Summary
CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.
Abstract
CRISPR ile ilişkili protein Cpf1 çift sarmallı DNA'yı CRISPR RNA'nın (crRNA) rehberliğinde parçalayıp yapışkan uçlar üretir. Bu özellikten dolayı Cpf1, C-Brick adı verilen ve uzun tanıma yerleri ve kısa izlerin avantajına sahip bir DNA montaj standardının oluşturulması için kullanılmıştır. Standart bir C-Tuğla vektöründe, dört Cpf1 tanıma bölgesi vardır - ön ek (T1 ve T2 siteleri) ve son ek (T3 ve T4 bölgeleri) - biyolojik DNA parçalarını çevreleyen. T2 ve T3 bölgelerinin bölünmesi tamamlayıcı yapışkan uçlar üretir ve bu da T2 ve T3 bölgeleriyle DNA parçalarının birleştirilmesini sağlar. Bu arada, montajdan sonra parçalar arasında kısa bir "GGATCC" skarı meydana gelir. Yeni oluşturulan plazmid dört kez Cpf1 bölünme yerini bir kez daha içerdiğinden yöntem, DNA parçalarının yinelenen montajını sağlar ve bu da, BioBrick ve BglBrick standartlarına benzer. DNA parçalarını bir araya getirmek için C-Brick standardının kullanımını özetleyen bir prosedürBurada açıklanmaktadır. C-Brick standardı, bilim adamları, lisansüstü öğrenciler ve lisans öğrencileri ve hatta amatörler tarafından yaygın bir şekilde kullanılabilir.
Introduction
DNA biyolojik parçalarının standardizasyonu sentetik biyolojinin gelişimi için önemlidir 1 . Bir DNA montaj prosedürünün geliştirilmesi, geçici test tasarımlarının yerini alabilir ve genetik bileşenlerin daha büyük sistemlere montajı sırasında ortaya çıkan beklenmedik sonuçların çoğunu kaldırabilir. BioBrick standardı (BBF RFC 10), önerilen en erken DNA montaj standartlarından biriydi. Önek dizisini (EcoRI ve Xbal kesim bölgeleri içeren) ve son ekleme dizisini (SpeI ve PstI kesme bölgelerini içeren) 2 , 3 kullanır . XbaI ve SpeI'nin birbirine tamamlayıcı uçları olduğu için, XbaI ve SpeI ile kesilen BioBrick DNA parçaları, tekrar tekrar montaj için yeni bir BioBrick üretecek şekilde birleştirilebilir.
Bazı kusurlar, BioBrick standardı 4 kullanılarak tanımlanmıştır. Örneğin, 8 bp'lik bir skar üretirFüzyon proteinlerinin inşasına izin vermeyen DNA parçaları arasında. Ayrıca, yukarıda sözü edilen dört 6-bp kısıtlama sahası türü DNA parçalardan çıkarılmalıdır; bu çok rahatsız edicidir. İlk problemi çözmek için BglBrick standardı kuruldu 5 . Gly-Ser üreten ve çoklu proteinlerin veya protein alanlarının kaynaşmasına izin veren 6 bp "GGATCT" skarını oluşturur. IBrick, ikinci problemle başa çıkmak için geliştirildi 6 . Uzun DNA sekanslarını tanıyan homojenleştirme endonükleazları (HE) kullanır. HE tanıma siteleri nadiren doğal DNA dizilerinde mevcut olduğundan, iBrick standardı, DNA dizilerini değiştirmeden iBrick parçalarının doğrudan yapımı için kullanılabilir. Bununla birlikte, iBrick standardı DNA parçaları arasında 21 bp'lik bir skar bırakır ve bu da onun hoşnutsuzluğunun nedeni olabilir.
Son yıllarda kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) sistemi hızla gelişti 7 , 8 . CRISPR ile ilişkili (Cas) proteinler arasında, Streptococcus pyogenes'ten Cas9 endonuclease şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır . Çoğunlukla künt uçları olan çift sarmal DNA kopmaları (DSB'ler) getirir 9 .
2015'te Zhang ve arkadaşları, Cpf1'i ( Prevotella ve Francisella 1'den CRISPR) ilk kez karakterize etti . Sınıf 2 tip V CRISPR-Cas sistemine aittir ve bir CRISRP RNA (crRNA) rehberli endonükleaz 10'dur . Cas9'un aksine, Cpf1, 4 veya 5 nt 5 'çıkıntı 10 içeren bir DSB'yi sunar. Bu özelliğe dayanarak Cpf1, bir DNA montaj standardı olan C-Brick 4'ü geliştirmek için kullanıldı. Bir C-Tuğla standart vektöründe, ön ek T1 / T2'nin ve bitişik T3 / T4'ün dört Cpf1 hedef bölgesi biyolojik kısımlara kenetlenir; Bu, BioBrick standardına benzer. T2 ve T3 bölmelerinin bölünmesi pTamamlayıcı yapışkan uçları geliştirir, parçaların arasına bir "GGATCC" yara üretirken DNA bölümlerinin yinelemeli montajını gerçekleştirmek mümkündür. Özellikle, C-Brick standardının iki ana avantajı vardır: uzun hedef sekansları tanımak ve kısa izleri bırakmak. C-Brick tarafından üretilen 6 bp'lik "GGATCC" skar, füzyon proteinlerinin oluşturulmasına izin veren Gly-Seriyi kodlar. Ayrıca, C-Brick standardı da kısmen BglBrick ve BioBrick standartlarıyla uyumludur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. crRNA'nın hazırlanması
- CrRNA şablonlarının hazırlanması
- Tekli oligonükleotidleri ( Tablo 1 ) RNaz içermeyen suda 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
- 22.5 uL üst şeritli oligonükleotid ( Tablo 1'de T7-F), 22.5 uL alt-şeritli oligonükleotid ( Tablo 1 ) ve 5 uL 10x tavlama tamponu 0.2 mL PCR tüpüne ilave edin. Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
NOT: Altı farklı alt zincirli oligonükleotidler Tablo 1'de gösterilmiştir, bunların her biri ayrı ayrı üst iplikçikli T7-F ile eşleştirilmelidir. Tablo 1'deki küçük harfler, crRNA'nın rehber dizisine transkribe edilecek sekansı temsil etmektedir. 10x Taq PCR tamponu, 10x tavlama tamponunun yerine kullanılabilir. - PCR tüpünü bir termostatöre yerleştirin.
- Tavlama programını çalıştırın: İlk denatürasyon için 95 ° C'de5 dakika sonra 95-20 ° C arasında bir cooldown, termosiklörde dakikada 1 ° C düşüş.
NOT: Adımları derhal adım 1.2.1 için kullanın.
- CrRNA'nın transkripsiyonu ve saflaştırılması
- RNaz içermeyen suya 38 μL, adım 1.1.4'deki şablondan 8 μL, 5x T7 transkripsiyon tamponu 20 uL, NTP karışımından (10 uM) 20 μL, rekombinant RNaz inhibitöründen (RRI) 4 μL ve 10 μM ML T7 RNA polimeraz'dan 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Toplam hacmin 100 μL olduğundan emin olun.
- Mikrosantrifüj tüpünü bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat boyunca) 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
- Transkribe RNA'yı arındırmak için bir RNA temizleme ve konsantrasyon kiti kullanın; Üreticinin protokolünü izleyin.
- RNA'ları UV-Vis spektrofotometreleri ile ölçün ve RNA'yı 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. Numuneleri derhal kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
NOT: crRNA dizisiS Tablo 2'de listelenmiştir .
2. C-Tuğla Parçalarının Yapımı ( yani, Biyolojik Parçaların C-Tuğla Standart Vektörüne Yerleştirilmesi)
NOT: Bu adımın üç alt aşaması vardır. Kısa biyolojik kısımlar ( örn. Promoterler ve sonlandırıcılar) için biyolojik parçaları C-Brick standart vektör 4'e eklemek için doğrudan PCR yöntemini kullanmak en iyisidir. Bütün vektör sekansı ek veride gösterilir ve önek ve son ek sırası Şekil 1'de gösterilmiştir (aşama 2.1, aşağıda). PCR ile kolaylıkla elde edilebilen biyolojik kısımlar için ( örn., Genomik DNA şablonları, plazmidler veya yeni sentezlenmiş DNA dizileri), biyolojik parçaları bir C-Brick standart vektörüne eklemek için kesintisiz montaj yöntemini kullanmak en iyisidir (Aşama 2.2, aşağıda). BioBrick ve BglBrick standartlarından edinilen parçalar için sınırlamaEnzim aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon biyolojik parçaları bir C-Brick standart vektörüne yerleştirmek için kullanılabilir (aşama 2.3, aşağıda).
- Doğrudan PCR amplifikasyonu ile yapı
- PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
NOT: Oligonükleotitin 5'-ucu, DNA bölümünün dizisini içerir ve oligonükleotitin 3 'ucu, vektör dizisini ( yani, ileri bandın 3' ucunda "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" ve "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Ters yörede). Oligonükleotitin 5'-ucunda çıkıntı veya ~ 20 bp çıkıntı tasarlanamaz. Spesifik örnekler daha önceki bir çalışmada bulunabilir 4 . - 10 uM'lik bir konsantrasyona kadar ultra saf su içindeki tek tek oligonükleotitleri yeniden süspanse edin.
- 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde buz üzerinde PCR reaksiyonları oluşturun: 18 μL ultra saf su ekleyin, 25 μL 2x PCR tamponu, adım 2.1.2'den ileri ve geri primerlerden her biri 2.5 uL (10 uM), şablon olarak 0.5 uL C-Brick standart vektörü (50 ng) ve 0.5 uL'lik bir şablon olarak dNTP'lerin (10 uM) Yüksek doğrulukta DNA polimerazın Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
- Tüpü doğrudan bir termosiklleye yerleştirin ve termosiklör programını çalıştırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- Thermocycler programı: 98 ° C'de 3 dakika süreyle bir devir; 98 ° C'de 10 saniye, 55 ° C'de 20 saniye ve 72 ° C'de 2 dakika için otuz döngü; Ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca bir döngü. Numuneyi 16 ° C'de tutun.
- Adım 2.1.4'ten 9 μL karışım 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ilave edilir.
- 1 uL DpnI ekleyin ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat inkübe edin.
NOT: Primerler üst üste binen sekanslara sahip değillerse 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz (PNK) ve 0.5 μL T4 DNA ligaz ekleyin ve1 saat boyunca 22 ° C su banyosu. Aksi takdirde, primerler ~ 20 nt örtüşen diziyi içeriyorsa, doğrudan DpnI ile işleme tabi tutulan ürünleri E. coli (DH10B) -kompetent hücrelere dönüştürün (basamak 2.4). Doğrusallaştırılmış PCR ürünü konakçıdaki rekombinasyon sistemi ile dairesize hale getirilecektir. - Numuneleri hemen kullanın veya -20 ° C'de saklayın.
- PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
- Dikişsiz montaj ile inşaat
- PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
NOT: Oligonükleotitin 3'-ucu, DNA bölümünün terminal dizisini içerir ve oligonükleotitin 5'-ucu, doğrusallaştırılmış C-Brick standart vektör dizisinin terminalini içerir ( yani, 5 'için standart olarak kullanılan "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" İleriye doğru ipliğin ucunu ve "CGAGCTAGAGACTAGTGGCCT" ters iplikçikinin 5'-ucu için). Spesifik örnekler daha önceki bir çalışmada bulunabilir 4 . - Bireyi yeniden askıya alUltra saf sularda 10 uM konsantrasyona kadar ual oligonükleotitler.
- 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde buz üzerinde PCR reaksiyonlarını ayarlayın: ultra saf su, 25 μL 2x PCR tamponu, 1 μL dNTPs (10 μM), 2.5 μL ileri ve geri primerlerin her biri (10 μM ), Adım 2.2.2, 0.5 uL şablon (20-500 ng) ve 0.5 uL yüksek-sadakat DNA polimeraz'dan hazırlandı. Toplam hacmin 50 μL olduğundan emin olun.
- Tüpü doğrudan termosiklleye yerleştirin ve termosiklör programını çalıştırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Thermocycler programını şu şekilde ayarlayın: 98 ° C'de 3 dakika süreyle bir devir; 98 ° C'de 10 saniye, 55 ° C'de 20 saniye sonra (primerin tavlama sıcaklığına göre) 30 döngü ve 72 ° C'de 1 dakika (biyolojik parçaların uzunluğuna göre) 30 döngü; Ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca bir döngü. Numuneyi 16 ° C'de tutun. - Bir PCR temizleme sistemi kullanarak PCR ürününü arıtınTem kiti; Üreticinin protokolünü izleyin.
- C-Brick standart vektörünü BamHI ile sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (1 μg), 5 μL 10x tampon ve 1 μL BamHI'yi mikrosantrifüj tüpüne ilave edin. Su banyosunda 37 ° C'de 2 saate kadar inkübe edin.
- Bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak yukarıdaki ürünü arındırın; Üreticinin protokolünü izleyin.
- Adım 2.2.7'den 2 mcL doğrusallaştırılmış vektör (50 ng), adım 2.2.4'ten 5 uL parça (200 ng), 5x kesintisiz montaj tamponu 2 mcL ve kesintisiz montaj kitinden 1 μL kesintisiz montaj enzimi ekleyin. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne uygulayın. Toplam hacmin 10 mcL olduğunu kontrol edin.
- Bunu 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- PCR amplifikasyonu için oligonükleotitler dizayn ve sipariş etmek.
- Restriksiyon enzim aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon yoluyla yapı.
NOT: BioBrick (basamak 2.3.4-2.3.7) ve BglBrick (basamak 2.3.1-2.3.3) standartlarından elde edilen parçalar için kısıtlama enzimi aracılı sindirim ve T4 DNA ligaz aracılı ligasyon, Biyolojik parçaları bir C-Tuğla standart vektörüne dönüştürür.- BamHI ve BglII ile BglBrick standart parçalarını sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μl plazmid (2 μg), 5 μL 10x tampon 3, 0.5 μL BamHI ve 0.5 μL BglII'yi mikrosantrifüj tüpüne ilave edin. 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
- % 1 agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak fragmanı arındırın.
- Parçayı ve C-Brick standart vektörünü ligate edin: Adım 2.1.12'den doğrusallaştırılmış vektörün (50 ng) 2 mL ve adım 2.3.3'ten 6 uL parça (200 ng) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. 1 uL 10 x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya buz özütüE -20 ° C'de saklayın.
- XbaI ve SpeI ile BioBrick standart parçalarını sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (2 μg), 5 μL 10x tampon, 0.5 μL Xbal ve 0.5 μL SpeI mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
- C-Brick standart vektörünü XbaI ve SpeI ile sindirin: 34 μL ultra saf su, 10 μL plazmid (1 μg), 5 μL 10x tampon, 0.5 μL Xbal ve 0.5 μL SpeI mikrosantrifüj tüpüne ekleyin . 37 ° C su banyosunda 2 saat inkübe edin.
- % 1 agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve safha 2.3.4 adımından ve adım 2.5.5'deki doğrusallaştırılmış vektörü jel temizleme sistemi kitiyle saflaştırın; Üreticinin protokolünü izleyerek.
- Parçayı ve C-Brick vektörünü ligate edin: Adım 2.3.5'den 2 mcL doğrusallaştırılmış vektör (50 ng) ve adım 2.3.4'ten 6 uL parça (200 ng) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. ilanD 1 uL 10x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 uL T4 DNA ligazı. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- E. coli'nin yetkili hücrelerine (DH10B) kimyasal transformasyon için adım 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 veya 2.3.7'den 10 uL ürün ekleyin.
- Birkaç klonu 5 mL sıvı Luria-Bertani (LB) tüpü içine alın ve gece boyunca çalkalayıcıda (220 rpm) 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir plazmid hazırlama kiti kullanarak plazmid ayıklayın; Üreticinin protokolünü izleyin.
- Sanger dizilemesi ile doğru klonları tanımlayın 11 .
3. C-Tuğla Montajı ( Şekil 2 )
- C-Brick vektörünün Cpf1 ile sindirimi
- 22.5 uL RNaz içermeyen su, 4 μL 10x Cpf1 tamponu, adım 2.6'dan (1 μg) plazmidden 10 μL, RRI'nin 0.5 μL'si ve 1 μl# 181; L Cpfl'den (5 uM) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne.
NOT: Cpf1 ticari olarak satın alınabilir veya önceki bir çalışmada protokolden sonra saflaştırılabilir 4 . - T1 ve T2 bölgelerine yabancı bir DNA parçası eklemek için, 1 μL crRNA-T2 (10 uM) ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Bir dd 1 μL crRNA-T1 (10 uM) ve Cpfl (5 uM) 30 dakika daha.
NOT: Alternatif olarak, T3 ve T4 bölgelerine yabancı bir DNA parçası eklemek için 1 μL crRNA-T3 (10 uM) ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Başka bir 30 dakika boyunca 1 μL crRNA-T4 (10 uM) ekleyin. - 1 μL termal duyarlı alkalin fosfataz ekleyin ve tüp 37 ° C su banyosunda 1 saat daha inkübe edin.
- Bir agaroz jel elektroforezi çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak vektörü arındırın. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- RNase içermeyen 21.5 μL su, 4 μL 10x Cpf1 tamponu, adım 2.6'dan (2 μg) plazmid 10 μL, RRI 0.5 μL ve Cpf1'den (5 μM) 2 mL Tl 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
- T1 ve T2 bölgeleri içine yabancı bir DNA parçası eklemek için, 1 μL crRNA-T1 (10 μM) ve 1 μL crRNA-T3 (10 μM) ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat su banyosunda inkübe edin.
NOT: Alternatif olarak, 1 μL crRNA-T2 (10 μM) ve 1 μL crRNA-T4 (10 μM) ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat su banyosunda inkübe edin. - Bir agaroz jel elektroforez çalıştırın ve bir jel temizleme sistemi kiti kullanarak parça saflaştırmak. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- 22.5 uL RNaz içermeyen su, 4 μL 10x Cpf1 tamponu, adım 2.6'dan (1 μg) plazmidden 10 μL, RRI'nin 0.5 μL'si ve 1 μl# 181; L Cpfl'den (5 uM) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne.
- C-Tuğla montajı ve ileri doğrulama
- Yabancı DNA parçasını ve C-Brick vektörünü ligatlayın: 2 μL doğrusal vektörü ekleyin (50 ng) adım 3.1.4'ten ve 6 mcL DNA fragmanı (200 ng) adım 3.2.3'ten 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarılmıştır. 1 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu ve 1 μL T4 DNA ligaz ekleyin. 22 ° C'de 2 saat inkübe edin. Numuneleri derhal kullanın veya dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
- E. coli (DH10B) -erkentent hücrelere kimyasal transformasyon için 10 μL ligasyon ürünlerini (adım 3.3.1) ekleyin.
- 5 mL'lik bir sıvı LB tüpüne birkaç klon ekleyin ve gece boyunca 220 rpm ve 37 ° C'de çalkalayıcıda inkübe edin.
- Bir plazmid hazırlama kiti kullanarak plazmid ayıklayın; Üreticinin protokolünü izleyin.
- Sanger dizilemesi ile doğru klonları tanımlayın 11 .
- C-Tuğla montajının yeni turunu yapın. Adım 3.3.4'teki doğru klonlar, adım 3.1-3.3'teki aynı protokol izlenerek, tekrar tekrar C-Brick montajı için yeni bir C-Tuğla vektörü veya DNA parçası olarak kullanılabilir.
NOT: T2 've T3'ünItes, T2 ve T3 bölgelerinin yedeği olarak tasarlanmıştır ( Şekil 1a ). Adım 2.3.7'den elde edilen plasmidler için, sadece C-Tuğla standart montajı için T2 've T3' kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, üç kromoprotein kasetinin (cjBlue (BBa_K592011), red (BBa_K592012) ve amilGFP'nin (BBa_K592010) montajını gösterdi. Birincisi, yukarıda bahsedilen üç genin ve sonlandırıcıların kodlama dizileri ayrı ayrı bir C-Brick standart vektörüne klonlanmıştır. Kısa DNA kısımları, promotör ve terminatör, 5 'terminalindeki kısa DNA kısımlarını içeren primerler kullanılarak PCR amplifikasyonuyla C-Brick vektörüne sokuldu. Bunu self-ligasyon yöntemi izledi. Üç kromoprotein kodlayan sekans ilk olarak yeni sentezlenmiş ve daha sonra kesintisiz montaj yoluyla C-Brick standart vektörüne klonlanmıştır. Astarlar önceki bir çalışmada 4 açıklanmıştır.
Bundan sonra, cjBlue, eforRed ve amilGFP sekansları, Şekil 1'de gösterilen aynı prosedürde terminatör ve promoter sekansları ile bağlandı."Xfig"> Şekil 2. Doğru yapılar E. coli'ye dönüştürülerek güzel renkler gösterildi ( Şekil 3a ). Daha sonra, iki renk ifade kaseti, daha fazla renk oluşturmak için C-Brick standardıyla birleştirildi ( örn., AmilGFP artı efor'dan kırmızı renk, amilGFP'den artı cjBlue'dan yeşil renk ve eforRed artı cjBlue'dan açık mor renk; 3b ).
Şekil 1: C-Tuğla Standart Arayüz DNA Sırası ve C-Tuğla Standart Vektör. ( A ) C-tuğla standart arayüzü -T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-dizisi, karşılık gelen crRNA tarafından tanınabilir ve sonra Cpfl kullanılarak bir 5' çıkıntıya sokulabilir. T2 ve T3 (veya T2 've T3') bölmelerinin bölünmesi tamamlayıcıasar. Tasarlanan sekiz kısıtlama sitesi ile C-Brick standardı kısmen BioBrick ve BglBrick ile uyumludur. ( B ) Restriksiyon sindirim bölgeleri olan C-Brick standart vektörü için plazmid haritası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: C-Tuğla Standartında DNA Meclisi için İş Akışı. Cpf1 ile sindirilmiş T2 ve T3 hedef siteleri sırasıyla "GGATC" ve "GATCC" nin tamamlayıcı kohezif uçları üretir ve kısa bir "GGATCC" skar üretmek için bağlanabilir. Ayrıntılı prosedürler, metindeki 3. adımda bulunabilir ("C-Tuğla montajı"). Lütfen buraya tıklayın Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntüleyin.
Şekil 3: C-Tuğla Standardında Birleştirilmiş E. coli Gölet Oluşturucuları Tarafından Üretilen Renkli Bakteri Pigmentleri. ( A ) Bir plakta yetiştirilen E. coli'de üç kromoprotein eksprese edildi. Kromoprotein içermeyen bakteriler (negatif kontrol) 4. plakada gösterilir. ( B ) Sıvı LB ortamında yetiştirilen E. coli'de üç kromoprotein ve üç monte edilmiş çift kromoprotein eksprese edildi. 1'den 6'ya kadar olan yapılar, Red (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP artı red (4), amilGFP artı cjBlue (5) ve eforRed artı cjBlue (6) ifade etti. Tek bir plakada veya tek bir mikrosantrifüj tüpündeki renkli bakteri, tek bir sekans doğrulama klonundan kültürlendi. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
| isim | sıra | ||
| T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
| T7-T1-R | gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7 T2'-R | ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7 T2 R | ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7, T3-R | ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7 T3'-R | ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T4-R | ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
Tablo 1: Bu Çalışmada Kullanılan crRNA Transkripsiyon Şablonlarının Hazırlanması İçin Oligolar. T7-F en üstteki oligonükleotid ve diğerleri alttaki oligonükleotidlerdir. Dizideki küçük bazlar, crRNA'daki rehber sekansına kopyalanacaktır.
| isimler | RNA dizileri (5'-3 ') | ||
| crRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
| crRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
| crRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
| crRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA | ||
| crRNA-T2' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
| crRNA-T3' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG | ||
Tablo 2: Bu Çalışmada Kullanılan crRNA Dizileri. Metin içinde, crRNA'lar 1. adımda in vitro transkripsiyon yoluyla üretildi ("cDNA'nın hazırlanması").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol DNA montaj standardı C-Brick için bir prosedürü açıklamaktadır. Bu protokolün en önemli adımı, C-Brick standart vektörünün doğrusallaştırılmasıdır; Vektörün tamamlanmamış bölünmesi başarı oranını ciddi şekilde etkileyebilir. Buna ek olarak, Cpf1 esas olarak "18-23" bölünme paterninde hedef DNA sekanslarını parçalasa da, DNA toplanmasından sonra az sayıda mutasyona neden olabilecek iki baz yakınındaki yanlişlı bölünme 4 de tespit edilmiştir4. Bu nedenle, Sanger dizilemesi, birleştirilen yapıyı doğrulamak için gereklidir.
C-Brick montajının etkinliği önceki bir çalışmada 4 tanımlanan geleneksel restriksiyon enzim ve ligasyon yöntemlerinden daha düşüktür 4 . Montaj verimliliğini etkileyen ana neden, Cpf1'in yanlış dağılım karakteristikleri olabilir. Gelecekte, bölünme doğrulukundaki iyileştirmeler, standart a veNd şu anda araştırılmaktadır.
C-Brick, kısmen BglBrick ve BioBrick standartlarıyla da uyumludur. Örneğin, BglBrick parçaları BglII ve BamHI ile kesilebilir ve sonra bir C-Tuğla parçası üreten bir C-Brick standart vektörünün BamHI alanına sokulabilir. Bununla birlikte, BglBrick parçasının takılma yönü doğrulanmalı ve montajdan sonra "GGATCT" bir yara olacaktır. Bir C-Brick DNA kısmı bir BioBrick parçasından ( yani, Xbal ve SpeI sindirimiyle) elde edildiğinde, hem T2 hem de T3 bölgeleri yok edilecek ve iki yedek Cpf1 hedef sekansı (T2 've T3') kullanılabilir.
Cpf1 bölünmesi, RNaz'a aşırı duyarlı sgRNA gerektirdiğinden, tüm materyallerin RNaz içermemesi gerekir. Halen, tüm C-Brick standart vektörleri, RNaz içermeyen Cpf1 nükleazları ve crRNA'lar ticari olarak sipariş edilebilir 12 . Dolayısıyla, C-Brick için prosedürler aslında Bio'nun işlemleri kadar basittirTuğla standart.
Geçtiğimiz birkaç yılda, Golden Gate Meclisi 13 , Gibson Meclisi 14 ve diğerleri de dahil olmak üzere, birkaç faydalı DNA montaj yöntemi geliştirildi ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, DNA montaj standartları maliyet-etkin, güvenilir, yüksek verim ve otomatik montaj reaksiyonları 5 sağlayacak potansiyele sahip olduğundan, standartlar, yeni tasarlanmış veya yeniden tasarlanmış genlerin, genetik devrelerin ve yolların yapımını ve test edilmesini kolaylaştırabilir 15 , 16 , 17 , özellikle sentetik biyoloji alanında. Halihazırda yayınlanan DNA montaj standartları arasında, C-Brick standardının hem belirgin avantajları hem de dezavantajları 4 bulunmaktadır ( yani ligasyon verimliliği). Ligasyon verimliliği geliştirilirse, standart ileride yaygın olarak kabul edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
C-Tuğla standardının geliştirilmesi sırasında teknik yardımları için Shanghai Tolo Biotech'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisinin Stratejik Öncelik Araştırma Programından hibelerle desteklenmiştir (Grund No XDB19040200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
