfernen Sie vorsichtig die Glaskapillare und legen Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in den Bauch. Naht den Einschnitt mit 3-0 nicht resorbierbaren chirurgischen Nähten, dann schließen mit Wundclips. Überwachen Sie die Maus genau bis zur vollständigen Wiederherstellung.

9. Genotypisierungsstrategien / Sequenzierung

HINWEIS: Das Genom isolierenDNA aus 2-mm-Schwanz- oder Ohrenbiopsien, nach relevanten Tierethikvorschriften.

  1. Schnelle genomische DNA-Extraktion (zufällige Integration).
    1. Lyse die Gewebeproben (~ 2 mm) bei 95 ° C für 1 h in 100 μl alkalischem Lyse-Reagenz (25 mM Natriumhydroxid und 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    2. 100 μl Neutralisationsreagenz (40 mM Tris-HCl, pH = 5) zugeben.
    3. 5 min bei 12.000 g und 4 ° C zentrifugieren.
  2. Hochwertige genomische DNA-Extraktion (Gen-Targeting).
    1. Fügen Sie 500 μl Schwanzpuffer (50 mM Tris, pH = 8, 100 mM EDTA, pH = 8, 100 mM NaCl, 1% SDS und 0,5 mg / ml Proteinase K, frisch zugesetzt) ​​hinzu.
    2. Inkubieren über Nacht bei 55 ° C.
    3. Mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen).
    4. Zugabe von 250 μl gesättigtem NaCl (6 M) und Mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen).
    5. Für 5-10 min bei 12.000 xg und 4 ° C drehen und den Überstand in neues Röhrchen geben. Fügen Sie 500 μl Isopropanol hinzu und mischen für 5 min durch Invertieren (nicht vortexen).
    6. Für 10 min bei 12.000 xg und Raumtemperatur drehen.
    7. Dekantieren den Überstand (das Pellet ist unsichtbar und haftet an der Tube).
    8. Mit 1 ml 70% igem Ethanol waschen.
    9. Spin für 5-10 min bei 12.000 xg und Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig, da das weiße Pellet nicht mehr klebrig ist und verloren gehen kann.
    10. Luft trocknen diese für ~ 1 h.
    11. Man gibt 400 μl TE-Puffer (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH = 8) zu.
    12. Die DNA bei 55-60 ° C für 2 h auflösen.
  3. Grundierung Design.
    1. Entwerfen Sie Primer ein Minimum von 20 bp lang mit einem Rechenwerkzeug 19 .
      HINWEIS: Für die zufällige Integration sollten die Primer mit dem Transgen hybridisieren und ein unterschiedliches Fragment von 200-800 bp erzeugen. Für die Gen-Targeting, die Primer so zu gestalten, dass sie mit der genomischen DNA hybridisieren, wodurch eine deutliche fRennen ein paar hundert Bp um die geschnittenen Seiten. Für große Insertionen können die Primer auf dem Transgen sitzen, aber die Bestätigung der gezielten Integration sollte anschließend mit Primer Walking oder einer ähnlichen Technik durchgeführt werden.
  4. PCR-Genotypisierung.
    1. Für jede genomische Modifikation, entwerfen Sie ein neues PCR-Protokoll und testen Sie es empirisch. Man betrachte die Länge des erzeugten Fragments und die Schmelztemperatur (Tm) jedes Paares von Primern.
  5. Sequenzierung.
    1. Für Gen-Targeting, senden PCR-Produkte an einen Sanger Sequenzierung Dienstleister.

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Representative Results

Im Folgenden werden die Arbeitsabläufe für die Mikroinjektion im Falle der zufälligen Integration und des CRISPR-vermittelten Gen-Targeting beschrieben (Abbildung 1 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Typischer Workflow zur Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen. Für die zufällige Integration wird das gereinigte Transgen in den Vorkern der befruchteten Oozyten injiziert, bevor die Überlebensübertragung in verstopfte Pflegefrauen übertragen wird. Die Analyse der Nachkommenschaft erfolgt durch PCR nach einer schnellen genomischen DNA-Extraktion. Für das CRISPR-Gen-Targeting werden sgRNAs unter Verwendung des hier beschriebenen Nicht-Klonierungsverfahrens synthetisiert und zwei Guides werden zusammen mit Cas9-mRNA in das Cytoplasma der befruchteten Oozyten co-injiziert. Diese Strategie wird für die anschließende PCR-basierte Analyse der Nachkommenschaft verwendet, die hoch gereinigte g erfordertEnomische DNA Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Obwohl die Mikroinjektion von Oozyten und die Reimplantation dieser injizierten Eier die beiden wichtigsten einschränkenden Schritte sind, die technische Fähigkeiten und Schulungen erfordern, ist die Qualität der Injektionsmischung von größter Bedeutung, um erfolgreich genetisch veränderte Mäuse zu erzeugen. Die Qualität der Transgenreinigung (Abbildung 2A ) und der sgRNAs-Synthese (Abbildung 3A ) sollte systematisch auf analytischen Agarosegelen untersucht werden. Mögliche Verunreinigungen der Mischung sollten auch bei der Messung der Konzentrationen mit einem Spektrophotometer überprüft werden, da die unterschiedlichen Absorptionswerte direkt vom Reinheitsgrad der Lösung abhängen (siehe Schritte 1.2.3, 2.2.3.5 und 2.2.5.3).

2B ) als auch für das Gen-Targeting (Abbildung 3B ). Die DNA-Extraktionsprotokolle sind auch abhängig von der Art der Experimente verschieden; Nachfolgende PCRs beruhen auf Primern, die entweder am Transgen bzw. an der genomischen DNA hybridisieren. Die hier vorgestellten Strategien erlauben die einfache Fehlersuche und Straffung jedes Schrittes, der für die Herstellung von genetisch veränderten Mäusen erforderlich ist.

Obwohl das quantitative Ergebnis einer Mikroinjektionssitzung in Abhängigkeit von der Erfahrung des Experimentators variiert, wird, sobald jeder Schritt des Protokolls optimiert ist, der Prozentsatz der erhaltenen transgenen Welpen typischerweise 10-25% für zufälliges Integ erreichenRation, wie in Abbildung 2B dargestellt (4 Gründer von 15 Welpen geboren = 26,6%). Diese etwas "niedrige" Effizienz steht im Gegensatz zu der zuverlässigen Fähigkeit der CRISPR-Komponenten, das Mausgenom zu bearbeiten. In der Tat ist die Anzahl der erzeugten Gründer im Allgemeinen höher, wenn sie CRISPR für das Gen-Targeting verwendet und von 25-100% reicht (siehe Abbildung 3B , 3 Gründer von 13 Welpen = 23%). Es ist nicht ungewöhnlich, eine ganze Nachkommenschaft zu erhalten, die erfolgreich homozygot ist, wenn sie mit CRISPR bearbeitet werden.

Figur 2
Abbildung 2: Qualitätskontrolle und Genotypisierungsstrategie für die erfolgreiche Produktion von transgenen Mäusen für die Überexpression. ( A ) Das Plasmid wird für 1 h mit PvuI und NotI verdaut. Vollständige Verdauung und korrekte Größen ( dh transgene = 7,338 bp, backbone = 1.440+ 896 bp) auf einem analytischen Gel (1) überprüft. Die Extraktion mehrerer Verdauungsprodukte aus dem präparativen Gel (2) erzeugt eine erhöhte Konzentration des Transgens. Eine längere Einwirkung von UV sollte vermieden werden, und die Verwendung eines blauen Lichts anstelle eines UV-Transilluminators wird empfohlen. (B) Genotypisierungsstrategie (1): Die Primer sollten auf dem Transgen sitzen und sollten so entworfen werden, dass sie ein Fragment von 200 - 800 bp erzeugen. Wenn die Genotypisierung durchgeführt wird (2), wird empfohlen, eine positive Kontrolle ( dh die Injektionsmischung, die für die Mikroinjektion verwendet wird) und eine Negativkontrolle ( dh genomische DNA von einer WT-Maus) einzuschließen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Qualitätskontrolle und Genotypisierung StraTegy für die erfolgreiche Produktion von Gen-gezielten (KO) Mäusen. ( A ) Die Qualität der durch in vitro- Transkription hergestellten sgRNAs wird durch die Durchführung der DNA-Matrize und der erzeugten RNA parallel für jede Führung bestimmt. Die Größe der RNA ist etwas größer als die DNA. Sollte die Qualität zufrieden stellend sein ( dh keine Schmierbänder), werden die Konzentrationen gemessen. ( B ) (1) Entwurf der beiden Führungen (entgegengesetzte Richtungen), die das Startcodon in Exon 1 umfassen. Die Primer werden ausgewählt, um mit der genomischen DNA außerhalb der Region zu hybridisieren, die schließlich von den beiden Führern ausgeschnitten wird. Typischerweise ermöglicht diese Strategie die direkte Identifizierung von heterozygoten (# 5 und 9) und homozygoten (# 3) KO-Gründern unter Verwendung von PCR (2). PCR-Produkte von homozygoten Tieren zeigen keine WT-Bande an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Reaktion Komponenten Volumen Hinweis Synthese der linearen DNA-Matrize
(2,5) Nuklease freies Wasser 97,2 & mgr; l 5x HF-Puffer 36 & mgr; l MgCl & sub2; 9 & mgr; l 10 mM dNTPs 9 & mgr; l 10 μM fwd Grundierung 9 & mgr; l 5'TTAATACGACTCACTATAGN 20
Gttttagagctagaaatagcaagttaaaata
Aggctagtc 3 ' 10 μM rev Primer 9 & mgr; l 5 'AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3' PrOv-Lese-Polymerase 1,8 & mgr; l IVT unter Verwendung eines T7-RNA-Synthesekits
(2.6) Nuklease freies Wasser X & mgr; l Bis zu 20 μl Gesamtvolumen auffüllen NTP-Puffer-Mix 10 & mgr; l Template DNA ≈ 300 ng T7-RNA-Polymerase 2 & mgr; l

Tabelle 1: Zusammensetzung der verschiedenen Mastermischungen, die in dieser Studie verwendet wurden. Synthese der linearen DNA-Matrize: Die T7-Promotor-Minimalsequenz (TTAATACGACTCACTATAG) steht stromaufwärts der 20-bp-Sequenz (Leitfaden, N 20, die mit dem CRISPR-Design-Tool identifiziert wurde) und eine Sequenz, die komplementär zum Expressionsvektor (gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc) ist. In vitroTranskription (IVT): Abhängig von der Konzentration der DNA-Matrize sollte das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 20 μl eingestellt werden.

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Discussion

Kritische Schritte im Protokoll

Die Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen ist technisch anspruchsvoll. Allerdings ist das hier vorgestellte Protokoll eine optimierte und vereinfachte Methode, die es ermöglicht, die Technik in Rekordzeit zu beherrschen und zu beheben. Für den erfolgreichen Abschluss der Technik sind zwei Schritte erforderlich. Zuerst kann die Synthese von linearen DNA-Matrizen (für die Synthese von sgRNAs) ohne Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) erreicht werden. Es empfiehlt sich jedoch, dem Master-Mix systematisch MgCl 2 zuzusetzen, da die partielle Hybridisierung des Vorwärts-Primers häufig in Abwesenheit von MgCl 2 verhindert wird. Darüber hinaus ist es entscheidend, dass die gezielte genomische Sequenz nicht in irgendeinem Teil der Spendervorlage vorhanden ist (im Falle einer gezielten Integration), andernfalls wird die Cas9-Nuklease schneiden, wodurch das Auftreten von HDR verhindert wird.

ÄnderungenUnd Fehlersuche

Obwohl dieses Protokoll zur Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen im Laufe der Jahre optimiert und gestrafft wurde, gibt es einige Überlegungen in Bezug auf die Ausbeute an qualitativ hochwertigen Oozyten für die Mikroinjektion und die Verstopfungsrate von Pflegefrauen. Die Wahl der Hintergrundbelastung ist in Bezug auf die Anzahl der lebenden Welpen, die aus einer Mikroinjektionssitzung resultieren, kritisch. C57BL / 6 ist der am häufigsten verwendete Hintergrund für Mausmodelle von Krankheiten. Allerdings ist es auch einer der weniger effizienten Hintergründe in Bezug auf die Resistenz gegen Mikroinjektion 20 . Darüber hinaus ist das Alter des Weibchens auch entscheidend, um eine große Anzahl von Oozyten zu ergeben; Es wird empfohlen, Mäuse 5-8 Wochen alt zu vermeiden, unabhängig vom Hintergrund, da dies die am wenigsten günstige Periode der Reaktion auf hormonelle Stimulation ist 21 . In unserer Erfahrung liefern 3 bis 4 Wochen alte C57BL / 6 Mäuse zuverlässig 20-30 Eier pro Weibchen. Es ist wichtigBeachten Sie, dass eine neue Technik (als Ultra-Superovulation bezeichnet) bis zu 100 Eier pro Weibchen produziert hat und vor kurzem verwendet wurde, um Oozyten für die Mikroinjektion zu erzeugen 22 . Allerdings wird die Verwendung von Ultra-Superovulation für Mikroinjektion in der Regel durch die Notwendigkeit, künstlich zu befruchten ( In-vitro- Fertilisation) eine so große Anzahl von Eiern behindert.

Um verstopfte Pflegefamilien zur Reimplantation zu erhalten, werden weibliche Mäuse mit vasektomierten Männchen verpaart (der Hintergrund dieser Mäuse ist nicht kritisch). Um die Anzahl der eingesteckten Empfänger zu erhöhen, kann eine sorgfältige Untersuchung des Stadiums des Östrus und der Auswahl geeigneter Frauen durchgeführt werden 23 . Die Synchronisation der Weibchenzyklen kann auch dadurch induziert werden, dass die Weibchen zwei Tage vor der Paarung den Vasektomierten ausgesetzt werden (der sogenannte "Whitten-Effekt").

Einschränkungen der Technik

Sehr kleine genomische Modifikationen, wie z. B. Punktmutationen, sind relativ leicht zu erzeugen, aber sie sind schwer zu identifizieren. Wenn die Genotypisierung durchgeführt wird, werden die PCR-Produkte direkt durch Sanger-Sequenzierung sequenziert. Allerdings erzeugt die direkte Mikroinjektion von CRISPR-Komponenten in Maus-Oozyten oft Mosaik-Tiere, weil die Cas9 für einige Zeit aktiv bleibt und verschiedene genomische Modifikationen nach der ersten Teilung der Oozyte auftreten können. Diese verwirrende Wirkung kompliziert die Identifizierung von diskreten Mutationen unter verschiedenen Allelen, und die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann bei herausfordernden Auslesungen helfen. Sensitive Techniken wie Tetra-PrimerARMS-PCR, 25 kann auch bei der Genotypisierung der Kolonie nach der Identifizierung der Gründer durch Sequenzierung helfen.

Umgekehrt bleibt das Einsetzen großer DNA-Stücke gezielt anspruchsvoll. Je größer die exogene DNA, desto geringer die Effizienz von HDR. In der Folge werden derzeit neue Strategien wie die Verwendung von langen ssOligos-Spendern (anstelle von Plasmiden) 26 oder HDR-unabhängiger Zielintegration 27 entwickelt.

Bedeutung des Protokolls

Dieses Protokoll stellt erhebliche Fortschritte dar, da die vier Hauptschritte ( dh die Vorbereitung der Transgen- oder CRISPR-Komponenten, Mikroinjektion, Reimplantation und Genotypisierung) in unserem Labor optimiert, getestet und validiert wurden.

Die zufällige Integration von Transgenen wird aus zwei Hauptgründen weit verbreitet für Überexpressionsstudien verwendet. Erstens, um zu vermeidenId die potenzielle "Positionseffekt", die gezielte Integration eines Transgens mit CRISPR in "sicheren Hafen" Loci, wie die Rosa26 28 und die Col1a 29 loci, bleibt notorisch anspruchsvoll, da die Effizienz von HDR niedrig ist. Strategien zur Überwindung dieses Problems sind 26 , 27 , aber zufällige Integration hat sich bislang als effizienter erwiesen. Außerdem ist die Erzeugung von mehreren transgenen Linien, die das gleiche Transgen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus überexprimieren, von Studien mit Behandlungsstrategien von Interesse, um einen Phänotyp umzukehren 30 . Plasmid-basierte Transgene werden durch Mittel der Klonierung unter Verwendung von Ad-hoc- Restriktionsenzymen erzeugt, um wesentliche Fragmente für die Expression eines Proteins von Interesse zu bilden. Im Allgemeinen besteht ein Transgen aus mindestens drei Elementen: ein geeigneter Promotor (Enhancer-Regionen werden manchmal hinzugefügt); Die KodierungSequenz (cDNA), mit oder ohne intronischen Regionen; Und einen PolyA-Schwanz zur Stabilisierung der mRNA-Expression 31 .

Sobald es zusammengebaut ist, wird das Transgen in ein Plasmid eingefügt, das bakterielle Replikationselemente enthält und in Kultur nach der Transformation expandiert (typischerweise auf Hitzeschock basiert). Die Reinigungsmethode der Transgene für die Mikroinjektion ist kritisch. Diese Arbeit beschreibt die Verwendung von DNA-Flecken der neuen Generation (low-toxicity) für die genauere Visualisierung des interessierenden Fragments auf dem Gel (verglichen mit herkömmlichem Kristallviolett) und einer geringen mutagenen Exposition (im Vergleich zu Ethidiumbromid).

Das hier beschriebene Nicht-Klonierungsverfahren für das Gen-Targeting ist sehr schnell und ermöglicht die Synthese von mehreren sgRNAs in nur 5-6 h. Es sind nur vier Schritte erforderlich: die Identifizierung der Zielsequenz, die Synthese einer linearen DNA-Matrize, die einen T7-Promotor und die gewählte Zielsequenz enthält, die Synthese oF die sgRNA durch in vitro Transkription (IVT) und die Reinigung der sgRNA unter Verwendung von Spinspalten.

Im frühen Alter der CRISPR-Maus-Genom-Bearbeitung wurde der potentielle Off-Target-Effekt systematisch beurteilt, obwohl er in den Maus-Embryonen 32 sehr eingeschränkt wurde und leicht durch ein Zuchtschema, bei dem ausgewählte Mäuse nur tragen, verdünnt werden kann Die gewünschte genomische Modifikation. Die On-Target-Aktivität wurde auch in vitro systematisch vorab beurteilt, wobei verschiedene Guides verwendet wurden und die aktiveren (n) 12 ausgewählt wurden. Diese Praxis ist jetzt aus mehreren Gründen weniger häufig. Zuerst wird die On-Target-Aktivität unter Verwendung von Transfektion von immortalisierten Mauszelllinien (typischerweise N2a oder NIH3T3) mit CRISPR-kodierenden Plasmiden bestimmt. Dies ist eine andere Methode als die Injektion von CRISPR-RNA-Komponenten in Maus-Oozyten. Daher sind die in vitro gefundenen Ergebnisse nicht immer gleichberechtigtZu oozyten Darüber hinaus zeigten High-Throughput-Experimente, dass die meisten Guides aktiv sind 33 . Folglich wird die On-Target-Aktivität nicht beurteilt, und bisher gab es keinen Hinweis auf eine Führung, die keine Aktivität in Maus-Oozyten zeigt. Zusammen mit der Nicht-Klonierungsmethode zur Synthese von sgRNAs, die hier präsentiert wird, vereinfacht und optimiert dies den Workflow erheblich und es können mehrere aktive Guides nahtlos an einem Tag synthetisiert werden.

CRISPR gilt als "störende Technologie", was eine Innovation ist, die die Art und Weise verändert, wie Techniken durchgeführt werden. Als Mikroinjektion festgestellt wurde, haben Brinster et al. Zeigte, dass die zytoplasmatische Transgenese, obwohl erreichbar, meist ineffizient blieb 7 . Folglich blieb die vorkernige Mikroinjektion die einzige übliche Praxis für fast 30 Jahre, bis die erste Demonstration eines erfolgreichen CRISPR-Gens, das auf Mäuse zielt. Diese Studie zeigte, dass zytoplasmatisches Mikroinjekt Ion könnte ein ähnliches oder überlegenes Ergebnis im Vergleich zur nuklearen Abgabe 12 erzeugen. Offensichtlich ist es offensichtlich, dass CRISPR-Komponenten typischerweise aus RNA bestehen, ist es offensichtlich, dass das Zytoplasma gezielt ist. Doch auch wenn es in das Zytoplasma injiziert wird, können Spendervorlagen auch erfolgreich HDR induzieren. Eine hohe zytoplasmatische Konzentration von Templates ermöglicht ihre Diffusion in den Zellkern. Darüber hinaus ist die Verwendung der piezogetriebenen zytoplasmatischen Mikroinjektion 16 keine Voraussetzung. Eine kurze Inkubation der Oozyten mit einem Zytoskelett-Inhibitor wie Cytochalasin B erhöht das Überleben der Oozyten 34 , 35 , wodurch es ausreicht, zytoplasmatische Injektionen ohne ein Piezo-Aufprall-Antriebssystem durchzuführen. Ebenso verringert die Verwendung eines verbesserten Kulturmediums, wie KSOMaa, die Blockade im Zweizellenstadium und verbessert die Entwicklungskapazitäten der Embryonen im Vergleich zu M16-MediumXref "> 36

Einzellige oder zweizellige (wenn kultivierte über Nacht) Embryonen können auf den Eileiter übertragen werden. Die konventionelle Prozedur ist ziemlich invasiv, da es erfordert, die Bursa zu reißen, die den Eierstock schützt. Es ist auch technisch anspruchsvoll, denn die Glaskapillare muss in das Infundibulum eingefügt werden 15 . Die hier vorgestellte Methode ist viel leichter zu erlernen, verursacht keine Blutungen und bewahrt die Integrität des Eierstocks. Es basiert auf der Arbeit, die an der Kumamoto Universität entwickelt wurde 37 .

Genotypisierungsstrategien und Sequenztechniken sind entscheidend für die Identifizierung potentieller Gründer. Für die zufällige Integration basiert die Extraktion von genomischer DNA auf einem einfachen Verfahren, das von Truett et al. 38 Ein solches schnelles Extraktionsverfahren reicht aus, um potentielle Gründer zu identifizieren, da die Primer so konstruiert sind, dass sie mit dem Transgen hybridisieren (oft integrierenAls Mehrfachkopien ausgegeben). Umgekehrt erfordert das Gen-Targeting hochgereinigte genomische DNA, da das PCR-Produkt die modifizierte genomische Region umfasst.

Für Gen-Knockout, die traditionelle Methode der Injektion einer einzigen sgRNA erzeugt kleine Deletionen (Indels) oder Insertionen, schließlich klopfen das Gen von Interesse 12 . Diese kleinen Modifikationen sind schwer zu identifizieren und erfordern oft zeitaufwändiges, ligaseunabhängiges Klonen und Sequenzieren, um die Natur dieser Mutationen zu bestätigen.

In diesem Protokoll nutzten wir das CRISPR-Multiplexing, um die systematische Co-Injektion von zwei sgRNAs zu entwickeln, die das Startcodon eines Gens von Interesse umfassen. Dies erhöht nicht nur die Wahrscheinlichkeit eines Gen-Knockouts, sondern auch die Exzision eines Stückes genomischer DNA mit einer vordefinierten Größe (100-300 bp), was die einfache Identifizierung der Gründer durch einfache PCR ermöglicht. Anmerkung, Welpen, die nicht die erwartete genomische e tragenXcision konnte noch für kleine Frameshift-Mutationen analysiert werden, wenn nur eine sgRNA aktiv war. Ebenso sollte im Fall der Genbearbeitung die systematische Co-Injektion von zwei überlappenden sgRNAs in entgegengesetzte Richtungen die Effizienz von HDR erhöhen, da die Zellreparaturmechanismen vorzugsweise einen der beiden Stränge 39 verwenden.

Zukünftige Anwendungen

Das vorliegende Protokoll nutzt die neuesten Entwicklungen in der Maus Embryologie und Gen Targeting 40 zu vereinfachen und zu rationalisieren den Prozess der Generierung von verschiedenen anspruchsvolle Maus Modelle von menschlichen Bedingungen. Diese Modelle spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung unseres Verständnisses von Pathomechanismen, die letztlich bei der Entwicklung therapeutischer Strategien hilft 2 . Die Optimierung und Straffung der Reagenzien, die für das Gen-Targeting oder die zufällige Integration erforderlich sind, sind weitgehend und problemlos anwendbarLe zu irgendwelchen anderen Säugetierarten, wie Ratten, Kaninchen und sogar zu großen Tieren wie Vieh.

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Disclosures

Die Autoren bieten akademische Transgenese Dienstleistungen in Mäusen über die University of New South Wales Mark Wainwright Analytical Center.

Acknowledgments

Die Autoren danken den Mitarbeitern der Tierfabrik (BRC) für ihre laufende Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council und dem Australian Research Council finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette 0.1-2.5 μL Eppendorf 4920000016
Micropipette 2 - 20 μL Eppendorf 4920000040
Micropipette 20 - 200 μL Eppendorf 4920000067
Micropipette 100 - 1,000 μL Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1 kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x - Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

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References

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Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten
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Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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