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Genetics

सी-ईंट डीएनए मानक विधानसभा सीपीएफ 1 के लिए प्रोटोकॉल

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन सीपीएफ 1 को एक विशेष रूप से डिजाइन किए क्रिस्प्र आरएनए (सीआरआरएनए) द्वारा निर्देशित किया जा सकता है ताकि वांछित जगहों पर डबल-फंसे डीएनए को साफ किया जा सके, चिपचिले सिरों को पैदा कर सकें। इस विशेषता के आधार पर, एक डीएनए असेंबली मानक (सी-ईंट) की स्थापना की गई थी, और इसका उपयोग करने वाले एक प्रोटोकॉल को यहाँ वर्णित किया गया है।

Abstract

सीआरआईएसपीआर से जुड़े प्रोटीन सीपीएफ 1 क्लिसिबल आरएनए (सीआरआरएनए) के मार्गदर्शन में डबल-फंसे डीएनए को साफ़ करता है, चिपचिले सिरों का उत्पादन करता है। इस विशेषता के कारण, सीपीएफ 1 का इस्तेमाल सी-ईंट नामक डीएनए असेंबली मानक की स्थापना के लिए किया गया है, जिसका लंबे समय से मान्यता प्राप्त साइटों और लघु निशान का लाभ है। मानक सी-ईंट वेक्टर पर, चार सीपीएफ 1 मान्यता वाली साइटें हैं - प्रीफ़िक्स (टी 1 और टी 2 साइटें) और प्रत्यय (टी 3 और टी 4 साइटें) - जैविक डीएनए भागों की चमकती हैं। टी 2 और टी 3 साइटों के क्लावेज पूरक चिपचिपा समाप्त होता है, जो टी 2 और टी 3 साइटों के साथ डीएनए भागों की विधानसभा की अनुमति देते हैं। इस बीच, एक छोटा "जीजीएटीसीसी" निशान विधानसभा के बाद भागों के बीच उत्पन्न होता है। जैसा कि नवगठित प्लाज्मिड में एक बार फिर चार सीपीएफ 1 क्लीवेज साइट्स होते हैं, इस विधि से डीएनए हिस्से के पुनरावृत्त विधानसभा की अनुमति मिलती है, जो कि जैवबरिक और बीजीएलआरिक मानकों के समान है। सी-ईंट मानक के इस्तेमाल की रूपरेखा डीएनए भागों को इकट्ठा करने के लिए एक प्रक्रियायहाँ वर्णित है सी-ईंट मानक वैज्ञानिक, स्नातक और स्नातक छात्रों द्वारा व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है, और यहां तक ​​कि शौकीनों भी।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान 1 के विकास के लिए डीएनए जैविक भागों का मानकीकरण महत्वपूर्ण है एक डीएनए विधानसभा प्रक्रिया का विकास तदर्थ प्रायोगिक डिजाइनों को बदल सकता है और बड़े प्रणालियों में आनुवंशिक घटकों की विधानसभा के दौरान उत्पन्न कई अप्रत्याशित परिणामों को निकाल सकता है। बायोबरिक मानक (बीबीएफ आरएफसी 10) सबसे पहले प्रस्तावित डीएनए विधानसभा मानकों में से एक था। यह उपसर्ग अनुक्रम (इकोआरआई और एक्सबाआई काटिंग साइट्स) और प्रत्यय अनुक्रम (स्पीआई और पीएसटी काटने वाली साइट्स वाले) 2 , 3 का उपयोग करता है । चूंकि एक्सबाआई और स्पीआई में पूरक एकत्रीय छोर हैं, क्योंकि एक्सबाआई और स्पीआई से कटौती की जाने वाली जैवबरिक डीएनए हिस्से को एक साथ जोड़ लिया जा सकता है, और आगे चलने वाले विधानसभा के लिए एक नया जैवबरिक पैदा कर सकता है।

BioBrick मानक 4 के उपयोग के साथ कुछ दोषों को पहचान लिया गया है। उदाहरण के लिए, यह एक 8-बीपी निशान पैदा करता हैडीएनए भागों के बीच, जो संलयन प्रोटीन के निर्माण की अनुमति नहीं देता है इसके अलावा, चार उपर्युक्त प्रकार के 6-बीपी प्रतिबंध साइटों को डीएनए भागों से हटा दिया जाना चाहिए, जो बहुत असुविधाजनक है। पहली समस्या को सुलझाने के लिए BglBrick मानक स्थापित किया गया था 5 । यह एक 6-बीपी "जीजीएटीसीटी" निशान बनाता है, जिससे Gly-Ser का उत्पादन होता है और कई प्रोटीन या प्रोटीन डोमेन के संलयन के लिए अनुमति देता है। द्वितीय समस्या से निपटने के लिए iBrick विकसित किया गया था 6 यह होमिंग एंडोनक्लाक्लेज़ (हेई) का इस्तेमाल करता है जो लंबे डीएनए दृश्यों को पहचानते हैं। चूंकि आईआईआर मान्यता वाले साइटें शायद ही कभी प्राकृतिक डीएनए दृश्यों में मौजूद होती हैं, आईबीआईआर मानक उनके डीएनए दृश्यों को संशोधित किए बिना iBrick भागों के प्रत्यक्ष निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, iBrick मानक डीएनए भागों के बीच एक 21 बीपी निशान छोड़ देता है, जो इसकी अलोकप्रियता का कारण हो सकता है।

हाल के वर्षों में, संकुल नियमित रूप से छोटे पतली पुनरावृत्ति (सीआरआईएसपीआर) प्रणाली तेजी से 7 , 8 विकसित की है। सीआरआईएसपीआर-जुड़े (कैस) प्रोटीन के बीच, स्ट्रैपटोकोकस पायोजनेस से कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ अब व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। यह अधिकतर दोहरे फंसे हुए डीएनए ब्रेक (डीएसबी) को शुरू करता है, जो कुंद के साथ 9 होता है।

2015 में, झांग और सहकर्मियों ने पहली बार सीपीएफ 1 ( प्रीवोटेला और फ्रांसिसेला 1 से सीआरआईएसपीआर ) का वर्णन किया । यह क्लास 2 प्रकार वी क्र्रिस्प-कैस सिस्टम से संबंधित है और यह एक सीआरआईएसआरपी आरएनए (सीआरआरएनए) है - एंटीऑन्यूच्यूड 10 द्वारा उठाया गया है । कैस 9 के विपरीत, सीपीएफ 1 ने एक डीएसबी को 4 या 5 एनटी 5 '10 ओवरहेंग लगाया है इस विशेषता के आधार पर, सीपीएफ 1 का उपयोग डीएनए असेंबली मानक, सी-ईंट 4 को विकसित करने के लिए किया गया था। एक सी-ईंट मानक वेक्टर पर, प्रीफ़िक्स्ड टी 1 / टी 2 के चार सीपीएफ 1 लक्ष्य साइट और टी 3 / टी 4 युक्त जैविक हिस्से की परतें; यह BioBrick मानक के समान है टी 2 और टी 3 साइटों की दरार के रूप मेंपूरक चिपचिपा समाप्त होता है, भागों के बीच एक "जीजीएटीसीसी" निशान पैदा करते हुए डीएनए भागों की पुनरावृत्ति विधानसभा प्रदर्शन करना संभव है। विशेष रूप से, सी-ईंट मानक के दो मुख्य लाभ हैं: लंबे लक्ष्य अनुक्रम को पहचानना और लघु निशान छोड़ना। सी-ईंट द्वारा उत्पन्न 6 बीपी "जीजीएटीसीसी" निशान, ग्लासी-सर्कोड करता है, जो संलयन प्रोटीन के निर्माण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, सी-ईंट मानक भी आंशिक रूप से BglBrick और BioBrick मानकों के साथ संगत है।

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Protocol

1. सीआरआरएनए की तैयारी

  1. सीआरआरएनए टेम्पलेट्स तैयार करना
    1. 10 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए आरएनज मुक्त पानी में व्यक्तिगत ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ( तालिका 1 ) को पुनः निलंबित करें।
    2. 22.5 μL टॉप-स्ट्रैंड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ( 1 तालिका में टी 7 -एफ), 22.5 μL नीचे-स्ट्रैंड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ( तालिका 1 ), और 5 μL 10x एनिलिंग बफर को 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। यह सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 50 μL है।
      नोट: छः अलग-अलग तराजू वाले ओलिगोनक्लियोटाइड्स तालिका 1 में दिखाए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक को अलग-अलग शीर्ष 7 टी के साथ जोड़ा जाना चाहिए। तालिका 1 में लोअरकेस अक्षर क्रआरएनए के गाइड अनुक्रम में लिखित अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं। 10x ऐकेनलिंग बफर के बजाय 10x ताक पीसीआर बफर का उपयोग किया जा सकता है
    3. पीसीआर ट्यूब को थर्मासीक्लर में रखें।
    4. Annealing प्रोग्राम चलाएं: प्रारंभिक विकृति 95 डिग्री सेल्सियस के लिए5 मिनट और फिर एक कूलडाउन 95-20 डिग्री सेल्सियस से, थर्मोसायक्लर पर प्रति मिनट 1 डिग्री सेल्सियस कम होता है।
      नोट: चरण 1.2.1 के लिए तुरंत नमूने का उपयोग करें।
  2. सीआरआरएनए का ट्रांसक्रिप्शन और शुद्धि
    1. चरण के 1.1.4, टेम्पलेट के 8 μL, 5x T7 ट्रांसक्रिप्शन बफर के 20 μL, एनटीपी मिश्रण (10 माइक्रोन) के 20 μL, पुनः संयोजक आरएनएस अवरोध करनेवाला (आरआरआई) के 4 μL, और 10 के 38 μL जोड़ें। टीडीएन आरएनए पोलीमरेज़ का μL 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में है। यह सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 100 μL है
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रात भर microcentrifuge ट्यूब रखो (लगभग 16 घंटे के लिए)।
    3. लिखित आरएनए शुद्ध करने के लिए एक आरएनए सफाई और एकाग्रता किट का प्रयोग करें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
    4. यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आरएनए की मात्रा बढ़ाएं और 10 माइक्रोन की एकाग्रता में आरएनए को पतला करें। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      नोट: क्रआरएनए अनुक्रमएस तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं

2. सी-ईंट पार्ट्स का निर्माण ( यानी, सी-ईंट मानक वेक्टर में जैविक भागों का निवेशन)

नोट: इस चरण में तीन उप-चरण हैं छोटे जैविक भागों ( जैसे, प्रमोटरों और टर्मिनेटर) के लिए, सी-ईंट मानक वेक्टर 4 में जैविक भागों को सम्मिलित करने के लिए प्रत्यक्ष पीसीआर विधि का उपयोग करना सबसे अच्छा है। पूरे वेक्टर क्रम अनुपूरक डेटा में दिखाया गया है, और उपसर्ग और प्रत्यय अनुक्रम चित्रा 1 (नीचे चरण 2.1, नीचे) में दिखाया गया है। जैविक भागों के लिए जो आसानी से पीसीआर ( जैसे जीनोमिक डीएनए, प्लास्मिड, या डी नोवो संश्लेषित डीएनए दृश्यों के टेम्पलेट्स के साथ) के माध्यम से प्राप्त किए जा सकते हैं , सी-ईंट मानक वेक्टर में जैविक भागों को सम्मिलित करने के लिए सीमलेस असेंबली विधि का उपयोग करना सबसे अच्छा है (चरण 2.2, नीचे)। BioBrick और BglBrick मानकों, प्रतिबंध से प्राप्त उन भागों के लिएएंजाइम-मध्यस्थता पाचन और टी -4 डीएनए ligase-mediated ligation का उपयोग सी-ईंट मानक वेक्टर (नीचे चरण 2.3,) में जैविक भागों को सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है।

  1. प्रत्यक्ष पीसीआर प्रवर्धन द्वारा निर्माण
    1. पीसीआर प्रवर्धन के लिए डिजाइन और ऑर्डर ओलिगोनक्लियोटाइड्स।
      नोट: ओलिगोनक्लियोटाइड के 5'-अंत में डीएनए भाग का अनुक्रम होता है, और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड के 3'-अंत में वेक्टर अनुक्रम होता है ( यानी, "जीजीटीसीसीएक्टैगटीक्टैक्टसीसीजी" आगे किनारा के 3'-अंत में और "जीजीएटीसीटीटीटीसीटीसीटीटीटीटीटीटीएटीएएजी" रिवर्स स्ट्रैंड में) ओलिगोनक्लियोटाइड के 5'-अंत में या तो कोई भी अधिक या अधिक ~ 20-बीपी ओवरहेंग डिज़ाइन किया जा सकता है। विशिष्ट उदाहरण पिछले अध्ययन 4 में मिल सकते हैं।
    2. 10 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी में व्यक्तिगत ऑलिगोनक्लियोटाइड्स को फिर से निलंबित करें।
    3. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें: अल्ट्रा-शुद्ध पानी की 18 μL, 2 एक्स पी के 25 μL जोड़ेंसीआर बफर, 1 μL डीएनटीपी (10 माइक्रोग्राम), 2.5 μL प्रत्येक चरण और रिवर्स प्राइमरों (10 माइक्रोग्राम) चरण 2.1.2 से, 0.5 μL सी-ईंट मानक वेक्टर (50 एनजी) एक टेम्पलेट के रूप में, और 0.5 μL उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ की यह सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 50 μL है।
    4. ट्यूब को थर्मोसायक्लर में सीधे रखें और थर्मासीक्लर प्रोग्राम शुरू करें। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
    5. थर्मास्कीक्लर कार्यक्रम: 3 मिनट में 98 डिग्री सेल्सियस के लिए एक चक्र; 10 डिग्री सेल्सियस पर 98 डिग्री सेल्सियस के लिए तीस चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट; और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक चक्र नमूना को 16 डिग्री सेल्सियस रखें
    6. चरण 2.1.4 से मिश्रण का 9 μL को 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जोड़ें।
    7. डीपीएनआई की 1 μL जोड़ें और 1 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में जोड़ें।
      नोट: यदि प्राइमरों में कोई ओवरलैपिंग अनुक्रम नहीं होता है, तो 0.5 μL टी -4 पॉलिन्यूक्लियोटाइड कैनेज़ (पीएनके) और 0.5 μ एल टी 4 डीएनए लेगेज जोड़ें और इसमें सेते हैं1 घंटे के लिए एक 22 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने अन्यथा, यदि प्राइमरों में ~ 20 एनटी ओवरलैपिंग अनुक्रम होता है, तो सीधे डीपीएनआई-उपचार वाले उत्पादों को ई। कोलाई (डीएच 10 बी) -योग्य कोशिकाओं (चरण 2.4) में बदल दें। लाइनरिज्ड पीसीआर उत्पाद को मेजबान में पुनर्संयोजन सिस्टम द्वारा परिचालित किया जाएगा।
    8. नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें
  2. निर्बाध विधानसभा के माध्यम से निर्माण
    1. पीसीआर प्रवर्धन के लिए डिजाइन और ऑर्डर ओलिगोनक्लियोटाइड्स।
      नोट: ओलिगोनक्लियोटाइड के 3'-अंत में डीएनए भाग का टर्मिनल अनुक्रम होता है, और ओलिगोनक्लियोटाइड के 5'-अंत में लाइनरीकृत सी-ईंट मानक वेक्टर अनुक्रम का टर्मिनल होता है ( यानी, 5 'के लिए' CTAGAAAGAGAGAGAAGGATCC) आगे की किनारा और रिवर्स स्ट्रैंड के 5'-अंत के लिए "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" का विस्तार) विशिष्ट उदाहरण पिछले अध्ययन 4 में मिल सकते हैं।
    2. इंडिविज को फिर से निलंबित करें10 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स।
    3. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें: अल्ट्रा-शुद्ध पानी के 18 μL, 2 एक्स पीसीआर बफर के 25 μL, डीएनटीपी (10 माइक्रोन) की 1 μM, 2.5 μL प्रत्येक और आगे रिवर्स प्राइमरों (10 माइक्रोन ) चरण 2.2.2 से, 0.5 μL टेम्पलेट (20-500 एनजी), और 0.5 μL उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़। यह सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 50 μL है।
    4. ट्यूब को थर्मोसायक्लर में सीधे रखें और थर्मोसायक्लर प्रोग्राम चलाएं। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
      नोट: थर्मोसाइक्लर प्रोग्राम को इस पर सेट करें: 98 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए एक चक्र; 10 डिग्री सेल्सियस पर 98 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस (प्राइमर के एनीलिंग तापमान के अनुसार), और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट (जैविक भागों की लंबाई के अनुसार); और 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक चक्र नमूना को 16 डिग्री सेल्सियस रखें
    5. PCR क्लीनअप सिस्टम का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करेंटेम किट; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
    6. बामही के साथ सी-ईंट मानक वेक्टर डाइजेस्ट करें: 34 μL अति शुद्ध पानी, 10 μL प्लाज्मिड (1 माइक्रोग्राम), 5 μL 10x बफर, और 1 μL बाम्ही को माइक्रोप्रोसेसिव ट्यूब में जोड़ें। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक 2 घंटे तक का सेवन करें।
    7. जेल क्लीनअप सिस्टम किट का उपयोग करके उपरोक्त उत्पाद को शुद्ध करें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
    8. चरण 2.2.7 से दोहरी रैखिक सदिश (50 एनजी), चरण 2.2.4 से 5 μL (200 एनजी), 2 μL 5x सीमलेस असेंबली बफर, और सीमलेस विधानसभा किट से सीमलेस विधानसभा एंजाइम के 1 μL जोड़ें। एक 1.5-एमएल माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूब के लिए। सुनिश्चित करें कि कुल मात्रा 10 μL है।
    9. इसे 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में रखें। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  3. प्रतिबंध एंजाइम-मध्यस्थता पाचन और टी -4 डीएनए ligase-mediated ligation के माध्यम से निर्माण।
    ध्यान दें: बायोइबिक (स्टेप 2.3.4-2.3.7) और बीजीआरबीरिक (चरण 2.3.1-2.3.3) मानकों से प्राप्त उन हिस्सों के लिए, प्रतिबंध एंजाइम-मध्यस्थता पाचन और टी -4 डीएनए ligase-mediated ligation को सम्मिलित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सी-ईंट मानक वेक्टर में जैविक भागों
    1. BAMHI और BglII के साथ BglBrick मानक भागों डाइजेस्ट: 34 μL अल्ट्रा शुद्ध पानी, 10 μL प्लास्मिड (2 माइक्रोग्राम), 5 μL 10x बफर 3, 0.5 μL बामHI, और 0.5 μL BglII के microcentrifuge ट्यूब के साथ जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. एक 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने और एक जेल सफाई प्रणाली किट का उपयोग कर टुकड़ा शुद्ध।
    3. टुकड़ा और सी-ईंट मानक वेक्टर को लपेटें: स्टेप 2.3.3 से चरण 2.1.12 और 6 μL टुकड़े (200 एनजी) से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए 2 μL रैखिक सदिश (50 एनजी) जोड़ें। 1 μL 10 एक्स टी 4 डीएनए लेगेज बफर और 1 μL टी -4 डीएनए लेगेज जोड़ें। 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं नमूने तुरंत या फ्रीज़ का उपयोग करेंई और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
    4. एक्सबाआई और स्पीआई के साथ बायोइबिक मानक भागों डाइजेस्ट: 34 μL अल्ट्रा-शुद्ध वाटर, 10 μL प्लास्मिड (2 माइक्रोग्राम), 5 μL 10x बफर, 0.5 μL एक्सबीआई, और 0.5 μL की स्पीआई को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. एक्स-बीआई और स्पीआई के साथ सी-ईंट मानक वेक्टर को डाइजेस्ट करें: 34 μL अति शुद्ध पानी, 10 μ एल प्लास्मिड (1 माइक्रोग्राम), 5 μ एल 10x बफर, 0.5 μL एक्सबीआई, और 0.5 μL की तरल माइक्रो-सेंट्र्रिज्यूज ट्यूब में जोड़ें। । 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
    6. एक 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन को चलाने और चरण 2.3.4 से टुकड़ा और जेल क्लीनअप सिस्टम किट के साथ चरण 2.3.5 से रैखिक सदिश शुद्ध करें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करना
    7. टुकड़ा और सी-ईंट सदिश को लपेटें: चरण 2.3.5 से चरण 2, 2.3 और 6 μL का टुकड़ा (200 एनजी) चरण 2.3.4 से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से 2 μL रैखिक सदिश (50 एनजी) जोड़ें। विज्ञापनडी 1 μL 10x टी 4 डीएनए ligase बफर और 1 μL टी 4 डीएनए ligase। 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  4. ई। कोलाई (डीएच 10 बी) के सक्षम कोशिकाओं में रासायनिक परिवर्तन के लिए चरण 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3, या 2.3.7 से 10 μL उत्पादों को जोड़ें।
  5. 5-एमएल तरल लूरिया-बर्टानी (एलबी) ट्यूब के लिए कई क्लोन उठाएं और एक प्रकार के बरतन (220 आरपीएम) पर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. प्लास्मिड तैयारी किट का उपयोग करके प्लाज्मिड निकालें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
  7. सेंगर अनुक्रमण 11 द्वारा सही क्लोन को पहचानें

3. सी-ईंट विधानसभा ( चित्रा 2 )

  1. सी-ईंट वेक्टर के साथ सीपीएफ 1 के पाचन
    1. 22.5 μL आरएनस मुक्त पानी, 4 μL 10x सीपीएफ 1 बफर, चरण 3 (1 माइक्रोग्राम) से प्लाज्मिड के 10 μL, आरआरआई के 0.5 μL, और 1 &# 181; एलपीडी 1 (5 सुक्ष्ममापी) में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में।
      नोट: सीपीएफ 1 को पिछले अध्ययन 4 में प्रोटोकॉल के बाद वाणिज्यिक या शुद्ध खरीदा जा सकता है।
    2. टी 1 और टी 2 साइटों में एक विदेशी डीएनए टुकड़ा डालने के लिए, सीआरआरएनए-टी 2 (10 माइक्रोन) के 1 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सेते। एक और 30 मिनट के लिए सीआरआरएनए-टी 1 (10 माइक्रोग्राम) और सीपीएफ 1 (5 माइक्रोग्राम) के एक डीडी 1 μL
      नोट: वैकल्पिक रूप से, टी 3 और टी 4 साइटों में एक विदेशी डीएनए टुकड़ा सम्मिलित करने के लिए, 1 μL की सीआरआरएनए-टी 3 (10 माइक्रोन) जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सेते। एक और 30 मिनट के लिए 1 μL क्रआरएनए-टी 4 (10 माइक्रोन) जोड़ें
    3. थर्मससेन्सिटिव क्षारीय फॉस्फेटस के 1 μL को जोड़ें और ट्यूब को एक और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने में रखें।
    4. एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन चलाने और एक जेल सफाई प्रणाली किट का उपयोग कर वेक्टर शुद्ध। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
    सीपीएफ 1 के साथ डीएनए टुकड़ा का पाचन
    1. 21.5 μL आरएनज मुक्त पानी, 4 μL का 10x सीपीएफ 1 बफर, चरण 2 (2 माइक्रोग्राम), 0.5 μL आरआरआई, और 2 μL सीपीएफ 1 (5 माइक्रोग्राम) से प्लाज्मिड के 10 μL 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें।
    2. टी 1 और टी 2 साइटों में एक विदेशी डीएनए टुकड़ा सम्मिलित करने के लिए, 1 एलएलआर सीआरआरएनए-टी 1 (10 माइक्रोग्राम) और 1 एलएल क्रआरएनए-टी 3 (10 माइक्रोन) जोड़ें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में सेते।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 2 एल के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 1 एलएलआर सीआरआरएनए-टी 2 (10 माइक्रोग्राम) और 1 एलएलआर क्रआरएनए-टी 4 (10 माइक्रोन) जोड़ें और पानी सेवन करें।
    3. एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन को चलाने और एक जेल सफाई प्रणाली किट का उपयोग कर टुकड़ा शुद्ध। नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  2. सी-ईंट विधानसभा और आगे सत्यापन
    1. विदेशी डीएनए टुकड़ा और सी-ईंट वेक्टर को दबाना: लाइनरिज्ड वेक्टर के 2 μL जोड़ें50 एनजी) चरण 3.1.4 से और डीएनए टुकड़ा (200 एनजी) की 6 μL चरण 3.2.3 से 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब तक। 1 μL 10x टी 4 डीएनए लेगेज बफर और 1 μL टी -4 डीएनए लेगेज जोड़ें। 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं नमूनों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें स्थिर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
    2. ई। कोलाई (डीएच 10 बी) - सक्षम कोशिकाओं में रासायनिक परिवर्तन के लिए ल्यूजी उत्पादों के 10 μL (चरण 3.3.1) जोड़ें।
    3. 5 एमएल तरल एलबी ट्यूब में कई क्लोन जोड़ें और 220 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर रातोंरात उबलना।
    4. प्लास्मिड तैयारी किट का उपयोग करके प्लाज्मिड निकालें; निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें
    5. सेंजर अनुक्रमण 11 द्वारा सही क्लोन की पहचान करें
  3. सी-ईंट विधानसभा का नया दौर कदम 3.3.4 से सही क्लोनों को एक नया सी-ईंट वेक्टर या डीएनए हिस्से के रूप में आगे चलने वाला सी-ईंट विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चरण 3.1-3.3 से समान प्रोटोकॉल के बाद।
    नोट: टी 2 'और टी 3' एसआईटीएस टी 2 और टी 3 साइटों ( चित्रा 1 ए ) के बैकअप के रूप में तैयार किए गए हैं। चरण 2.3.7 से प्राप्त प्लास्मिड के लिए, सी-ईंट मानक विधानसभा के लिए केवल टी 2 और टी 3 का उपयोग किया जा सकता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल ने तीन क्रोमोप्रोटीन केसेट (सीजेब्लूयूयू (बीबीए_के 9 5011), एफ़ोर रेड (बीबीए_के 5 9 202), और एमिल जीएफपी (बीबीए_के 5 9 5010)) की विधानसभा का प्रदर्शन किया। सबसे पहले, तीन उपरोक्त जीन और टर्मिनेटरों के कोडन दृश्यों को सी-ईंट मानक वेक्टर में अलग-अलग क्लोन किया गया था। लघु डीएनए भागों, प्रमोटर और टर्मिनेटर, सी-ईंट वेक्टर में पीसीआर प्रवर्धन के माध्यम से शुरू किए गए थे जिनमें 5 डीएनए वाले छोटे डीएनए भाग वाले टर्मिनल पर प्राइमरों का उपयोग किया गया था। इसके बाद स्वयं-बंधन विधि का पालन किया गया। तीन क्रोमोप्रोटीन-एन्कोडिंग दृश्यों को पहली बार संश्लेषित किया गया था और सीमलेस विधानसभा के माध्यम से सी-ईंट मानक वेक्टर में क्लोन किया गया था। प्राइमरों को पिछले अध्ययन 4 में वर्णित किया गया था।

उसके बाद, सीजीबीएलई, एफ़ोर्रेड, और एमिल जीएफपी अनुक्रम टर्मिनेटर और प्रमोटर अनुक्रमों के साथ समान प्रक्रिया में दिखाए गए थे"Xfig"> चित्रा 2 सही संरचनाएं ई। कोलाई में बदल दी गईं, सुंदर रंगों का प्रदर्शन ( चित्रा 3 ए )। इसके बाद, दो रंग-अभिव्यक्ति कैसेटों को और अधिक रंग बनाने के लिए सी-ईंट मानक के साथ इकट्ठा किया गया था ( यानी, एमिलजीएफपी प्लस एफ़ोर्रेड से लाल रंग, एमिलजीएफपी प्लस सीजेब्लू से हरे रंग का रंग, और एफ़ोर रेड प्लस सीजेबीएल्यू से हल्का बैंगनी रंग; 3 बी )

आकृति 1
चित्रा 1: सी-ईंट मानक इंटरफेस डीएनए अनुक्रम और सी-ईंट मानक वेक्टर। ( ए ) सी-ईंट मानक इंटरफ़ेस-टी 1, टी 2, टी 3, टी 4, टी 2, टी 3, का अनुक्रम- उसके संबंधित क्रआरएनए द्वारा पहचाना जा सकता है और फिर सीपीएफ 1 का उपयोग करके 5 'ओवरहेन्ग में पेश किया जा सकता है। T2 और T3 (या टी 2 'और टी 3') साइटों की दरार पूरक पर उत्पादन करता हैलटका हुआ है। आठ प्रतिबंध साइटों के साथ, सी-ईंट मानक आंशिक रूप से BioBrick और BglBrick के साथ संगत है। ( बी ) सी-ईंट मानक वेक्टर के लिए प्रतिबंध पाचन साइटों के साथ प्लाज्मिड नक्शा। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: सी-ईंट मानक में डीएनए विधानसभा के लिए कार्यप्रवाह। सीपीएफ 1-डाइजस्टेड टी 2 और टी 3 लक्ष्य साइटें क्रमशः "जीजीएटीसी" और "जीएटीसीसी" के पूरक एकत्रीय छोर देती हैं, जो एक छोटी "जीजीएटीसीसी" निशान बनाने के लिए लगी हुई हो सकती हैं। विस्तृत प्रक्रियाएं पाठ ("सी-ईंट असेंबली") में चरण 3 में पाई जा सकती हैं। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखें

चित्र तीन
चित्रा 3: ई-कोलाई हार्बरिंग कणों द्वारा उत्पादित रंगीन बैक्टीरियल पिगमेंट सी-ईंट स्टैंडर्ड में इकट्ठे हुए हैं। ( ए ) तीन क्रोमोप्रोटीन ई। कोली में एक प्लेट पर उगने में व्यक्त किए गए थे। कोई क्रोमोप्रोटीन (नकारात्मक नियंत्रण) वाला बैक्टीरिया 4 था प्लेट पर दिखाया गया है ( बी ) ईई कोलाई में तीन क्रोमोप्रोटीन और तीन इकट्ठे हुए दोहरे क्रोमोप्रोटीन तरल एलबी माध्यम में उगने वाले कोली में दिखाए गए थे। 1 से 6 तक, एन्फोरेड (1), एमिल जीएफपी (2), सीजेब्लूयूयू (3), एमिल जीएफपी प्लस एफ़ोर्रेड (4), एमिल जीएफपी प्लस सीजेब्लूयूयू (5), और एफ़ोर रेड प्लस सीजेब्लूयूयू (6) का निर्माण किया गया। एक एकल प्लेट या एक एकल माइक्रोप्रोक्सीफ्यूज ट्यूब में रंगीन जीवाणु एक एकल अनुक्रम-सत्यापित क्लोन से सुसंस्कृत थे। Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

नाम अनुक्रम
T7-एफ GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-आर gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-आर ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-आर ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-आर ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-आर ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए क्रआरएनए ट्रांसक्रिप्शन टेम्पलेट्स की तैयारी के लिए ओलीगोस। टी 7-एफ शीर्ष-किनारा ओलिगोनक्लियोटाइड था, और अन्य नीचे-तराजू वाले ओलिगोनक्लियोटाइड्स थे। अनुक्रम में लोअरकेस कुर्सियां ​​क्रआरएनए में गाइड अनुक्रम में लिपटेगी।

नाम आरएनए अनुक्रम (5'-3 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-टी 2 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3 ' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

सारणी 2: इस अध्ययन में उपयोग किए गए क्रआरएनए श्रृंखलाएं सीआरआरएनए को इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से पाठ में "चरण 1" ("सीआरआरएनए की तैयारी") में बनाया गया था।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल डीएनए विधानसभा मानक सी-ईंट के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम सी-ईंट मानक वेक्टर के रैखरीकरण है; सदिश का अधूरा तराजू सफलता की दर को गंभीरता से प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि सीपीएफ 1 मुख्य रूप से "18-23" दरार पैटर्न में लक्ष्य डीएनए दृश्यों को साफ करता है, दो ठिकानों के पास गलत दरार भी 4 पाया जाता है, जो डीएनए विधानसभा के बाद एक छोटी संख्या में उत्परिवर्तन का कारण बन सकता है। इसलिए, इकट्ठे निर्माण को सत्यापित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण की आवश्यकता है।

सी-ईंट विधानसभा की क्षमता परंपरागत प्रतिबंध एंजाइम और लैगींग विधियों से कम है, जिसे पिछले अध्ययन 4 में वर्णित किया गया है। विधानसभा दक्षता को प्रभावित करने वाला मुख्य कारण सीपीएफ 1 की गलत दरारें हो सकता है। भविष्य में, दरार सटीकता में सुधार मानक के लिए बहुत उपयोगी हो सकता हैएन डी वर्तमान में पता लगाया जा रहा है।

सी-ईंट भी आंशिक रूप से BglBrick और BioBrick मानकों के साथ संगत है। उदाहरण के लिए, BglBrick भागों BglII और BamHI के साथ काटा जा सकता है और फिर एक सी-ईंट मानक वेक्टर की BamHI साइट में डाला जा सकता है, जो सी-ईंट पार्ट उत्पन्न करता है। हालांकि, BglBrick भाग की अंदरूनी दिशा सत्यापित की जानी चाहिए, और विधानसभा के बाद एक "जीजीएटीसीटी" निशान होगा। जब एक सी-ईंट डीएनए भाग को बायोबरिक हिस्से से प्राप्त किया जाता है ( यानी, एक्सबाआई और स्पीआई पाचन के साथ), दोनों टी 2 और टी 3 साइटें नष्ट हो जाएंगी, और दो बैकअप सीपीएफ 1 लक्ष्य अनुक्रम (टी 2 'और टी 3') का इस्तेमाल किया जा सकता है।

चूंकि सीपीएफ 1 दरार एसजीआरएनए की आवश्यकता होती है, जो आरएनसी के प्रति बेहद संवेदनशील है, सभी सामग्रियां आरएनज़ मुक्त होनी चाहिए। वर्तमान में, सभी सी-ईंट मानक वैक्टर, आरएनज मुक्त सीपीएफ 1 नाभिक और सीआरआरएनए का व्यावसायिक रूप से 12 आदेश दिया जा सकता है। इसलिए, सी-ईंट की प्रक्रिया वास्तव में जैव के रूप में सरल हैईंट मानक

पिछले कुछ वर्षों में, कई उपयोगी डीएनए विधानसभा विधियों को विकसित किया गया है और व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें गोल्डन गेट विधानसभा 13 , गिब्सन विधानसभा 14 और 15 अन्य शामिल हैं। हालांकि, डीएनए विधानसभा मानकों में लागत प्रभावी, विश्वसनीय, उच्च-थ्रुपुट और स्वत: असेंबल प्रतिक्रियाएं प्रदान करने की क्षमता है, मानकों ने नए डिजाइन किए या फिर से डिज़ाइन किए गए जीन, आनुवंशिक सर्किट और पथ 15 के निर्माण और परीक्षण की सुविधा दे सकते हैं । 16 , 17 , विशेष रूप से सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में वर्तमान में प्रकाशित डीएनए असेंबली मानकों में से, सी-ईंट मानक में स्पष्ट लाभ और नुकसान 4 ( यानी, बाध्यता दक्षता) दोनों हैं। यदि लाइजी दक्षता में सुधार हुआ है, तो भविष्य में मानक को व्यापक रूप से अपनाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

सी-ईंट मानक के विकास के दौरान हम अपनी तकनीकी सहायता के लिए शंघाई टैलो बायोटेक का धन्यवाद करते हैं। यह काम चीनी अकेडमी ऑफ साइंसेज (ग्रांट नं। XDB19040200) के सामरिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

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References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
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  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
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  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

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आनुवांशिकी अंक 124 सिंथेटिक जीव विज्ञान सीआरआईएसपीआर सीपीएफ 1 सी-ईंट चिपचिपा समाप्त डीएनए विधानसभा, विधानसभा मानक
सी-ईंट डीएनए मानक विधानसभा सीपीएफ 1 के लिए प्रोटोकॉल
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Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

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