Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

КРИСПР-ассоциированный протеин Cpf1 может управляться специально разработанной РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК на желаемых участках, создавая липкие концы. Основываясь на этой характеристике, был установлен стандарт сборки ДНК (C-Brick), и здесь описывается протокол, подробно описывающий его использование.

Abstract

CRISPR-ассоциированный белок Cpf1 расщепляет двухцепочечную ДНК под руководством РНК CRISPR (crRNA), образуя липкие концы. Из-за этой характеристики Cpf1 использовался для установления стандарта сборки ДНК под названием C-Brick, который имеет преимущество в длинных местах распознавания и коротких рубцах. На стандартном векторе C-Brick существует четыре сайта распознавания Cpf1 - префикс (сайты T1 и T2) и суффикс (сайты T3 и T4) - фланкирующие части биологической ДНК. Расщепление сайтов T2 и T3 дает дополнительные липкие концы, которые позволяют собирать части ДНК с участками T2 и T3. Между тем короткий шов «GGATCC» образуется между частями после сборки. Поскольку новообразованная плазмида снова содержит четыре сайта расщепления Cpf1, этот метод позволяет итеративно собирать части ДНК, которые аналогичны тем, что указаны в стандартах BioBrick и BglBrick. Процедура, описывающая использование стандарта C-Brick для сборки частей ДНКОписывается здесь. Стандарт C-Brick может широко использоваться учеными, аспирантами и студентами и даже любителями.

Introduction

Стандартизация биологических частей ДНК важна для развития синтетической биологии 1 . Разработка процедуры сборки ДНК может заменить специальные экспериментальные проекты и устранить многие неожиданные результаты, возникающие при сборке генетических компонентов в более крупные системы. Стандарт BioBrick (BBF RFC 10) был одним из самых ранних предложенных стандартов сборки ДНК. Он использует префиксную последовательность (содержащую сайты резания EcoRI и XbaI) и последовательность суффикса (содержащую сайты репликации SpeI и PstI) 2 , 3 . Поскольку XbaI и SpeI имеют комплементарные когезионные концы, части ДНК BioBrick, которые разрезаны XbaI и SpeI, могут быть объединены вместе, создавая новый BioBrick для дальнейшей итеративной сборки.

Некоторые дефекты были идентифицированы с использованием стандарта BioBrick 4 . Например, он производит шрам на 8 п.о.Между частями ДНК, что не позволяет создавать белки-слитые. Кроме того, четыре вышеупомянутых типа рестрикционных сайтов с 6 п.о. должны быть удалены из частей ДНК, что очень неудобно. Стандарт BglBrick был создан для решения первой проблемы 5 . Он создает шрам «GGATCT» 6 б.п., продуцирующий Gly-Ser и позволяющий слияние нескольких белков или доменов белка. IBrick был разработан для решения второй проблемы 6 . Он использует самонастраивающиеся эндонуклеазы (HE), которые распознают длинные последовательности ДНК. Поскольку сайты узнавания HE редко существуют в естественных последовательностях ДНК, стандарт iBrick можно использовать для прямой конструирования частей iBrick без изменения их последовательностей ДНК. Тем не менее, стандарт iBrick оставляет шрам 21 п.о. между частями ДНК, что может быть причиной его непопулярности.

В последние годы кластеры регулярно пересекали короткие палиндромные повторы (CRISPR) система быстро развивалась 7,8 . Среди CRISPR-ассоциированных (Cas) белков в настоящее время широко используется эндонуклеаза Cas9 от Streptococcus pyogenes . В основном он вводит двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) с тупыми концами 9 .

В 2015 году Чжан и его коллеги впервые описали Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1). Он относится к системе типа К CRISPR-Cas класса 2 и представляет собой CRISRP-РНК (crRNA) -направленную эндонуклеазу 10 . В отличие от Cas9, Cpf1 вводит DSB с 4 или 5-дюймовым 5-дюймовым выступом 10 . Основываясь на этой характеристике, Cpf1 использовался для разработки стандарта сборки ДНК C-Brick 4 . На стандартном векторе C-Brick четыре целевых сайта Cpf1 с префиксом T1 / T2 и суффикс T3 / T4 фланкируют биологические части; Это похоже на стандарт BioBrick. Поскольку расщепление сайтов T2 и T3 pСтимулирует комплементарные липкие концы, можно выполнить итерационную сборку частей ДНК, образуя шрам «GGATCC» между частями. Примечательно, что стандарт C-Brick имеет два основных преимущества: распознавание длинных последовательностей мишеней и отсутствие коротких шрамов. Шрам 6 гп «GGATCC», вырабатываемый C-Brick, кодирует Gly-Ser, что позволяет создавать гибридные белки. Кроме того, стандарт C-Brick также частично совместим со стандартами BglBrick и BioBrick.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение кРНК

  1. Подготовка шаблонов crRNA
    1. Повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды ( табл. 1 ) в воде, свободной от РНКазы, до концентрации 10 мкМ.
    2. Добавить 22,5 мкл олигонуклеотида с верхней нитью (T7-F в таблице 1 ), 22,5 мкл олигонуклеотида нижней нити ( таблица 1 ) и 5 ​​мкл 10-кратного отжигающего буфера в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Шесть различных олигонуклеотидов нижней нити показаны в таблице 1 , каждая из которых должна быть индивидуально сопряжена с верхней нитью T7-F. Строчные буквы в таблице 1 представляют последовательность, подлежащую транскрибированию в направляющую последовательность кРНК. Буфер 10K Taq PCR можно использовать вместо 10x буфера отжига.
    3. Поместите ПЦР-трубку в термоциклер.
    4. Запустите программу отжига: начальная денатурация при 95 ° C для5 мин, а затем кулдаун от 95 до 20 ° С с уменьшением на 1 ° С в минуту на термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Немедленно используйте образцы для шага 1.2.1.
  2. Транскрипция и очистка кРНК
    1. Добавить 38 мкл свободной от РНКазы воды, 8 мкл матрицы из стадии 1.1.4, 20 мкл 5x T7 транскрипционного буфера, 20 мкл смеси NTP (10 мкМ), 4 мкл рекомбинантного ингибитора РНКазы (RRI) и 10 мкл Мкл РНК-полимеразы Т7 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 100 мкл.
    2. Поместите микроцентрифужную пробирку в водяную баню с температурой 37 ° C в течение ночи (около 16 часов).
    3. Используйте набор для очистки и концентрации РНК для очистки транскрибируемой РНК; Следуйте протоколу производителя.
    4. Количественное определение РНК с помощью спектрофотометров UV-Vis и разбавление РНК до концентрации 10 мкМ. Используйте образцы сразу или храните их при -80 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательность кРНКS приведены в таблице 2 .

2. Построение частей C-кирпича ( то есть введение биологических частей в стандартный вектор C-Brick)

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг имеет три подэтапа. Для коротких биологических частей ( например, промоторов и терминаторов) лучше всего использовать прямой метод ПЦР для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick 4 . Вся векторная последовательность показана в дополнительных данных, а последовательность префикса и суффикса показана на рисунке 1 (шаг 2.1 ниже). Для биологических частей, которые могут быть легко получены с помощью ПЦР ( например, с шаблонами геномной ДНК, плазмид или синтезированных последовательностей ДНК), лучше всего использовать метод бесшовной сборки для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick (Шаг 2.2 ниже). Для тех частей, которые получены из стандартов BioBrick и BglBrick, ограничениеФермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование могут быть использованы для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick (шаг 2.3 ниже).

  1. Конструкция посредством прямого ПЦР-амплификации
    1. Дизайн и порядок олигонуклеотидов для амплификации ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ. 5'-конец олигонуклеотида содержит последовательность части ДНК, а 3'-конец олигонуклеотида содержит векторную последовательность ( то есть «GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG» на 3'-конце прямой цепи и «GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG», В обратной цепи). На 5'-конце олигонуклеотида может быть спроектирован либо свес, либо свес на 20 п.н. Конкретные примеры можно найти в предыдущем исследовании 4 .
    2. Повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды в ультрачистой воде до концентрации 10 мкМ.
    3. Настройте реакции ПЦР на лед в 0,2 мл ПЦР-пробирке: добавьте 18 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 2x PCR-буфер, 1 мкл dNTP (10 мкМ), 2,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (10 мкМ) со стадии 2.1.2, 0,5 мкл стандартного вектора C-Brick (50 нг) в качестве матрицы и 0,5 мкл Высоконадежной ДНК-полимеразы. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
    4. Поместите трубку непосредственно в термоциклер и запустите программу термоциклера. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
    5. Программа термоциклера: один цикл в течение 3 мин при 98 ° C; Тридцать циклов в течение 10 с при 98 ° С, 20 с при 55 ° С и 2 мин при 72 ° С; И один цикл в течение 10 мин при 72 ° С. Держите образец при 16 ° C.
    6. Добавить 9 мкл смеси из стадии 2.1.4 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
    7. Добавить 1 мкл DpnI и инкубировать в течение 1 часа на 37 ° C водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если праймеры не имеют перекрывающихся последовательностей, добавьте 0,5 мкл T4 полинуклеотид-киназы (PNK) и 0,5 мкл ДНК-лигазы T4 и инкубируйте в22 ° C водяной бане в течение 1 часа. В противном случае, если праймеры содержат перекрывающуюся последовательность ~ 20 нт, непосредственно трансформируйте обработанные DpnI продукты в клетки E. coli (DH10B) -компетентные (этап 2.4). Линеаризованный продукт ПЦР будет циркулировать по системе рекомбинации в хосте.
    8. Немедленно используйте образцы или храните их при -20 ° C.
  2. Строительство через бесшовные сборки
    1. Дизайн и порядок олигонуклеотидов для амплификации ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ. 3'-конец олигонуклеотида содержит концевую последовательность части ДНК, а 5'-конец олигонуклеотида содержит конец линеаризованной стандартной векторной последовательности C-Brick ( то есть «CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC» для 5'- -end прямой цепи и «CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC» для 5'-конца обратной цепи). Конкретные примеры можно найти в предыдущем исследовании 4 .
    2. Повторно приостановитьОлигонуклеотидов в ультрачистой воде до концентрации 10 мкМ.
    3. Настроить реакции ПЦР на лед в 0,2 мл ПЦР-пробирке: добавить 18 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 2x PCR-буфера, 1 мкл dNTP (10 мкМ), 2,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (10 мкМ ) Из стадии 2.2.2, 0,5 мкл матрицы (20-500 нг) и 0,5 мкл высоконадежной ДНК-полимеразы. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
    4. Поместите трубку непосредственно в термоциклер и запустите программу термоциклера. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Задайте программу термоциклера: один цикл в течение 3 мин при 98 ° C; 30 циклов в течение 10 с при 98 ° С, 20 с при 55 ° С (в соответствии с температурой отжига праймера) и 1 мин (по длине биологических частей) при 72 ° С; И один цикл в течение 10 мин при 72 ° С. Держите образец при 16 ° C.
    5. Очистите продукт ПЦР с помощью системы очистки ПЦРНабор тем; Следуйте протоколу производителя.
    6. Дайте дайджест стандартного вектора C-Brick с BamHI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (1 мкг), 5 мкл 10-кратного буфера и 1 мкл BamHI в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов при 37 ° C на водяной бане.
    7. Очистите вышеуказанный продукт с помощью набора для очистки геля; Следуйте протоколу производителя.
    8. Добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) из стадии 2.2.7, 5 мкл фрагмента (200 нг) из стадии 2.2.4, 2 мкл 5х бесшовного сборного буфера и 1 мкл фермента с бесшовным сбором из бесшовного монтажного набора В 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 10 мкл.
    9. Поместите его на водяную баню с температурой 37 ° C в течение 30 минут. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  3. Конструирование через рестрикционное фермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование.
    ЗАМЕТКА: Для тех частей, которые получены из стандартов BioBrick (шаг 2.3.4-2.3.7) и BglBrick (шаг 2.3.1-2.3.3), рестрикционное фермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование могут быть использованы для вставки Биологических частей в стандартный вектор C-Brick.
    1. Дайте стандартные части BglBrick с BamHI и BglII: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (2 мкг), 5 мкл 10x буфера 3, 0,5 мкл BamHI и 0,5 мкл BglII в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    2. Проведите 1% -ный электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с помощью набора системы очистки геля.
    3. Лигируйте фрагмент и стандартный вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) из стадии 2.1.12 и 6 мкл фрагмента (200 нг) со стадии 2.3.3 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавить 1 мкл 10 x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы сразу или freezE и хранить их при -20 ° C.
    4. Дайте стандартные части BioBrick с XbaI и SpeI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (2 мкг), 5 мкл 10-бутового буфера, 0,5 мкл XbaI и 0,5 мкл SpeI в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    5. Дайте дайджест стандартного вектора C-Brick с XbaI и SpeI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (1 мкг), 5 мкл 10x буфера, 0,5 мкл XbaI и 0,5 мкл SpeI в микроцентрифужную пробирку , Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    6. Проведите 1% -ный электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с этапа 2.3.4 и линеаризованный вектор со стадии 2.3.5 с помощью набора системы очистки геля; Следуя протоколу производителя.
    7. Лигируйте фрагмент и вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) со стадии 2.3.5 и 6 мкл фрагмента (200 нг) со стадии 2.3.4 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. ОбъявлениеD 1 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  4. Добавьте 10 мкл продуктов из п. 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 или 2.3.7 для химического превращения в компетентные клетки E. coli (DH10B).
  5. Возьмите несколько клонов в 5 мл жидкой трубки Luria-Bertani (LB) и инкубируйте при 37 ° C на шейкере (220 об / мин) в течение ночи.
  6. Экстрагируют плазмиду с использованием набора для приготовления плазмид; Следуйте протоколу производителя.
  7. Определите правильные клоны с помощью последовательности Sanger 11 .

3. Сборка C-Brick ( Рисунок 2 )

  1. Пищеварение вектора C-Brick с Cpf1
    1. Добавить 22,5 мкл свободной от РНКазы воды, 4 мкл 10x Cpf1 буфера, 10 мкл плазмиды из стадии 2.6 (1 мкг), 0,5 мкл RRI и 1 мкг,# 181; L Cpf1 (5 мкМ) в 1,5-микронную центрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Cpf1 можно приобрести коммерчески или очистить по протоколу в предыдущем исследовании 4 .
    2. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T1 и T2, добавьте 1 мкл crRNA-T2 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут. Дд 1 мкл crRNA-T1 (10 мкМ) и Cpf1 (5 мкМ) в течение еще 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T3 и T4, добавить 1 мкл crRNA-T3 (10 мкМ) и инкубировать на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут. Добавьте 1 мкл crRNA-T4 (10 мкМ) еще 30 мин.
    3. Добавьте 1 мкл термочувствительной щелочной фосфатазы и инкубируйте пробирку на водяной бане при 37 ° C еще 1 час.
    4. Проведите электрофорез в агарозном геле и очистите вектор, используя комплект системы очистки геля. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
    Переваривание фрагмента ДНК с помощью Cpf1
    1. Добавить 21,5 мкл свободной от РНКазы воды, 4 мкл 10x Cpf1 буфера, 10 мкл плазмиды из стадии 2.6 (2 мкг), 0,5 мкл RRI и 2 мкл Cpf1 (5 мкМ) в 1,5-микронную центрифужную пробирку.
    2. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T1 и T2, добавьте 1 мкл crRNA-T1 (10 мкМ) и 1 мкл crRNA-T3 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы добавьте 1 мкл crRNA-T2 (10 мкМ) и 1 мкл crRNA-T4 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 2 часов.
    3. Проведите электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с помощью набора системы очистки геля. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  2. Сборка C-Brick и дальнейшая проверка
    1. Лигируйте чужеродный фрагмент ДНК и вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) со стадии 3.1.4 и 6 мкл фрагмента ДНК (200 нг) со стадии 3.2.3 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавить 1 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
    2. Добавьте 10 мкл продуктов лигирования (этап 3.3.1) для химической трансформации в клетки E. coli (DH10B).
    3. Добавьте несколько клонов в 5 мл жидкой трубки LB и инкубируйте в течение ночи на шейкере при 220 об / мин и 37 ° C.
    4. Экстрагируют плазмиду с использованием набора для приготовления плазмид; Следуйте протоколу производителя.
    5. Определение правильных клонов с помощью последовательности Sanger 11 .
  3. Выполните новый раунд сборки C-Brick. Правильные клоны с шага 3.3.4 могут быть использованы в качестве нового вектора C-Brick или части ДНК для дальнейшей итеративной сборки C-Brick по тому же протоколу, что и на этапах 3.1-3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: T2 'и T3' sItes разработаны как резервная копия сайтов T2 и T3 ( рис. 1a ). Для плазмид, полученных на этапе 2.3.7, для стандартной сборки C-Brick могут использоваться только T2 'и T3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол продемонстрировал сборку трех кассет хромопротеинов (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) и amilGFP (BBa_K592010)). Во-первых, кодирующие последовательности трех вышеупомянутых генов и терминаторов были индивидуально клонированы в стандартный вектор C-Brick. Короткие части ДНК, промотор и терминатор вводили в вектор C-Brick через ПЦР-амплификацию с использованием праймеров, содержащих короткие части ДНК на 5'-конце. Затем последовал метод самолигирования. Три последовательности, кодирующие хромопротеины, сначала синтезировали de novo, а затем клонировали в стандартный вектор C-Brick посредством бесшовной сборки. Праймеры были описаны в предыдущем исследовании 4 .

После этого последовательности cjBlue, eforRed и amilGFP лигировали с терминаторными и промоторными последовательностями в той же самой процедуре, показанной в«Xfig»> Рисунок 2. Правильные конструкции были преобразованы в E. coli , демонстрируя красивые цвета ( рисунок 3а ). Впоследствии две цветные экспрессионные кассеты были дополнительно собраны со стандартом C-Brick для создания большего количества цветов ( т. Е. Красного цвета от amilGFP plus eforRed, зеленого цвета от amilGFP plus cjBlue и светло-фиолетового цвета от eforRed plus cjBlue; 3b ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Последовательность ДНК стандартного интерфейса C-Brick и стандартный вектор C-Brick. ( A ) Последовательность стандартного интерфейса C-кирпича T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'- может быть распознана соответствующей кРНК и затем введена в 5-дюймовый свес с использованием Cpf1. Расщепление участков T2 и T3 (или T2 и T3)висит. С учетом восьми сайтов рестрикции, стандарт C-Brick частично совместим с BioBrick и BglBrick. ( B ) Плазмидная карта стандартного вектора C-Brick с сайтами рестрикционного расщепления. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Рабочий процесс сборки ДНК в стандарте C-Brick. Cpf1-расщепленные целевые сайты T2 и T3 продуцируют комплементарные когезионные концы «GGATC» и «GATCC», соответственно, которые могут быть лигированы для генерации короткого шрама «GGATCC». Подробные процедуры можно найти на шаге 3 в тексте («сборка C-Brick»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы Просмотрите большую версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Красочные бактериальные пигменты, производимые сборками E. coli, собранными в стандарте C-Brick. ( А ) Три хромопротеина выражали в E. coli, выращенной на пластине. Бактерии без хромопротеинов (отрицательный контроль) показаны на 4 -й пластинке. ( Б ) Три хромопротеинов и три собранных двойных хромопротеина были экспрессированы в E. coli, выращенной в жидкой среде LB. С 1 по 6 конструкции, выраженные для Red (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP плюс eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) и eforRed plus cjBlue (6). Красочные бактерии на одной пластине или в одной микроцентрифужной пробирке культивировали из одного контролируемого последовательности клона. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

имя последовательность
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
Т7-T1-R, gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
Т7-T2'-R, ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
Т7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
Т7-Т3-R, ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
Т7-t3'-R, ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
Т7-Т4-Р ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Таблица 1: Олигос для получения шаблонов транскрипции crRNA, используемых в этом исследовании. T7-F является олигонуклеотидом верхней нити, а остальные являются олигонуклеотидами нижних нитей. Нижние регистры в последовательности будут транскрибироваться в направляющую последовательность в кРНК.

имена Последовательности РНК (5'-3 ')
crRNA-Т1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-Т2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-Т2' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Таблица 2: Последовательности crRNA, используемые в этом исследовании. КРНК получали через транскрипцию in vitro на этапе 1 в тексте («Приготовление кРНК»).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе описывается процедура для стандартного сборщика ДНК C-Brick. Наиболее важным шагом в этом протоколе является линеаризация стандартного вектора C-Brick; Неполное расщепление вектора может серьезно повлиять на скорость успеха. Кроме того, хотя Cpf1 главным образом расщепляет целевые ДНК-последовательности в схеме расщепления 18-23, было обнаружено неточное расщепление вблизи двух оснований 4 , что может вызвать небольшое количество мутаций после сборки ДНК. Поэтому для проверки собранной конструкции требуется секвенция Sanger.

Эффективность сборки C-Brick ниже, чем традиционный рестрикционный фермент и методы лигирования, которые были описаны в предыдущем исследовании 4 . Основной причиной, влияющей на эффективность сборки, могут быть неточные характеристики расщепления Cpf1. В будущем улучшения точности расщепления могут быть чрезвычайно полезны для стандарта aNd в настоящее время изучаются.

C-Brick также частично совместим со стандартами BglBrick и BioBrick. Например, части BglBrick могут быть разрезаны BglII и BamHI, а затем вставлены в сайт BamHI стандартного вектора C-Brick, генерируя часть C-Brick. Тем не менее, направление вставки части BglBrick должно быть проверено, и после сборки будет шрам «GGATCT». Когда часть ДНК C-Brick получается из части BioBrick ( т. Е. С расщеплением XbaI и SpeI), обе сайты T2 и T3 будут уничтожены, и могут быть использованы две резервные целевые последовательности Cpf1 (T2 'и T3').

Поскольку для расщепления Cpf1 требуется sgRNA, которая чрезвычайно чувствительна к РНКазе, все материалы должны быть без РНКазы. В настоящее время все стандартные векторы C-Brick, RNase-свободные Cpf1-нуклеазы и кРНК могут быть заказаны коммерчески 12 . Таким образом, процедуры для C-Brick на самом деле такие же простые, как и процедуры BioКирпичный стандарт.

В последние несколько лет были разработаны и широко используются несколько полезных методов сборки ДНК, в том числе «Золотые ворота» 13 , «Гибсонская Ассамблея 14 » и другие 15 . Однако, поскольку стандарты сборки ДНК могут обеспечить рентабельные, надежные, высокопроизводительные и автоматические реакции сборки 5 , стандарты могут облегчать конструкцию и тестирование вновь разработанных или повторно разработанных генов, генетических схем и путей 15 , 16 , 17 , особенно в области синтетической биологии. Среди опубликованных в настоящее время стандартов сборки ДНК стандарт C-Brick имеет как очевидные преимущества, так и недостатки 4 ( т.е. эффективность лигирования). Если эффективность лигирования будет улучшена, стандарт может быть широко принят в будущем,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Shanghai Tolo Biotech за техническую помощь во время разработки стандарта C-Brick. Эта работа была поддержана грантами Программы стратегических приоритетных исследований Академии наук Китая (грант № XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

Генетика выпуск 124 синтетическая биология CRISPR Cpf1 C-Brick липкие концы сборка ДНК, Стандарт сборки
Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter