Summary
マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。
Abstract
遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している 。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。一緒に、プロトコルのステップは、世代の生成を可能にする免疫学、神経科学、癌、生理学、発達およびその他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。
Introduction
脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。
今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった（2002）私（2003）。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル（受精から離乳までの6週間）、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色（交差戦略に必要）などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました3 。
遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の4年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした4 。しかし、研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。
このような制限の1つは、Gordon et al。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています7 。マイクロインジェクションは、導入遺伝子の組み込み部位（最終的に各創始マウスの特異的発現レベルをもたらす）の制御を可能にしないが、前核ミクロインジェクションの主な利点は、コンカテマー（ すなわち、トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。
Mario Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました8 。しかし、ES細胞の培養、キメラの程度の変化、およびプロセスの長さ（ すなわち、マウスを得るために最小12〜18ヶ月）を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。
最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、および規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列（CRISPR / Cas9）のような工学エンドヌクレアーゼのような新技術の進歩が、マイクで遺伝子ターゲティングのプロセスを加速するe 9,10 。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。
ゲノム編集11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた（「多重化"）。 CRISPRは、マウス12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている13,14 。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。
トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。この技術は我々 15およびその他16によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。
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Protocol
すべての手続きは、ニューサウスウェールズ州動物衛生倫理委員会の承認を受けています。
導入遺伝子の調製（ランダム・インテグレーション）
- 分析用アガロースゲル電気泳動。
- 製造業者の推奨に従ってサーモサイクラー中で適切な酵素（1時間インキュベーション）または高速消化酵素（15〜30分間インキュベーション）を用いて導入遺伝子を消化するためにプラスミドを消化する（ 図2Aおよびその凡例参照）。
- 0.5〜1.0μg/ mLエチジウムブロマイド（EtBr）で染色した1％トリス - アセテート - エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）（TEA）アガロースゲルを流します。
注記：EtBrを使用するときは注意してください。それは強力な変異原である。適切な個人保護具を使用してください（物質安全性データシートを参照）。 - 1kbの分子量マーカーをロードする。
- 線形化された断片（ すなわち導入遺伝子および骨格）をロードする。 電気泳動を100Vで45分間行う。
- 消化が完了したことを確認し、導入遺伝子（ すなわち、 7,338bp; 図2A参照）の正しいサイズを確認するために、紫外線（UV）トランスイルミネーター上でゲルを視覚化する。
- 分取アガロースゲル電気泳動。
- 低毒性ゲル染色で染色した1％TAEアガロースゲルをキャスティングする。線状化したトランスジーンを分子量マーカーなしで8つのアリコート（各1μg）にロードし、電気泳動を100Vで45分間行う。直線化された導入遺伝子に対応する8つのバンド全てを切除するためにメスを使用する。
- ゲル抽出キットを使用して、製造元の推奨事項（ 表の表を参照 ）に従ってDNAを抽出する。
- ゲル断片を1.5 mLチューブで50℃で少なくとも15分間溶解する。イソプロパノールで沈殿させた後、結合緩衝液を添加する。
- D全体を結合するすべてを1つのカラムにピペッティングすることにより、ヌクレアーゼを含まないマイクロインジェクション緩衝液（8mM Tris-HClおよび0.15mM EDTA）に溶出する。 0.22μmの微量遠心分離フィルターで濾過し、12,000 x gで60秒間遠心分離します。
- 分光光度計を使用してDNAの濃度と品質を測定する。 A260 / A280比が約1.8（ すなわち、タンパク質の混入なし）で、A260 / A230比が2.0以上（ すなわち、有機溶媒による汚染なし）であることを確認してください。ヌクレアーゼフリーマイクロインジェクションバッファー（20〜50μL）で3 ng /μLまで希釈し、-20°Cで凍結します。
CRISPR成分の合成（遺伝子ターゲティング）
- Cas9 mRNA。
- ヌクレアーゼフリーマイクロインジェクション緩衝液中のCas9 mRNA（市販品から入手、 表の表を参照 ）を1μg/μLの濃度に希釈する。
- 2μL分のアリコート -80℃で保存する。
- 単一ガイドRNA（SgRNA）。
- 潜在的なオフターゲット活動を最小限に抑える計算設計ツールを使用して、目的の2標的ゲノム配列（ガイド）を同定する。
- 遺伝子ノックアウトのために、反対方向に数百塩基対（bp）離れて位置する2つのガイドを系統的に選択し、目的の遺伝子の開始コドンを含む。相同性直接修復のために、2つの重複するガイドを（可能な場合はいつでも）反対方向に選択する。
注：一例として、以下のガイドが最近、 TPM4.2遺伝子の最初のエキソンを破壊するために正常に同時注入されました：
ガイド1：5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
ガイド2：5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
- 遺伝子ノックアウトのために、反対方向に数百塩基対（bp）離れて位置する2つのガイドを系統的に選択し、目的の遺伝子の開始コドンを含む。相同性直接修復のために、2つの重複するガイドを（可能な場合はいつでも）反対方向に選択する。
- 表1に記載されているプライマーセットを注文する。
- 線状DNA鋳型を合成する。
- px330を希釈するヌクレアーゼを含まない水中で10 ng /μLまでのプラスミドを含む。
- 表1に示すように、マスターミックスを準備します。ポリメラーゼを最後に加え、マスターミックスを氷上に保ちます。
- これを8本のPCRチューブ（19μL/チューブ）に混合し、分割する。チューブあたり1μLのpx330を添加し、以下の条件下でPCRを行う：98℃で1分間; 98℃10秒間、64℃30秒間、および72℃15秒間の40サイクル; 72℃で5分間の最終伸長。 4℃で保持する。
- PCR精製キット（ 表の表を参照 ）、マニホールド、および真空源（より迅速な処理のため）を使用してPCR産物を精製する。最大真空強度（ すなわち 8 mbar）をかけます。
- 1容量のPCRサンプルに5倍量（100μL）の結合バッファーを添加し、混合する。
- 遠心分離のために（付属の）2 mLのコレクションチューブに（付属の）シリカメンブレンスピンカラムを配置するか、または真空プロセス用のマニホールドing。 DNAを結合するには、カラムに8個のサンプルをすべて連続して適用し、各ロードに対して12,000 xgで60秒間真空または遠心分離します。
- 洗浄するために、洗浄緩衝液（緩衝液PE）0.75mLをカラムに加え、12,000×gで60秒間真空または遠心分離する。カラムを12,000 xgで60秒間遠心分離して残留エタノールを除去する。
- カラムを清潔な1.5mLマイクロ遠心チューブに入れます。 DNAを溶出するには、メンブレンの中央に30μLのヌクレアーゼフリー水を加え、カラムを1分間放置し、12,000gで60秒間遠心する。
- 分光光度計を用いて濃度を測定する。典型的には、濃度は100ng /μL以上でなければならない。 A260 / A280比が約1.8（ すなわち、タンパク質の混入なし）で、A260 / A230比が2.0以上（ すなわち、有機溶媒による汚染なし）であることを確認してください。
- T7 RNA合成キットを用いたインビトロ転写。
- 準備する表1に示すようにマスターミックスを添加し、サーモサイクラーで37℃で3時間インキュベートする。 28μLのヌクレアーゼフリー水と2μLのDNase Iを添加し、サーモサイクラーで37℃でさらに15分間インキュベートする。
- スピンカラムを用いたRNA精製。
- 提供されたスピンカラムに含まれている粉末を、ヌクレアーゼフリーのマイクロインジェクションバッファー650μLに溶解し、すべての気泡を慎重に除去する。チューブをキャップし、室温で5〜15分間水和する。
- 下部の青いキャップを外し、カラムを2 mLのチューブに入れます。 750×gおよび室温で2分間遠心分離する。新しい1.5 mLチューブにカラムを置き、カラム壁に触れることなく50μLのRNA溶液を中央に滴下してください。カラムを750 x gで2分間回転させます。
- 分光光度計を使用してRNA濃度を測定します（1回の反応の典型的な収量は30〜50μgです）。 A260 / A280の比率がaであることを確認してくださいラウンド2.0（ すなわち、タンパク質による汚染なし）およびA260 / A230比が少なくとも2.0（ すなわち、有機溶媒による汚染なし）である。使用まで-80℃でsgRNAを保存する。
- DNA電気泳動に日常的に使用される1％TAEゲルを使用してRNAの品質を評価する。 200〜400 ngのDNAテンプレートと対応するsgRNAを並行して実行します。 RNAバンド（約100bp）は、DNAバンドよりもわずかに大きいはずです（ 図3A参照）。
- 潜在的なオフターゲット活動を最小限に抑える計算設計ツールを使用して、目的の2標的ゲノム配列（ガイド）を同定する。
ドナーテンプレート
- 点突然変異のために、または50bpまでの小さな配列の組込みのために、商業的に合成された一本鎖オリゴヌクレオチド（ssOligos、 表の表を参照 ）を注文する。相同性アームは、典型的には60〜90bpの長さである。
- より大きな挿入のために、テンプレートとしてドナープラスミドを使用する。典型的なクローニング法またはデノボ合成のいずれかを用いて、適切なプラスミドを生成する。商業ソース。
注：相同性アーム当たり最低800 bpが推奨されます。骨格のサイズは相同性直接修復（HDR）の効率に影響を及ぼさない。
注射混合物
- 遺伝子ノックアウト実験のためのヌクレアーゼフリーマイクロインジェクション緩衝液を使用してCas9 mRNAを50ng /μLに希釈し、sgRNAを12.5ng /μL（合計25ng /μL）に希釈する。相同性直接修復に基づくゲノム編集実験のために、ドナーテンプレート（ssOligoまたはプラスミド）を200ng /μLの濃度で加える。
注：希釈液量は、再懸濁計算機18のようなオンラインツールを使用して容易に決定することができる。 - マイクロインジェクションセッション中は各アリコートを氷上に保ち、その後は廃棄します（注入ミックスを再フリーズしないでください）。
5.陰嚢精管切除術
注：マウスでは、腹部と陰嚢の2つのタイプの凝固術が一般的に行われます。後者侵襲性が低く、以前に記載されている15 。
- すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブする。
- 体重計を使用してマウスの体重を決定し、注射可能な麻酔薬（ケタミン100mg / kg、キシラジン10mg / kg）を腹腔内（腹腔内）注射して雄を麻酔する。
- つま先のピンチ反射の喪失を監視し、マウスが鎮静されたら、それを加熱パッドの上に置きます。
- クロルヘキシジンや70％エタノールなどの局所消毒剤を交互に入れて睾丸周囲の皮膚を消毒する。
- 睾丸を陰嚢に押し込み、メスで皮膚の切開を行います。
- 精巣、尾部精巣上体、および精管を視覚化する。
- vas deferensを鉗子でつかみ、それを保持し、鉗子の両側を焼灼して、3mmの血管を除去する。
- 2番目の精巣でも同じ手順を実行します。
- 皮膚切開部を創傷クリップで閉め、十分に回復するまでマウスを近づけてください。
6.過剰排卵（卵母細胞ドナー）および時間交配（偽妊娠雌）
注：適切な数の受精卵母細胞を作製し、再移植のために雌を栓をした技術は、他の場所で説明されている15 。
- 1日目の午後12時頃に、妊娠牝馬の血清ゴナドトロピン（PMSG;100μL中）5IUを雌10匹に腹腔内注射する。
- 46〜48時間後（3日目の午前11時頃）に、5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG;100μL中）を雌に腹腔内注射する。
- 一晩飼育された雄と一晩直ちに交尾させる。
7.前核（ランダム - インテグレーション）および細胞質（遺伝子ターゲティング）注射
- 頸部脱臼により過剰排卵したマウスを摘出し、腹部を露出させ、卵巣および卵管にアクセスする。 oを解剖する立体顕微鏡の下で卵丘 - 卵母細胞 - 複合体（COC）を採取し収穫する15 。伝統的な方法15に従って、アミノ酸（KSOMaa）を補充した一滴のカリウム一重最適化培地にそれらを入れる。
- 約1μLのヒアルロニダーゼ（10mg / mL）をアスピレーターマウスピースを用いてKSOMaa培地の液滴に添加し、皿を37℃/ 5％CO 2インキュベーターに30秒〜1分間置いて卵母細胞を精製する。
- アスピレーターマウスピースを使用してKSOMaa培地4新滴で卵母細胞を洗浄し、鉱油（約2mL）で覆われたKSOMaa培地の最終液滴に移す。卵母細胞が注射の準備ができるまで37℃/ 5％CO 2インキュベーターに皿を置きます。
- 前核注入（ランダム統合）。
- 立体顕微鏡下で卵を視覚化し、約50個の卵を注入チャンバに移す（drop培地（ミネラルオイルを重層したM2培地）に吸引した。
- インジェクションチャンバーを倒立顕微鏡に移し、受精卵の数ピコリットル（前核を標的とすることができます）を注入して、受精卵母細胞（2つの目に見える前核）を注入します。前核の腫脹を観察することによって、成功した注射を視覚化する。
- 細胞質注入（遺伝子ターゲティング）。
- マウスピースを使用して5μg/ mLのサイトカラシンBを含有するKSOMaaの液滴に約50の卵を移し、37℃/ 5％CO 2インキュベーターで5分間インキュベートする。
- マウスピースを使用して卵を注射室に移す。
- 可能であれば、自動マイクロインジェクタの補償圧力を使用して、非常に低圧（50〜100hPa）で細胞質に注射混合物の少数のピコリットルを注入する。
- 注射後、卵母細胞を一滴のKSOMaa（マウスピースを使用）を37℃/ 5％CO 2インキュベーターに入れ、妊娠している雌の卵管に再移植するまで負荷する。
8.再移植
- すべてのステンレス製手術器具をオートクレーブする。
- 体重計を使用してマウスの体重を決定し、注射麻酔薬（ケタミン100mg / kg、キシラジン10mg / kg）を腹腔内（腹腔内）注射して雌を麻酔する。
- つま先のピンチ反射の喪失を監視し、マウスが鎮静されたら、それを加熱パッドの上に置きます。
- 雌マウスの背中正中線の周りの毛皮の広い領域を切り取ります。
- クロルヘキシジンや70％エタノールなどの局所消毒剤を交互に使用して曝露した皮膚を消毒する。
- 伝統的な方法15に従って生殖管を露出させる。背中正中線に平行に1cmの長さの皮膚切開を行い、筋肉を切断して脂肪パッドを掴むその卵管と子宮がはっきりと見えるまで静かに卵巣を引き抜く。
- 脂肪クランプで血管を固定する。立体顕微鏡下で卵管を視覚化し、一対のマイクロはさみを使用して、膨大部の数ミリメートル上流の卵管の壁に切開を作る。
- 立体顕微鏡下で、マウスピースに接続されたガラスキャピラリーに25マイクロインジェクション卵をロードする（キャピラリーの内径は約120μmであるべきである）。卵管にガラス毛細管を導入し、泡の中に気泡が見えるようになるまで押し出す。
- 静かにガラスの毛細管を取り外し、生殖路を腹部に戻します。切開部を3-0の非吸収性外科縫合糸で縫合し、創傷クリップで閉じる。フル回復までマウスを注意深く監視してください。
9.ジェノタイピング戦略/シークエンシング
注：ゲノムを単離する関連する動物倫理規定に従って、2mmの尾または耳の生検からのDNA。
- 高速ゲノムDNA抽出（ランダム統合）。
- 100μLのアルカリ溶解試薬（25mMの水酸化ナトリウムおよび0.2mMのEDTA、pH = 12）中で95℃で1時間、組織サンプル（約2mm）を溶解する。
- 100μLの中和試薬（40mM Tris-HCl、pH = 5）を添加する。
- 12,000 gおよび4℃で5分間遠心分離する。
- 高品質のゲノムDNA抽出（遺伝子標的）。
- 500μLの尾部緩衝液（50mM Tris、pH = 8; 100mM EDTA、pH = 8; 100mM NaCl; 1％SDSおよび0.5mg / mLプロテイナーゼK、新たに添加）を加える。
- 55℃で一晩インキュベートする。
- 反転させて5分間混合する（ボルテックスしない）。
- 250μLの飽和NaCl（6M）を加え、反転させて5分間混合する（ボルテックスしない）。
- 12,000 xgおよび4℃で5〜10分間スピンし、上清を新しいチューブに注ぎます。 500μLのイソプロパノールを加え、反転させる（ボルテックスしない）ように5分間混合する。
- 12,000 xgで室温で10分間スピンします。
- 上清を傾瀉する（ペレットは目に見えず、チューブに付着する）。
- 1mLの70％エタノールで洗浄する。
- 12,000 xgおよび室温で5〜10分間スピンします。白いペレットはもはや粘着性でなく、失われる可能性があるので、上清を注意して除去する。
- 約1時間空気乾燥させる。
- 400μLのTE緩衝液（10mMトリスおよび1mM EDTA、pH = 8）を加える。
- DNAを55〜60℃で2時間溶解する。
- プライマー設計。
- 計算ツール19を使用して、最低20 bpのプライマーを設計します。
注：ランダム組込みでは、プライマーは導入遺伝子とハイブリダイズし、200〜800 bpの明確な断片を生成するはずです。遺伝子ターゲッティングのために、プライマーがゲノムDNAとハイブリダイズするようにプライマーを設計し、異なるf切断された場所の周りに数百BPを襲います。大きな挿入のためには、プライマーは導入遺伝子上に置くことができるが、その後、標的化された組み込みの確認は、プライマーウォーキングまたは類似の技術を用いて行われるべきである。
- 計算ツール19を使用して、最低20 bpのプライマーを設計します。
- PCR遺伝子型決定。
- 各ゲノム改変について、新しいPCRプロトコールを設計し、それを実験的に試験する。生成されたフラグメントの長さおよび各対のプライマーの融解温度（Tm）を考慮する。
- シークエンシング。
- 遺伝子ターゲッティングのために、PCR産物をSanger配列決定サービスプロバイダに送付する。
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Representative Results
以下に、ランダム組込みおよびCRISPR媒介遺伝子標的化の場合のマイクロインジェクションのワークフローを示す（ 図1 ）。
図1：遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製されたトランスジーンは、卵管がプラグインされた雌の雌に移入される前に、受精卵母細胞の前核に注入される。後代の分析は、迅速なゲノムDNA抽出の後にPCRによって行う。 CRISPR遺伝子標的化のために、ここに記載された非クローニング法を用いてsgRNAを合成し、2つのガイドを受精卵母細胞の細胞質に同時注入する（Cas9 mRNAと共に）。この戦略は、その後のPCRに基づいて子孫を分析するために使用され、高度に精製されたgエノムDNA。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
卵母細胞のマイクロインジェクションおよびこれらの注入された卵の再移植は技術的スキルとトレーニングを必要とする2つの主要な制限段階であるが、遺伝子組み換えマウスを首尾よく生成するためには注入混合物の品質が最も重要である。トランスジーン精製（ 図2A ）およびsgRNA合成（ 図3A ）の品質は、分析アガロースゲルで系統的に評価する必要があります。吸収の異なる値は、溶液の純度に直接依存するため、分光光度計で濃度を測定する場合は、ミックスの潜在的な汚染もチェックする必要があります（手順1.2.3,2.2.3.5、および2.2.5.3を参照）。
図2B ）および遺伝子ターゲティング（ 図3B ）の両方について、マイクロインジェクションセッションの典型的な読み出しを説明しています。 DNA抽出プロトコールは、実験の種類によっても異なる。その後のPCRは、導入遺伝子またはゲノムDNAのいずれかにそれぞれハイブリダイズするプライマーに依存する。ここに示した戦略は、遺伝子組み換えマウスの作製に必要な各ステップの簡単なトラブルシューティングと合理化を可能にします。
マイクロインジェクションセッションの定量結果は実験者の経験によって異なるが、プロトコールの各ステップが最適化されると、得られたトランスジェニック仔の割合は、典型的にはランダムインテグレーションのために10〜25％に達するはずである図2B （生まれた子15人のうち4人が26.6％）に示されているように、このやや「低い」効率は、マウスゲノムを編集するCRISPRコンポーネントの信頼できる能力とは対照的です。実際、遺伝子ターゲッティングのためにCRISPRを使用した場合、創始者の数は一般的に多く、25〜100％の範囲である（ 図3B参照 ; 13匹中3才= 23％）。 CRISPRを使用して編集したときに正常にホモ接合である子孫全体を得ることは珍しいことではありません。
図2：過剰発現のためのトランスジェニックマウスの成功した生産のための品質管理および遺伝子型決定戦略。 （ A ）プラスミドをPvuIおよびNotIで1時間消化する。完全な消化および正しいサイズ（ すなわち導入遺伝子= 7,338bp、バックボーン= 1,440+ 896 bp）を分析ゲル（1）でチェックする。分取ゲル（2）からのいくつかの消化産物の抽出は、導入遺伝子の濃度を増加させる。 UVへの長期間の曝露は避け、UVトランスイルミネーターの代わりに青色光を使用することを推奨します。 （B）ジェノタイピング戦略（1）：プライマーは導入遺伝子上に置かれ、200〜800bpの断片を生成するように設計されるべきである。遺伝子型決定を行う場合（2）、陽性対照（ すなわち、マイクロインジェクションに使用する注射ミックス）とネガティブコントロール（ すなわち、 WTマウスのゲノムDNA）を含めることが推奨されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：品質管理とジェノタイピングStraGene-targeted（KO）マウスの成功した生産のために（ A ） インビトロ転写によって産生されたsgRNAの品質は、DNAテンプレートと生成された RNAを各ガイドについて平行して実行することによって評価される。 RNAのサイズはDNAよりわずかに大きい。品質が満足すべきものであれば（ すなわち、スミアバンドなし）、濃度が測定される。 （ B ）（1）エキソン1の開始コドンを包含する2つのガイド（反対方向）の設計。プライマーは、2つのガイドによって最終的に切除される領域の外側のゲノムDNAとハイブリダイズするように選択される。典型的には、この戦略は、PCR（2）を用いて異型接合（＃5および＃9）およびホモ接合（＃3）KO創始者を直接同定することを可能にする。ホモ接合動物のPCR産物は、WTバンドを示さない。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
（2.5）
gttttagagctagaaatagcaagttaaaata
aggctagtc 3 '
（2.6）
表1：本研究で使用した様々なマスターミックスの組成線状DNA鋳型の合成：T7プロモーターの最小配列（TTAATACGACTCACTATAG）は、20塩基対の配列の上流にある（ガイド; CRISPR設計ツールを用いて同定されたN20）および発現ベクターに相補的な配列（gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc）である。 試験管内で転写（IVT）：DNA鋳型の濃度に依存して、ヌクレアーゼを含まない水で最終体積を20μLに調整する必要があります。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。しかし、ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。第一に、線状DNA鋳型（sgRNAの合成用）の合成は、塩化マグネシウム（MgCl 2 ）なしで達成することができる。しかし、フォワードプライマーの部分的ハイブリダイゼーションは、MgCl 2が存在しない場合にしばしば防止されるので、マスターミックスにMgCl 2を系統的に添加することが強く推奨される。さらに、ターゲティングされたゲノム配列がドナー鋳型のどの部分にも存在しないことが重要である（標的化された組み込みの場合）。そうしないと、Cas9ヌクレアーゼが切断してHDRの発生を防止する。
変更トラブルシューティング
遺伝子組み換えマウスを作製するためのこのプロトコールは、長年にわたって最適化され、合理化されてきたが、マイクロインジェクションのための良質の卵母細胞の収率および養子の目詰まり率に関するいくつかの考慮事項がある。バックグラウンド株の選択は、マイクロインジェクションセッションに起因する生存仔の数に関して重要である。 C57BL / 6は、マウスモデルの疾患の最も一般的に用いられる背景である。しかし、それはまた、マイクロインジェクション20に対する抵抗の点で、効率の低いバックグラウンドの1つです。さらに、雌の年齢はまた、多数の卵母細胞を産生するために重要である。これは、ホルモン刺激21に対する応答の最も好ましくない期間であるため、背景にかかわらず、マウスを5〜8週齢で避けることが推奨される21 。我々の経験では、3〜4週齢のC57BL / 6マウスは女性1匹当たり20〜30卵を確実に産生する。のは大事です新しい技術（超超排卵と呼ばれる）が女性1匹につき100卵まで生産し、最近はマイクロインジェクション22のための卵母細胞を生成するために使用されていることに注意してください。しかしながら、マイクロインジェクションのための超超排卵の使用は、一般に、そのような多数の卵を人為的に受精させる（ インビトロ受精）必要性によって妨げられる。
再移植に適した詰まった雌を得るために、雌マウスを精管切除した雄と交配させる（これらのマウスのバックグラウンドは重要ではない）。詰まらせた受診者の数を増やすには、発情段階と適切な女性の選択を注意深く検討することができます23 。女性の周期の同期化はまた、交配の2日前に女性を精管切除された男性に曝露することによって誘導することができる（いわゆる「Whitten効果」）。
技術の限界
点突然変異のような非常に小さなゲノム改変は、生成するのが比較的容易であるが、それらを同定することは困難である。遺伝子型決定が行われる場合、PCR産物はサンガー配列決定によって直接配列決定される。しかしながら、Cas9がかなりの時間活性を維持し、異なるゲノム改変が卵母細胞の最初の分裂後に起こり得るので、マウス卵母細胞へのCRISPR成分の直接的マイクロインジェクションは、モザイク動物を生成することが多い。この交絡作用は、様々な対立遺伝子間の離散変異の同定を複雑にし、次世代シークエンシング（NGS）は挑戦的な読み出しに役立ちます。敏感な技術、例えばテトラプライマーARMS-PCR 25は、シーケンシングによって創始者の同定後にコロニーを遺伝子型決定することにも役立つ。
逆に、標的とされた様式でDNAの大きな断片を挿入することは困難なままである。外来性DNAが大きければ大きいほど、HDRの効率は低くなる。その結果、長いssOligosドナー（プラスミドの代わりに） 26またはHDR非依存性の標的化された組み込み27のような新しい戦略が現在開発されている。
プロトコルの意義
このプロトコールは、4つの主要なステップ（ すなわち導入遺伝子またはCRISPR成分の調製、マイクロインジェクション、再移植および遺伝子タイピング）が我々の研究室で最適化され、試験され、検証されているため、
トランスジーンのランダムな組込みは、2つの主な理由で過剰発現研究に広く使用されている。まず、avoにその潜在的な「ポジション効果」は、HDRの効率が低いため、Rosa26 28およびCol1a 29遺伝子座などの「安全な港」の遺伝子座におけるCRISPRを用いた導入遺伝子の標的統合は依然として挑戦的である。この問題を克服する戦略は今後の予定である26,27であるが 、これまでランダムな統合がより効率的であることが証明されている。さらに、異なるレベルの発現を有する同じ導入遺伝子を過剰発現する複数のトランスジェニック系統の生成は、表現型30を逆転させる治療戦略を含む研究において重要である。目的とするタンパク質の発現のために必須の断片を組み立てるために、 アドホックな制限酵素を用いて、クローニングの手段によってプラスミドに基づく導入遺伝子を生成する。一般に、導入遺伝子は、少なくとも3つの要素から作製される：適切なプロモーター（エンハンサー領域が時々加えられる）;コーディングイントロン領域を伴うかまたは伴わない配列（cDNA）; mRNA発現を安定化させるためのPolyAテイル31 。
一旦組み立てられると、トランスジーンは細菌複製エレメントを含むプラスミドに挿入され、形質転換後に培養物中で増殖する（典型的には熱ショックに基づく）。マイクロインジェクションのためのトランスジーンの精製方法は重要である。この研究は、（従来のクリスタルバイオレットと比較して）ゲル上の関心フラグメントのより正確な視覚化および低い変異原性暴露（臭化エチジウムと比較して）のための新世代（低毒性）DNA染色の使用を記載する。
本明細書に記載される遺伝子標的化のための非クローニング法は非常に速く、わずか5〜6時間でいくつかのsgRNAの合成を可能にする。ターゲット配列の同定、T7プロモーターおよび選択された標的配列を含む線状DNA鋳型の合成、インビトロ転写（IVT）によるsgRNA、およびスピンカラムを用いたsgRNAの精製が含まれる。
CRISPRマウスゲノム編集の初期段階では、マウス胚では非常に限られていることが示されていたが、選択されたマウスが唯一の育種スキームの手段によって容易に希釈され得るが、潜在的なオフターゲット効果が系統的に評価された所望のゲノム改変。オンターゲットの活動は、 インビトロで系統的に事前に評価され 、異なるガイドを使用し、より活性なものを選択した12 。いくつかの理由から、このプラクティスはあまり一般的ではありません。最初に、CRISPRをコードするプラスミドで不死化マウス細胞株（典型的にはN2aまたはNIH3T3）のトランスフェクションを使用して、標的とする活性を評価する。これは、マウス卵母細胞へのCRISPR RNA成分の注入とは異なる方法である。したがって、 インビトロで見出された結果は、必ずしも均等に翻訳されるわけではない卵母細胞にさらに、ハイスループット実験は、ほとんどのガイドが活性であることを示した33 。その結果、標的上の活性は評価されず、これまでマウス卵母細胞において活性を示さないガイドの証拠はなかった。ここに示したsgRNAを合成する非クローニング法と合わせて、ワークフローを大幅に簡素化し合理化し、複数のアクティブなガイドを1日でシームレスに合成することができます。
CRISPRは、技術が実行される方法を変えるイノベーションである「破壊的な技術」と考えられています。マイクロインジェクションが確立されたとき、Brinster et al。達成可能ではあるが、細胞質の遺伝子導入はほとんど非効率的であることを示した7 。結果的に、前核マイクロインジェクションは、マウスで標的とするCRISPR遺伝子の成功の最初の実証まで、ほぼ30年間、唯一の一般的なプラクティスであった。この研究は、細胞質マイクロインジェクション前核の送達と比較して同様の、または優れた結果を生み出すことができる12 。明らかに、CRISPR成分は典型的にRNAで作られているので、細胞質が標的にされていることは明らかである。しかし、細胞質に注入された場合でも、ドナーテンプレートはHDRを首尾よく誘導することができる。テンプレートの高い細胞質濃度は、それらの核への拡散を可能にする。さらに、ピエゾ駆動細胞質マイクロインジェクション16の使用は要件ではない。サイトカイン阻害剤（例えば、サイトカラシンB）との卵母細胞の短いインキュベーションは、卵母細胞34,35の生存を増加させ、ピエゾインパクト駆動システムなしで細胞質注入を行うのに十分である。同様に、KSOMaaのような改良された培養培地の使用は、2細胞期における閉塞を減少させ、M16培地と比較して胚の発生能力を改善するxref "> 36。
1細胞または2細胞（一晩培養した場合）の胚を卵管に移すことができる。従来の処置は、卵巣を保護する嚢を引き裂く必要があるので、非常に侵襲的である。また、ガラス毛細管を腔内に挿入する必要があるため、技術的にも挑戦的である15 。ここに示した方法は、習得がはるかに容易であり、潜在的な出血を誘発せず、卵巣の完全性を保持する。熊本大学で開発された研究に基づいています37 。
潜在的な創始者を特定するためには、遺伝子タイピング戦略と配列決定技術が不可欠です。ランダム組込みの場合、ゲノムDNAの抽出は、Truett et al。 38 。このような迅速な抽出方法は、プライマーが導入遺伝子とハイブリダイズするように設計されているため、潜在的な創始者を同定するのに十分である（しばしば、複数のコピーとしてated）。逆に、遺伝子標的化は、PCR産物が改変されたゲノム領域を包含するので、高度に精製されたゲノムDNAを必要とする。
遺伝子ノックアウトのために、単一のsgRNAを注入する伝統的な方法は、小さな欠失（indels）または挿入を生成し、最終的に目的の遺伝子をノックアウトする。これらの小さな改変は同定が困難であり、これらの突然変異の性質を確認するために時間がかかるリガーゼ非依存性クローニングおよび配列決定をしばしば必要とする。
このプロトコールでは、目的の遺伝子の開始コドンを含む2つのsgRNAの系統的同時注入を開発するために、CRISPR多重化を利用した。これは、遺伝子ノックアウトの可能性を高めるばかりでなく、所定のサイズ（100〜300bp）のゲノムDNAの塊を切除して、簡単なPCRによって創始者を容易に同定することを可能にする。注目すべきは、期待されるゲノムeを保有していない子犬1つのsgRNAのみが活性であると証明されたとき、小さなフレームシフト突然変異についてxcisionを分析することができる。同様に、遺伝子編集の場合、細胞修復機構が優先的に2つの鎖39のうちの1つを使用するので、反対方向の2つの重複するsgRNAの体系的同時注入はHDRの効率を増加させるはずである。
将来のアプリケーション
現在のプロトコールは、ヒト発生条件の様々な洗練されたマウスモデルを生成するプロセスを単純化し合理化するために、マウス発生学および遺伝子標的化40の最新の進歩を利用する。これらのモデルは、最終的に治療戦略の開発を支援する、病理機構の理解を深めるのに役立ちます。遺伝子標的化またはランダム組込みに必要とされる試薬の最適化および合理化は、広くかつ容易に適用可能であるラット、ウサギのような他の哺乳動物種、さらにはウシのような大きな動物にさえも投与することができる。
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Disclosures
著者らは、ニューサウスウェールズ大学のMark Wainwright Analytical Centerを介して、マウスで学術的トランスジェニックサービスを提供しています。
Acknowledgments
著者らは、継続的な支援のために動物施設（BRC）のスタッフに感謝しています。この研究は、国家保健医療研究評議会とオーストラリア研究評議会によって資金提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette 0.1-2.5 μL | Eppendorf | 4920000016 | |
| Micropipette 2 - 20 μL | Eppendorf | 4920000040 | |
| Micropipette 20 - 200 μL | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100 - 1,000 μL | Eppendorf | 4920000083 | |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| Molecular weight marker | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - Dilute to 1x |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | |
| PCR purification kit (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Vacuum system (Manifold) | Promega | A7231 | |
| Nuclease-free microinjection buffer | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC microcentrifuge filter | Millipore | UFC30GV00 | |
| Cas9 mRNA | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR expressing plasmid (px330) | Addgene | 42230 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| RNA purification spin columns (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Donor plasmid | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa embryo culture medium | Zenith Biotech | ZEKS-100 | |
| Mineral oil | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Mouthpiece | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Glass microcapillaries | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Proteinase K | Applichem | A3830.0100 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Vessel clamp | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Wound clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Clips applier | Fine Science Tools | 12018-12 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 incubator | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Electrophoresis set up | BioRad | 1640300 | |
| UV Transilluminator | BioRad | 1708110EDU | |
| Thermocycler | Eppendorf | 6334000069 | |
| Stereoscopic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| 2x Micromanipulators | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Oocytes manipulator | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Microinjector (Femtojet) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Mice C57BL/6J strain | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
References
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