Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

البروتين كريسبر المرتبطة Cpf1 يمكن أن تسترشد رنا كريسبر المصممة خصيصا (الحمض النووي الريبي النووي) لتلتصق الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في المواقع المطلوبة، وتوليد نهاية لزجة. واستنادا إلى هذه الخاصية، تم إنشاء معيار تجميع الحمض النووي (C- الطوب)، ويرد وصف بروتوكول بالتفصيل استخدامه هنا.

Abstract

كريسبر المرتبطة البروتين Cpf1 ينقسم المزدوج الحمض النووي تقطعت بهم السبل بتوجيه من الحمض النووي الريبي كريسبر (كرنا)، وتوليد نهاية لزجة. وبسبب هذه الخاصية، تم استخدام Cpf1 لإنشاء معيار التجمع الحمض النووي يسمى C- الطوب، والتي لديها ميزة من مواقع الاعتراف طويلة وندوب قصيرة. على ناقلات C- الطوب القياسية، وهناك أربعة مواقع التعرف Cpf1 - البادئة (T1 و T2 المواقع) واللاحقة (T3 و T4 مواقع) - يحيط أجزاء الحمض النووي البيولوجية. الانقسام من T2 و T3 مواقع تنتج نهايات لزجة تكميلية، والتي تسمح لتجميع أجزاء الحمض النووي مع T2 و T3 المواقع. وفي الوقت نفسه، يتم إنشاء ندبة قصيرة "غاتسك" بين أجزاء بعد التجمع. كما البلازميد التي شكلت مرة أخرى يحتوي على أربعة مواقع الانقسام Cpf1، وتسمح هذه الطريقة لتجميع تكرارية من أجزاء الحمض النووي، والتي تشبه تلك التي من معايير بيوبريك و بغلبريك. إجراء يحدد استخدام معيار C- الطوب لتجميع أجزاء الحمض النوويهو موضح هنا. يمكن استخدام معيار C-بريك على نطاق واسع من قبل العلماء والدراسات العليا وطلاب المرحلة الجامعية، وحتى الهواة.

Introduction

وتوحيد الأجزاء البيولوجية دنا مهم لتطوير البيولوجيا التركيبية 1 . تطوير إجراء التجمع الحمض النووي يمكن أن تحل محل التصاميم التجريبية المخصصة وإزالة العديد من النتائج غير المتوقعة التي تنشأ خلال تجميع المكونات الوراثية في النظم الأكبر حجما. وكان معيار بيوبريك (بف رك 10) واحدة من أقرب معايير التجمع الحمض النووي المقترحة. ويستخدم تسلسل البادئة (التي تحتوي على إكوري و زباي قطع المواقع) وتسلسل لاحقة (التي تحتوي على سبي و بستي قطع المواقع) 2 ، 3 . لأن زباي و سبي لها نهاية متماسكة متماسكة، أجزاء بيوبريك الحمض النووي التي يتم قطع مع زباي و سبي يمكن أن تنضم معا، وتوليد بيوبريك جديدة لمزيد من التجمع التكراري.

وقد تم تحديد بعض العيوب باستخدام معيار بيوبريك 4 . على سبيل المثال، فإنه ينتج ندبة 8-بببين أجزاء الحمض النووي، والتي لا تسمح لبناء البروتينات في الانصهار. الى جانب ذلك، يجب إزالة الأنواع الأربعة المذكورة أعلاه من مواقع تقييد 6-بب من أجزاء الحمض النووي، وهو أمر غير مريح للغاية. تم إنشاء معيار بلبريك لحل المشكلة الأولى 5 . أنه يخلق ندبة 6-بب "غاتكت"، وإنتاج غلي-سير والسماح للانصهار من البروتينات متعددة أو المجالات البروتين. وقد وضعت إبريك للتعامل مع المشكلة الثانية 6 . ويستخدم إندونوكليسيس صاروخ موجه (هيس) التي تعترف تسلسل الحمض النووي طويلة. كما نادرا ما توجد مواقع الاعتراف سعادة في تسلسل الحمض النووي الطبيعي، ويمكن استخدام معيار إبريك للبناء المباشر لقطع إيبريك دون تعديل تسلسل الحمض النووي. ومع ذلك، فإن معيار إبريك يترك ندبة بب 21 بين أجزاء الحمض النووي، والتي قد تكون السبب لعدم شعبية لها.

في السنوات الأخيرة، يتجمع بشكل منتظم متداخلة قصيرة يتكرر متناوب (كريسبيأر) نظام سريع 7 ، 8 . بين البروتينات المرتبطة كريسبر (كاس)، كاس 9 نوكلياز من العقدية بيوجينيس هو الآن تستخدم على نطاق واسع. فإنه يدخل في الغالب فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (دسبس) مع نهايات حادة 9 .

في عام 2015، وصف زانغ وزملاء العمل Cpf1 (كريسبر من بريفوتيلا و فرانسيسيلا 1) لأول مرة. وهو ينتمي إلى فئة 2 نوع V نظام كريسبر-كاس وهو كريسرب رنا (كرنا) - إندونوكلياز الموجهة -10 . على عكس Cas9، Cpf1 يقدم دسب مع 4 أو 5 نت 5 'المتراكمة 10 . واستنادا إلى هذه الخاصية، تم استخدام Cpf1 لتطوير معيار التجمع الحمض النووي، C- الطوب 4 . على ناقلات القياسية C- الطوب، أربعة مواقع الهدف Cpf1 من مسبوق T1 / T2 و سوفيكسد T3 / T4 الجناح الأجزاء البيولوجية. وهذا يشبه معيار بيوبريك. كما انشقاق T2 و T3 مواقع pيولد نهايات لزجة التكميلية، فمن الممكن لأداء التجمع تكرارية من أجزاء الحمض النووي في حين توليد ندبة "غاتسك" بين الأجزاء. والجدير بالذكر أن معيار C-بريك له ميزتان رئيسيتان: التعرف على تسلسل الهدف الطويل وترك ندوب قصيرة. و 6 بب "غاتسك" ندبة ولدت من C- الطوب ترميز غلي-سير، والذي يسمح لبناء البروتينات الانصهار. وعلاوة على ذلك، فإن معيار C- الطوب هو أيضا متوافقة جزئيا مع معايير بغبريك و بيوبريك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحمض الريبي النووي النقال

  1. إعداد قوالب الحمض الريبي النووي النقال
    1. إعادة تعليق أوليغونوكلأوتيدس الفردية ( الجدول 1 ) في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى تركيز 10 ميكرومتر.
    2. إضافة 22.5 ميكرولتر من أوليغونوكليوتيد أعلى حبلا (T7-F في الجدول 1 )، 22.5 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد أسفل حبلا ( الجدول 1 )، و 5 ميكرولتر من العازلة الصلب 10X إلى أنبوب 0.2 مل ير. تأكد من أن الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: ستة أوليغونوكلأوتيدس أسفل ستراند مختلفة في الجدول 1 ، كل منها يجب أن يكون إرفاقها بشكل فردي مع أعلى حبلا T7-F. الأحرف الصغيرة في الجدول 1 تمثل تسلسل ليتم نسخها في تسلسل دليل الحمض النووي الريبي النووي. 10X طق ير عازلة يمكن استخدامها بدلا من العازلة الصلب 10X.
    3. وضع أنبوب ير في ثيرمويكلر.
    4. تشغيل برنامج الصلب: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية ل5 دقائق ثم تباطؤ من 95-20 درجة مئوية، مع انخفاض 1 درجة مئوية في الدقيقة على ثيرمويكلر.
      ملاحظة: على الفور استخدام العينات للخطوة 1.2.1.
  2. النسخ وتنقية الحمض الريبي النووي النقال
    1. إضافة 38 ميكرولتر من المياه خالية من ريبونوكلياز، 8 ميكرولتر من القالب من الخطوة 1.1.4، 20 ميكرولتر من 5X T7 عازلة النسخ، 20 ميكرولتر من خليط نتب (10 ميكرومتر)، 4 ميكرولتر من المانع المؤتلف ريبونوكلياز (ري)، و 10 ميكرولتر من T7 رنا البلمرة إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. تأكد من أن الحجم الكلي هو 100 ميكرولتر.
    2. وضع أنبوب ميكروسنتريفوج في حمام مائي 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (لمدة 16 ساعة).
    3. استخدام تنظيف الحمض النووي الريبي ومجموعة تركيز لتنقية الحمض النووي الريبي كتب. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    4. كوانتيتات الرنا مع الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي وتمييع الحمض النووي الريبي إلى تركيز 10 ميكرومتر. استخدام العينات على الفور أو تخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تسلسل الحمض الريبي النووي النقالs مدرجة في الجدول 2 .

2. بناء أجزاء C- الطوب ( أي إدراج الأجزاء البيولوجية في ناقلات القياسية C- الطوب)

ملاحظة: تحتوي هذه الخطوة على ثلاث خطوات فرعية. بالنسبة للأجزاء البيولوجية القصيرة (على سبيل المثال، المروجين والمطاريف)، فمن الأفضل استخدام طريقة ير المباشرة لإدراج الأجزاء البيولوجية في ناقلات القياسية C-بريك 4 . ويرد تسلسل ناقلات كله في البيانات التكميلية، ويظهر البادئة وتسلسل لاحقة في الشكل 1 (الخطوة 2.1، أدناه). للأجزاء البيولوجية التي يمكن الحصول عليها بسهولة عن طريق ير (على سبيل المثال، مع قوالب الحمض النووي الجيني ، البلازميدات، أو دي نوفو تسلسل الحمض النووي توليفها)، فمن الأفضل لاستخدام طريقة التجمع السلس لإدراج الأجزاء البيولوجية في ناقلات القياسية C- الطوب (الخطوة 2.2 أدناه). بالنسبة لتلك الأجزاء التي تم الحصول عليها من معايير بيوبريك و بغلبريك، تقييدانزيم بوساطة الهضم و T4 دنا ربط بوساطة ليغاز يمكن استخدامها لإدراج الأجزاء البيولوجية في ناقلات القياسية C- الطوب (الخطوة 2.3، أدناه).

  1. البناء عن طريق التضخيم ير مباشرة
    1. تصميم والنظام أوليغونوكليوتيدس ل ير التضخيم.
      ملاحظة: 5-نهاية من قليل النوكليوتيد يحتوي على تسلسل جزء من الحمض النووي، و 3'- نهاية أوليغونكلأوتيد يحتوي على تسلسل ناقلات ( أي "غاتكاكتاغتكتاغكتغس" في 3'- نهاية حبلا إلى الأمام و "غاتكتكتكتكتكتاغ" في حبلا العكسي). إما لا المتراكمة أو 20 ~ بب-أوفيرهانغ يمكن أن تكون مصممة في 5'- نهاية أوليغونكلأوتيد. ويمكن العثور على أمثلة محددة في دراسة سابقة 4 .
    2. إعادة تعليق أوليغونوكليوتيدس الفردية في الماء نقية للغاية لتركيز 10 ميكرومتر.
    3. إعداد تفاعلات ير على الجليد في أنبوب ير 0.2 مل: إضافة 18 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 25 ميكرولتر من 2X Pكر ميكرولتر، 1 ميكرولتر من دنتبس (10 ميكرومتر)، 2.5 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس (10 ميكرومتر) من الخطوة 2.1.2، 0.5 ميكرولتر من C- الطوب ناقلات القياسية (50 نانوغرام) كقالب، و 0.5 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي عالية الدقة. تأكد من أن الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    4. وضع أنبوب مباشرة إلى ثيرمويكلر وبدء برنامج ثيرمويكلر. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    5. برنامج ثيرمويكلر: دورة واحدة لمدة 3 دقائق في 98 درجة مئوية. ثلاثين دورة لمدة 10 ثانية عند 98 درجة مئوية، 20 ثانية عند 55 درجة مئوية، ودقيقتين في 72 درجة مئوية؛ ودورة واحدة لمدة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. إبقاء العينة في 16 درجة مئوية.
    6. إضافة 9 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 2.1.4 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
    7. إضافة 1 ميكرولتر من دبني واحتضان لمدة 1 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا الاشعال ليس لديها تسلسل متداخلة، إضافة 0.5 ميكرولتر من كيناز T4 بولينوكليوتيد (بنك) و 0.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاز واحتضان فيحمام مائي 22 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وإلا، إذا كانت الاشعال تحتوي على تسلسل متداخل ~ 20 نانومتر، وتحويل مباشرة المنتجات المعالجة دبني إلى E. القولونية (DH10B) الخلايا -Cectent (الخطوة 2.4). سيتم تدوير دائري المنتج ير من قبل نظام إعادة التركيب في المضيف.
    8. استخدام العينات على الفور أو تخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. البناء عن طريق التجمع السلس
    1. تصميم والنظام أوليغونوكليوتيدس ل ير التضخيم.
      ملاحظة: 3'- نهاية أوليغونكلأوتيد يحتوي على تسلسل محطة من جزء الحمض النووي، و 5'- نهاية أوليغونكلأوتيد يحتوي على محطة خطي C- الطوب متجه قياسي متجه ( أي "كتاغاغاغاغاتسك" ل 5 ' - نهاية من حبلا إلى الأمام و "كغاكتاغاغتاغتغاتك" ل 5'- نهاية حبلا العكسي). ويمكن العثور على أمثلة محددة في دراسة سابقة 4 .
    2. قم بإعادة التعليقأوليغونوكلأوتيدس في المياه نقية جدا لتركيز 10 ميكرومتر.
    3. إعداد تفاعلات ير على الجليد في أنبوب 0.2 مل ير: إضافة 18 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 25 ميكرولتر من العازلة 2X ير، 1 ميكرولتر من دنتبس (10 ميكرومتر)، 2.5 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس (10 ميكرومتر ) من الخطوة 2.2.2، 0.5 ميكرولتر من قالب (20-500 نانوغرام)، و 0.5 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي عالية الدقة. تأكد من أن الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    4. وضع أنبوب مباشرة في ثيرمويكلر وتشغيل برنامج ثيرمويكلر. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تعيين برنامج ثيرمويكلر إلى: دورة واحدة لمدة 3 دقائق في 98 درجة مئوية. 30 دورات لمدة 10 ثانية عند 98 درجة مئوية، 20 ثانية عند 55 درجة مئوية (وفقا لدرجة حرارة الصلب من التمهيدي)، و 1 دقيقة (وفقا لطول الأجزاء البيولوجية) في 72 درجة مئوية. ودورة واحدة لمدة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. إبقاء العينة في 16 درجة مئوية.
    5. تنقية المنتج ير باستخدام نظام منع التلوث ير تنظيفتيم طقم؛ اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    6. هضم المتجهات القياسية C- الطوب مع بامهي: إضافة 34 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 10 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة 10X، و 1 ميكرولتر من بامهي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج. احتضان لمدة تصل إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    7. تنقية المنتج أعلاه باستخدام نظام تنظيف هلام كيت؛ اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    8. إضافة 2 ميكرولتر من ناقلات الخطية (50 نانوغرام) من الخطوة 2.2.7، 5 ميكرولتر من جزء (200 نانوغرام) من الخطوة 2.2.4، 2 ميكرولتر من 5X عازلة التجمع السلس، و 1 ميكرولتر من انزيم التجمع سلس من مجموعة التجمع سلس إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. تأكد من أن الحجم الكلي هو 10 ميكرولتر.
    9. وضع هذا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. البناء عن طريق تقييد انزيم بوساطة الهضم و T4 الحمض النووي ربط بوساطة ليغاز.
    ملحوظة: بالنسبة لتلك الأجزاء التي تم الحصول عليها من بيوبريك (الخطوة 2.3.4-2.3.7) و بغلبريك (الخطوة 2.3.1-2.3.3) المعايير، تقييد انزيم بوساطة الهضم و T4 دنا ربط بوساطة ليغاز يمكن استخدامها لإدراج الأجزاء البيولوجية إلى ناقلات القياسية C- الطوب.
    1. هضم الأجزاء القياسية بغلبريك مع بامهي و بغلي: إضافة 34 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 10 ميكرولتر من البلازميد (2 ميكروغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة 10X 3، 0.5 ميكرولتر من بامهي، و 0.5 ميكرولتر من بغلي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج. احتضان لمدة 2 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. تشغيل 1٪ الاغاروز هلام الكهربائي وتنقية جزء باستخدام مجموعة نظام تنظيف هلام.
    3. ليغات جزء و C- الطوب القياسية ناقلات: إضافة 2 ميكرولتر من ناقلات الخطية (50 نانوغرام) من الخطوة 2.1.12 و 6 ميكرولتر من جزء (200 نانوغرام) من الخطوة 2.3.3 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. إضافة 1 ميكرولتر من 10 × T4 دنا يغاز العازلة و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاز. احتضان لمدة 2 ساعة عند 22 درجة مئوية. استخدام العينات على الفور أو تجميده وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    4. هضم الأجزاء القياسية بيوبريك مع زباي و سبي: إضافة 34 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 10 ميكرولتر من البلازميد (2 ميكروغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة 10X، 0.5 ميكرولتر من زباي، و 0.5 ميكرولتر من سبي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج. احتضان لمدة 2 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    5. هضم ناقلات القياسية C- الطوب مع زباي و سبي: إضافة 34 ميكرولتر من الماء النقي جدا، 10 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام)، 5 ميكرولتر من العازلة 10X، 0.5 ميكرولتر من زباي، و 0.5 ميكرولتر من سبي إلى أنبوب ميكروسنتريفوج . احتضان لمدة 2 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. تشغيل 1٪ الاغاروز هلام الكهربائي وتنقية جزء من الخطوة 2.3.4 والناقلات الخطية من الخطوة 2.3.5 مع مجموعة نظام تنظيف هلام. بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
    7. ليغات جزء وناقلات C- الطوب: إضافة 2 ميكرولتر من ناقلات الخطية (50 نانوغرام) من الخطوة 2.3.5 و 6 ميكرولتر من جزء (200 نانوغرام) من الخطوة 2.3.4 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. ميلاديد 1 ميكرولتر من 10X T4 دنا يغاز العازلة و 1 ميكرولتر من T4 دنا يغاز. احتضان لمدة 2 ساعة عند 22 درجة مئوية. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من المنتجات من الخطوة 2.1.8، 2.2.9، 2.3.3، أو 2.3.7 للتحول الكيميائي إلى الخلايا المختصة من E. القولونية (DH10B).
  5. البيك اب عدة الحيوانات المستنسخة إلى أنبوب السائل 5-مل لوريا-بيرتاني (لب) أنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية على شاكر (220 دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها.
  6. استخراج البلازميد باستخدام مجموعة إعداد البلازميد. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  7. تحديد المستنسخات الصحيحة من قبل سانجر التسلسل 11 .

3. c-- الطوب التجمع ( الشكل 2 )

  1. الهضم من ناقلات C- الطوب مع Cpf1
    1. إضافة 22.5 ميكرولتر من المياه خالية من ريبونوكلياز، 4 ميكرولتر من 10X Cpf1 العازلة، 10 ميكرولتر من البلازميد من الخطوة 2.6 (1 ميكروغرام)، 0.5 ميكرولتر من ري،# 181؛ L من Cpf1 (5 ميكرومتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
      ملاحظة: Cpf1 يمكن شراؤها تجاريا أو تنقيته بعد البروتوكول في دراسة سابقة 4 .
    2. لإدراج جزء الحمض النووي الأجنبي في مواقع T1 و T2، إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي النووي-T2 (10 ميكرومتر) واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. د 1 ميكرولتر من كرنا-T1 (10 ميكرومتر) و Cpf1 (5 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة أخرى.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، لإدراج جزء الحمض النووي الأجانب في مواقع T3 و T4، إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي النووي T3 (10 ميكرومتر) واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر من كرنا-T4 (10 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة أخرى.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوية ثيرموسنسيتيف واحتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أخرى.
    4. تشغيل الاغاروز هلام الكهربائي وتنقية ناقلات باستخدام مجموعة نظام تنظيف هلام. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    الهضم من شظايا الحمض النووي مع Cpf1
    1. إضافة 21.5 ميكرولتر من المياه خالية من ريبونوكلياز، 4 ميكرولتر من 10X Cpf1 العازلة، 10 ميكرولتر من البلازميد من الخطوة 2.6 (2 ميكروغرام)، 0.5 ميكرولتر من ري، و 2 ميكرولتر من Cpf1 (5 ميكرومتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل.
    2. لإدراج جزء الحمض النووي الأجنبي في مواقع T1 و T2، إضافة 1 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي الذواب T1 (10 ميكرومتر) و 1 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي الذواب T3 (10 ميكرومتر) واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، إضافة 1 ميكرولتر من كرنا-T2 (10 ميكرومتر) و 1 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي الذواب- T4 (10 ميكرومتر) واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. تشغيل الكهربائي هلام الاغاروز وتنقية جزء باستخدام مجموعة نظام تنظيف هلام. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. تجميع الطوب C والمزيد من التحقق
    1. ليغات شظايا الحمض النووي الخارجية و C- الطوب ناقلات: إضافة 2 ميكرولتر من ناقلات الخطية (50 نانوغرام) من الخطوة 3.1.4 و 6 ميكرولتر من شظية الحمض النووي (200 نانوجرام) من الخطوة 3.2.3 إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. إضافة 1 ميكرولتر من 10X T4 دنا يغاز العازلة و 1 ميكرولتر من T4 دنا يغاز. احتضان لمدة 2 ساعة عند 22 درجة مئوية. استخدام العينات على الفور أو تجميد وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من منتجات ربط (الخطوة 3.3.1) للتحول الكيميائي إلى E. القولونية (DH10B) الخلايا -Comppetent.
    3. إضافة عدة الحيوانات المستنسخة إلى أنبوب السائل السائل 5 مل واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر في 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
    4. استخراج البلازميد باستخدام مجموعة إعداد البلازميد. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    5. تحديد المستنسخات الصحيحة من قبل سانجر التسلسل 11 .
  3. أداء جولة جديدة من C- الطوب التجمع. يمكن استخدام الحيوانات المستنسخة الصحيحة من الخطوة 3.3.4 كما متجه C- الطوب الجديد أو جزء دنا لمزيد من التكرار التجميع C- الطوب، بعد نفس البروتوكول من الخطوات 3.1-3.3.
    ملاحظة: T2 'و T3' قتم تصميم إيتس كما النسخ الاحتياطي للمواقع T2 و T3 ( الشكل 1A ). للبلازميدات التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.3.7، T2 فقط 'و T3' يمكن استخدامها لتجميع C- الطوب القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأظهر هذا البروتوكول تجميع ثلاثة أشرطة الكروموبروتين (كجبلو (BBa_K592011)، إفوريد (BBa_K592012)، و أميلغف (BBa_K592010)). أولا، تم استنساخ تسلسل التشفير للجينات والمطاريف الثلاثة المذكورة أعلاه بشكل فردي في متجه قياسي C-بريك. تم إدخال أجزاء الحمض النووي قصيرة، المروج والمخترق، في ناقلات C- الطوب من خلال التضخيم ير باستخدام الاشعال التي تحتوي على أجزاء الحمض النووي قصيرة على محطة 5 '. وأعقب ذلك طريقة الربط الذاتي. تم ترتيب ثلاثة تسلسل تروموبروتين أول دي نوفو توليفها ثم استنساخها في ناقلات القياسية C- الطوب من خلال التجمع السلس. تم وصف الاشعال في دراسة سابقة 4 .

بعد ذلك، تم ربط سغبلو، إفورد، وتسلسل أميلغف مع تسلسل المنهي والمروج في نفس الإجراء هو مبين في"زفيغ"> الشكل 2. تم تحويل التركيبات الصحيحة إلى E. القولونية، مما يدل على الألوان الجميلة ( الشكل 3A ). في وقت لاحق، تم تجميعها اثنين من أشرطة التعبير اللون مع مزيد من معيار C- الطوب لخلق المزيد من الألوان ( أي اللون الأحمر من أميلغف زائد إفوريد، اللون الأخضر من أميلغف زائد سبلو، واللون الأرجواني الفاتح من إفوريد بالإضافة إلى سبلو؛ الشكل 3 ب ).

شكل 1
الشكل 1: C- الطوب ستاندرد واجهة تسلسل الحمض النووي و C- الطوب ناقل قياسي. ( أ ) يمكن التعرف على تسلسل واجهة C- الطوب القياسية واجهة T1، T2، T3، T4، T2 '، T3' من قبل كرنا المقابلة لها ثم أدخلت في 5' المتراكمة باستخدام Cpf1. انقسام T2 و T3 (أو T2 'و T3') مواقع تنتج تكميليةتوقف. مع ثمانية مواقع تقييد مصممة، و C- الطوب القياسية هي متوافقة جزئيا مع بيوبريك و بغلبريك. ( ب ) خريطة البلازميد للناقلات القياسية C- الطوب مع مواقع الهضم تقييد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: سير العمل لتجميع الحمض النووي في معيار C- الطوب. وتنتج مواقع الهدفين T2 و T3 المستخلصة من Cpf1 نهايات متماسكة تكميلية ل "غاتك" و "غاتسك" على التوالي، والتي يمكن ربطها لتوليد ندبة قصيرة "غاتسك". ويمكن الاطلاع على الإجراءات التفصيلية في الخطوة 3 في النص ("تجميع C-بريك"). الرجاء النقر هنا عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: أصباغ البكتيرية الملونة التي تنتجها E. القولونية هاربورينغ يبني تجميعها في C- الطوب القياسية. ( أ ) أعرب عن ثلاثة كروموبروتينات في E. القولونية نمت على طبق من ذهب. وتظهر البكتيريا مع عدم وجود الكروموبروتينات (السيطرة السلبية) على لوحة 4TH. ( ب ) تم التعبير عن ثلاثة كروموبروتينات وثلاثة كروموبروتينات مزدوجة مجمعة في E. كولاي نمت في وسط لب السائل. من 1 إلى 6، أعرب عن التركيبات إفوريد (1)، أميلغف (2)، سيبلو (3)، أميلغف زائد إيفوريد (4)، أميلغف زائد سبلو (5)، و إفوريد زائد سبلو (6). تم استزراع البكتيريا الملونة على لوحة واحدة أو في أنبوب ميكروسنتريفوج واحد من استنساخ واحد التحقق من تسلسل. ليس / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم تسلسل
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

الجدول 1: أوليغوس لإعداد قوالب النسخ كرنا المستخدمة في هذه الدراسة. كان T7-F أوليغونوكلأوتيد أعلى حبلا، والآخرين كانت أوليغونوكلأوتيدس أسفل حبلا. سيتم نسخ القواعد الصغيرة في التسلسل في تسلسل دليل في الحمض الريبي النووي الذواب.

أسماء تسلسل الحمض النووي الريبي (5'5 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-T2 " GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3 " GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

الجدول 2: تسلسل كرنا المستخدمة في هذه الدراسة. تم إنتاج كرناس من خلال النسخ المختبر في الخطوة 1 في النص ("إعداد الحمض الريبي النووي النووي").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراء التجمع دنا القياسية C- الطوب. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الخطي من ناقلات القياسية C- الطوب. والانقسام غير مكتملة من ناقلات يمكن أن تؤثر تأثيرا خطيرا على معدل النجاح. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من Cpf1 يستهدف أساسا تسلسل الحمض النووي تسلسل في "18-23" نمط الانقسام، كما تم الكشف عن انشقاق غير دقيق بالقرب من القواعد اثنين 4 ، والتي يمكن أن تسبب عددا صغيرا من الطفرات بعد التجمع الحمض النووي. لذلك، هناك حاجة إلى تسلسل سانجر للتحقق من بناء تجميعها.

كفاءة التجميع C-بريك أقل من انزيم التقييد التقليدي وطرق الربط التي تم وصفها في دراسة سابقة 4 . السبب الرئيسي الذي يؤثر على كفاءة التجميع قد يكون خصائص الانقسام غير دقيقة من Cpf1. في المستقبل، والتحسينات على دقة الانقسام يمكن أن تكون مفيدة للغاية لمعيار أويجري حاليا استكشافها.

C- الطوب هو أيضا متوافقة جزئيا مع معايير بغبريك و بيوبريك. على سبيل المثال، يمكن قطع أجزاء بلبريك مع بغلي و بامهي ثم إدراجها في موقع بامهي من ناقلات القياسية C- الطوب، وتوليد جزء C- الطوب. ومع ذلك، ينبغي التحقق من اتجاه الإدراج من جزء بلبريك، وسوف يكون هناك "غاتكت" ندبة بعد التجمع. عندما يتم الحصول على جزء دنا C- الطوب من جزء بيوبريك ( أي مع زباي و سبي الهضم)، سيتم تدمير كل من T2 و T3 مواقع، واثنين من النسخ الاحتياطية تسلسل الهدف Cpf1 (T2 'و T3') يمكن استخدامها.

كما ان الانقسام Cpf1 يتطلب سغرنا، وهو حساس للغاية ل ريبونوكلياز، يجب أن تكون جميع المواد خالية من ريبونوكلياز. حاليا، جميع ناقلات القياسية C- الطوب، نوكليسيس Cpf1 خالية من نوكليسيس، و كرناس يمكن أن يؤمر تجاريا 12 . لذلك، فإن الإجراءات ل C- الطوب هي في الواقع بسيطة مثل تلك الحيويةالطوب القياسية.

في السنوات القليلة الماضية، وقد تم تطوير العديد من أساليب تجميع الحمض النووي مفيدة وتستخدم على نطاق واسع، بما في ذلك الجمعية الذهبية غيت 13 ، جيبسون الجمعية 14 ، وغيرها 15 . ومع ذلك، كما معايير التجمع الحمض النووي لديها القدرة على توفير فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها، وارتفاع الإنتاجية، والتفاعلات التلقائية التجمع 5 ، والمعايير قد يسهل بناء واختبار الجينات المصممة حديثا أو إعادة تصميم والدوائر الوراثية والمسارات 15 ، 16 ، 17 ، وخاصة في مجال البيولوجيا التركيبية. ومن بين معايير تجميع الحمض النووي المنشورة حاليا، فإن معيار C-بريك له مزايا وعيوب واضحة 4 ( أي كفاءة الربط). إذا تم تحسين كفاءة ربط، يمكن اعتماد معيار على نطاق واسع في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر شنغهاي تولو التكنولوجيا الحيوية لمساعدتهم التقنية خلال تطوير معيار C- الطوب. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (منحة رقم XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

علم الوراثة، العدد 124، البيولوجيا التركيبية، كريسبر، Cpf1، C- الطوب، نهايات لزجة، التجمع الحمض النووي،
بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter