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Genetics

Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

La proteina Cpf1 associata a CRISPR può essere guidata da un CRISPR RNA (crRNA) appositamente progettato per separare il DNA a doppio filamento nei siti desiderati, generando estremità appiccicose. Sulla base di questa caratteristica, è stato stabilito un standard di assemblaggio del DNA (C-Brick) e qui viene descritto un protocollo che descrive il suo utilizzo.

Abstract

La proteina Cpf1 associata a CRISPR fila il DNA a doppio filamento sotto la guida di CRISPR RNA (crRNA), generando estremità appiccicose. A causa di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per la creazione di un sistema di assemblaggio del DNA chiamato C-Brick, che ha il vantaggio di lunghi siti di riconoscimento e brevi cicatrici. Su un vettore standard C-Brick, ci sono quattro siti di riconoscimento Cpf1 - il prefisso (siti T1 e T2) e il suffisso (siti T3 e T4) - parti del DNA biologico flanking. La scissione dei siti T2 e T3 produce estremità appiccicose complementari, che consentono l'assemblaggio di parti del DNA con i siti T2 e T3. Nel frattempo, una breve cicatrice "GGATCC" viene generata tra le parti dopo l'assemblaggio. Poichè il plasmide appena costituito contiene ancora i quattro siti di scissione di Cpf1, il metodo consente l'assemblaggio iterativo di parti del DNA, che è simile a quello di standard BioBrick e BglBrick. Una procedura che descrive l'utilizzo dello standard C-Brick per assemblare parti del DNAÈ descritto qui. Lo standard C-Brick può essere ampiamente usato da scienziati, laureati e studenti universitari, e anche dilettanti.

Introduction

La standardizzazione delle parti biologiche del DNA è importante per lo sviluppo della biologia sintetica 1 . Lo sviluppo di una procedura di assemblaggio del DNA può sostituire disegni sperimentali ad hoc e rimuovere molti dei risultati imprevisti che si verificano durante l'assemblaggio di componenti genetici in sistemi più grandi. Lo standard BioBrick (BBF RFC 10) è stato uno dei più antichi standard di assemblaggio del DNA proposto. Utilizza la sequenza di prefisso (contenente i siti di taglio EcoRI e XbaI) e la sequenza di suffisso (contenente siti di taglio SpeI e PstI) 2 , 3 . Poiché XbaI e SpeI hanno finiti complementari coesivi, le parti del DNA di BioBrick che vengono tagliate con XbaI e SpeI possono essere unite insieme, generando un nuovo BioBrick per un ulteriore assemblaggio iterativo.

Alcuni difetti sono stati identificati con l'uso dello standard BioBrick 4 . Ad esempio, produce una cicatrice da 8 bpTra le parti del DNA, che non consentono la costruzione di proteine ​​in fusione. Inoltre, i quattro tipi di restrizione a 6 bp di cui sopra devono essere rimossi dalle parti del DNA, che è molto scomodo. Lo standard BglBrick è stato creato per risolvere il primo problema 5 . Crea una cicatrice a 6 bp "GGATCT", che produce Gly-Ser e consente la fusione di più proteine ​​o domini proteici. IBrick è stato sviluppato per affrontare il secondo problema 6 . Utilizza endonucleasi di homing (HEs) che riconoscono lunghe sequenze di DNA. Poiché i siti di riconoscimento HE raramente esistono nelle sequenze di DNA naturali, lo standard iBrick può essere utilizzato per la costruzione diretta di parti iBrick senza modificarne le sequenze di DNA. Tuttavia, lo standard iBrick lascia una cicatrice di 21 bp tra le parti del DNA, che potrebbe essere il motivo della sua impopolarità.

Negli ultimi anni, i cluster regolarmente hanno interspato brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) ha sviluppato rapidamente 7 , 8 . Tra le proteine ​​associate a CRISPR (Cas), l'endonucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes è ora ampiamente utilizzata. Esso presenta per lo più due interruzioni di DNA a doppio filamento (DSB) con estremità lisce 9 .

Nel 2015, Zhang e colleghi hanno caratterizzato per la prima volta Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1). Appartiene al sistema CRISPR-Cas di classe 2 di tipo V ed è un CRISRP RNA (crRNA) -guardato endonucleasi 10 . A differenza di Cas9, Cpf1 introduce un DSB con 4 o 5 nt 5 'overhang 10 . Sulla base di questa caratteristica, Cpf1 è stato utilizzato per sviluppare uno standard di assemblaggio del DNA, C-Brick 4 . Su un vettore standard C-Brick, quattro siti target Cpf1 di prefissati T1 / T2 e suffixed T3 / T4 fianco le parti biologiche; Questo è simile allo standard BioBrick. Come la scissione dei siti T2 e T3 pGenera estremità appiccicose complementari, è possibile eseguire l'assemblaggio iterativo delle parti del DNA, generando una cicatrice "GGATCC" tra le parti. In particolare, lo standard C-Brick ha due vantaggi principali: riconoscere lunghe sequenze di bersagli e lasciare brevi cicatrici. La cicatrice a 6 bp "GGATCC" generata da C-Brick codifica Gly-Ser, che consente la costruzione di proteine ​​di fusione. Inoltre, lo standard C-Brick è parzialmente compatibile con gli standard BglBrick e BioBrick.

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Protocol

1. Preparazione di crRNA

  1. Preparazione di modelli di crRNA
    1. Riassemblare singoli oligonucleotidi ( Tabella 1 ) in acqua libera da RNasi a una concentrazione di 10 μM.
    2. Aggiungere 22,5 μL di oligonucleotide di prima riga (T7-F nella tabella 1 ), 22,5 μL oligonucleotide a filo di fondo ( Tabella 1 ) e 5 μl di tampone di ricottura 10 volte a un tubo PCR da 0,2 ml. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL.
      NOTA: Sei differenti oligonucleotidi di fondo sono riportati nella Tabella 1 , ognuno dei quali deve essere accoppiato singolarmente con il top-strand T7-F. Le lettere minuscole della Tabella 1 rappresentano la sequenza da trascrivere nella sequenza di guida di crRNA. Può essere utilizzato 10x Taq PCR buffer invece del buffer di ricottura 10x.
    3. Posizionare il tubo PCR in un termociclatore.
    4. Eseguire il programma di ricottura: denaturazione iniziale a 95 ° C per5 min e poi un cooldown da 95-20 ° C, con una diminuzione di 1 ° C per min sul termociclatore.
      NOTA: Utilizzare immediatamente i campioni per la fase 1.2.1.
  2. Trascrizione e purificazione di crRNA
    1. Aggiungere 38 μl di acqua priva di RNasi, 8 μl di template dalla fase 1.1.4, 20 μl di 5x T7 tolleratore di transcrizione, 20 μL di miscela NTP (10 μM), 4 μL di inibitore RNasi ricombinante (RRI) e 10 ΜL di T7 RNA polimerasi in un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga. Assicurarsi che il volume totale sia di 100 μL.
    2. Mettere il tubo di microcentrifuga in un bagno d'acqua di 37 ° C per una notte (per circa 16 ore).
    3. Utilizzare un kit di pulizia e concentrazione di RNA per purificare l'RNA trascritto; Seguire il protocollo del produttore.
    4. Quantitate gli RNA con spettrofotometri UV-Vis e diluire l'RNA a una concentrazione di 10 μM. Usare immediatamente i campioni o conservarli a -80 ° C.
      NOTA: la sequenza crRNAS sono elencati nella tabella 2 .

2. Costruzione di parti in C-Brick ( cioè l'inserimento di parti biologiche in un vettore standard C-Brick)

NOTA: Questo passaggio ha tre sottoprogrammi. Per le parti biologiche corte ( ad esempio, promotori e terminatori), è meglio utilizzare il metodo diretto di PCR per inserire le parti biologiche in un vettore standard C-Brick4. L'intera sequenza vettoriale è mostrata nei dati supplementari e la sequenza di prefisso e suffisso è mostrata in Figura 1 (punto 2.1, di seguito). Per le parti biologiche che possono essere facilmente ottenute tramite PCR ( ad es. Con modelli di DNA genomico, plasmidi o sequenze DNA sintetizzate), è consigliabile utilizzare il metodo di assemblaggio senza soluzione di continuità per inserire le parti biologiche in un vettore standard C-Brick (Punto 2.2, di seguito). Per quelle parti ottenute da standard BioBrick e BglBrick, restrizioneLa digestione mediata da enzimi e la legatura ligasi mediata con T4 DNA può essere utilizzata per inserire le parti biologiche in un vettore standard di C-Brick (fase 2.3).

  1. Costruzione tramite amplificazione diretta PCR
    1. Progettare e ordinare oligonucleotidi per amplificazione PCR.
      NOTA: La 5'estremità dell'oligonucleotide contiene la sequenza della parte del DNA e la 3'-estremità dell'oligonucleotide contiene la sequenza vettoriale ( cioè "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" alla estremità 3''stringa avanzata e 'GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG' Nel filo inverso). Non si può progettare alcuna sovrapposizione o un sbalzo di 20 bp alla 5 'dell'oligonucleotide. Esempi specifici possono essere trovati in uno studio precedente 4 .
    2. Riassemblare singoli oligonucleotidi in acqua ultra-pura a una concentrazione di 10 μM.
    3. Impostare reazioni PCR sul ghiaccio in un tubo PCR da 0,2 ml: aggiungere 18 μl di acqua ultra-pura, 25 μL di 2x PCR buffer, 1 μL di dNTPs (10 μM), 2,5 μL di ciascuno dei primer in avanti e invertire (10 μM) dalla fase 2.1.2, 0,5 μL di vettore standard C-Brick (50 ng) come template e 0,5 μL Di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL.
    4. Posizionare il tubo direttamente in un termociclatore e avviare il programma del termociclatore. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
    5. Programma termociclatore: un ciclo per 3 min a 98 ° C; Trenta cicli per 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C; E un ciclo per 10 min a 72 ° C. Tenere il campione a 16 ° C.
    6. Aggiungere 9 μL di miscela dal punto 2.1.4 a un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
    7. Aggiungere 1 μl di DpnI e incubare per 1 h in un bagno d'acqua di 37 ° C.
      NOTA: Se i primer non hanno sequenze sovrapposte, aggiungere 0,5 μL di polinucleotide chinasi T4 (PNK) e 0,5 μL di ligasi del DNA di T4 e incubare inUn bagno d'acqua di 22 ° C per 1 h. Altrimenti, se i primer contengono una sequenza di sovrapposizione di ~ 20 nt, trasformano direttamente i prodotti trattati con DpnI in cellule E. coli (DH10B) -competenti (fase 2.4). Il prodotto PCR linearizzato sarà circolarizzato dal sistema di ricombinazione nell'host.
    8. Usare immediatamente i campioni o conservarli a -20 ° C.
  2. Costruzione tramite montaggio senza soluzione di continuità
    1. Progettare e ordinare oligonucleotidi per amplificazione PCR.
      NOTA: La 3'estremità dell'oligonucleotide contiene la sequenza terminale della parte del DNA e la 5'estremità dell'oligonucleotide contiene il terminale della sequenza lineare di vettori standard C-Brick ( cioè "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" per il 5 ' -end del filo in avanti e "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" per la 5'-estremità del filo inverso). Esempi specifici possono essere trovati in uno studio precedente 4 .
    2. Riposizionare l'individuoOligonucleotidi in acqua ultra-pura ad una concentrazione di 10 μM.
    3. Impostare reazioni PCR sul ghiaccio in un tubo PCR da 0,2 ml: aggiungere 18 μl di acqua ultra-pura, 25 μL di tampone 2x PCR, 1 μL di dNTPs (10 μM), 2,5 μl ciascuno dei primer avanti e indietro (10 μM ) Dalla fase 2.2.2, 0,5 μL di template (20-500 ng) e 0,5 μL di DNA-polimerasi ad alta fedeltà. Assicurarsi che il volume totale sia di 50 μL.
    4. Posizionare il tubo direttamente nel termociclatore e eseguire il programma termociclatore. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
      NOTA: Impostare il programma termociclatore su: un ciclo per 3 min a 98 ° C; 30 cicli per 10 s a 98 ° C, 20 s a 55 ° C (secondo la temperatura di additivo del primer) e 1 min (a seconda della lunghezza delle parti biologiche) a 72 ° C; E un ciclo per 10 min a 72 ° C. Tenere il campione a 16 ° C.
    5. Purificare il prodotto PCR utilizzando un sistema di pulizia PCRKit kit; Seguire il protocollo del produttore.
    6. Digestare il vettore standard C-Brick con BamHI: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μl di plasmide (1 μg), 5 μl di tampone da 10 volte e 1 μL di BamHI nel tubo di microcentrifuga. Incubare fino a 2 ore a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    7. Purificare il prodotto sopra usando un kit di sistema di pulizia del gel; Seguire il protocollo del produttore.
    8. Aggiungere 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dal punto 2.2.7, 5 μL di frammento (200 ng) dalla fase 2.2.4, 2 μl di tampone di assemblaggio senza saldatura da 5x e 1 μl di enzima di assemblaggio senza soluzione di continuità da un kit di montaggio senza soluzione di continuità A un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga. Assicurarsi che il volume totale sia di 10 μL.
    9. Mettere questo in un bagno d'acqua di 37 ° C per 30 minuti. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
  3. Costruzione tramite la digestione mediata da restrizione enzimatica e legatura ligasi mediata da T4 DNA.
    NOTA: Per le parti ottenute dai criteri BioBrick (passo 2.3.4-2.3.7) e BglBrick (passo 2.3.1-2.3.3), la digestione con enzimi-restrizione e la legatura ligasi mediata con T4 DNA può essere utilizzata per inserire Parti biologiche in un vettore standard C-Brick.
    1. Digestare le parti standard di BglBrick con BamHI e BglII: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μl di plasmide (2 μg), 5 μl di tampone 10x, 0,5 μL di BamHI e 0,5 μL di BglII nel tubo di microcentrifuga. Incubare per 2 ore in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    2. Eseguire un'elettroforesi con gel agarosico del 1% e purificare il frammento utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel.
    3. Legare il frammento e il vettore standard C-Brick: aggiungere il volume da 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dalla fase 2.1.12 e 6 μl di frammento (200 ng) dal punto 2.3.3 in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 μl di 10 x T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelareE conservarli a -20 ° C.
    4. Digestare le parti standard di BioBrick con XbaI e SpeI: aggiungere 34 μL di acqua ultra pura, 10 μl di plasmide (2 μg), 5 μl di tampone 10 volte, 0,5 μL di XbaI e 0,5 μl di SpeI nel tubo di microcentrifuga. Incubare per 2 ore in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    5. Digestare il vettore standard C-Brick con XbaI e SpeI: aggiungere 34 μL di acqua ultra-pura, 10 μL di plasmide (1 μg), 5 μl di tampone 10 volte, 0,5 μL di XbaI e 0,5 μL di SpeI al tubo di microcentrifuga . Incubare per 2 ore in un bagno d'acqua di 37 ° C.
    6. Eseguire un'elettroforesi del gel agarosico del 1% e purificare il frammento dalla fase 2.3.4 e il vettore linearizzato dal punto 2.3.5 con un kit di sistema di pulizia del gel; Seguendo il protocollo del produttore.
    7. Legare il frammento e il vettore Crick Brick: aggiungere 2 μL di vettore linearizzato (50 ng) dal punto 2.3.5 e 6 μL di frammento (200 ng) dalla fase 2.3.4 in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Anno DominiD 1 μl di 10 volte T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
  4. Aggiungere 10 μL dei prodotti della fase 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 o 2.3.7 per la trasformazione chimica nelle cellule competenti di E. coli (DH10B).
  5. Raccogliere diversi cloni in un tubo di liquido Luria-Bertani (LB) da 5 ml e incubare a 37 ° C su un agitatore (220 rpm) durante la notte.
  6. Estrarre il plasmide usando un kit di preparazione del plasmide; Seguire il protocollo del produttore.
  7. Identificare i cloni corretti da sequenziamento di Sanger 11 .

3. C-Brick Assembly ( Figura 2 )

  1. Digestione del vettore C-Brick con Cpf1
    1. Aggiungere 22,5 μL di acqua priva di RNasi, 4 μl di tampone Cpfl 10 volte, 10 μL del plasmide della fase 2.6 (1 μg), 0,5 μL di RRI e 1 &# 181; L di Cpf1 (5 μM) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
      NOTA: Cpf1 può essere acquistato in commercio o purificato seguendo il protocollo in uno studio precedente 4 .
    2. Per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T1 e T2, aggiungere 1 μL di crRNA-T2 (10 μM) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min. A dd 1 μL di crRNA-T1 (10 μM) e Cpf1 (5 μM) per altri 30 min.
      NOTA: In alternativa, per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T3 e T4, aggiungere 1 μL di crRNA-T3 (10 μM) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min. Aggiungere 1 μL di crRNA-T4 (10 μM) per altri 30 min.
    3. Aggiungere 1 μl di fosfatasi alcalina termosensiva e incubare il tubo in un bagno d'acqua di 37 ° C per altri 1 h.
    4. Eseguire un'elettroforesi con gel agarosio e purificare il vettore utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
    Digestione del frammento di DNA con Cpf1
    1. Aggiungere 21 μl di acqua senza RNasi, 4 μl di 10 volte Cpf1 tampone, 10 μl di plasmide dalla fase 2.6 (2 μg), 0,5 μL di RRI e 2 μl di Cpf1 (5 μM) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
    2. Per inserire un frammento di DNA straniero nei siti T1 e T2, aggiungere 1 μL di crRNA-T1 (10 μM) e 1 μL di crRNA-T3 (10 μM) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 ore.
      NOTA: In alternativa, aggiungere 1 μL di crRNA-T2 (10 μM) e 1 μL di crRNA-T4 (10 μM) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 ore.
    3. Eseguire un'elettroforesi con gel agarosio e purificare il frammento utilizzando un kit di sistema di pulizia del gel. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
  2. Assemblaggio di C-mattone e ulteriore verifica
    1. Ligate il frammento di DNA straniero e il vettore di C-Brick: aggiungere 2 μL del vettore linearizzato (50 ng) dalla fase 3.1.4 e 6 μL del frammento DNA (200 ng) dalla fase 3.2.3 a un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 μl di 10 volte T4 DNA ligase buffer e 1 μl di T4 DNA ligasi. Incubare per 2 ore a 22 ° C. Usare immediatamente i campioni o congelare e conservarli a -20 ° C.
    2. Aggiungere 10 μL dei prodotti di legatura (fase 3.3.1) per la trasformazione chimica in E. coli (DH10B) -competente cellule.
    3. Aggiungere un certo numero di cloni a un tubo liquido da 5 ml di LB e incubare per una notte su un agitatore a 220 giri / min e 37 ° C.
    4. Estrarre il plasmide usando un kit di preparazione del plasmide; Seguire il protocollo del produttore.
    5. Identificare i cloni corretti da sequenziamento di Sanger 11 .
  3. Eseguire un nuovo ciclo di C-Brick assembly. I cloni corretti dal punto 3.3.4 possono essere utilizzati come un nuovo vettore C-Brick o parte del DNA per ulteriori successivi iterative C-Brick, seguendo lo stesso protocollo dai passaggi 3.1-3.3.
    NOTA: T2 'e T3' sSono progettati come il backup dei siti T2 e T3 ( Figura 1a ). Per i plasmidi ottenuti dalla fase 2.3.7, solo il T2 'e il T3' possono essere utilizzati per l'assemblaggio standard C-Brick.

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Representative Results

Questo protocollo ha dimostrato l'assemblaggio di tre cassette di cromoproteine ​​(cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). In primo luogo, le sequenze di codificazione dei tre geni e terminatori sopra menzionati sono stati clonati individualmente in un vettore standard C-Brick. Brevi parti del DNA, promotore e terminatore, sono state introdotte nel vettore C-Brick mediante amplificazione PCR utilizzando primer contenenti le parti corte del DNA sul terminale 5 '. Questo è stato seguito dal metodo di auto-ligation. Tre sequenze di codifica di cromoproteine ​​sono state prima de novo sintetizzate e poi clonate nel vettore standard C-Brick attraverso l'assemblaggio senza soluzione di continuità. I primer sono stati descritti in uno studio precedente 4 .

Successivamente, le sequenze cjBlue, eforRed e amilGFP sono state legate con sequenze di terminatori e promotori nella stessa procedura mostrata in"Xfig"> Figura 2. I costrutti corretti sono stati trasformati in E. coli , mostrando bei colori ( Figura 3a ). Successivamente, due campagne di espressione a colori sono state ulteriormente assemblate con lo standard C-Brick per creare più colori ( cioè il colore rosso di amilGFP plus eforRed, il colore verde di amilGFP plus cjBlue e il colore viola chiaro da eforRed plus cjBlue; 3b ).

Figura 1
Figura 1: Sequenza del DNA Interfaccia Standard di C-Brick e Vector Standard di C-Brick. ( A ) La sequenza dell'interfaccia standard di mattone C-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'-può essere riconosciuta dal suo corrispondente crRNA e quindi introdotto in un sovrapposizione di 5' usando Cpf1. La scissione dei siti T2 e T3 (o T2 'e T3') produce complementarisi blocca. Con gli otto siti di restrizione progettati, lo standard C-Brick è parzialmente compatibile con BioBrick e BglBrick. ( B ) Mappa del plasmide per il vettore standard C-Brick con siti di digestione di restrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Il flusso di lavoro per l'assemblaggio del DNA nello standard C-Brick. I siti di destinazione T2 e T3 digeriti con Cpf1 producono rispettivamente le estremità coesive complementari di "GGATC" e "GATCC", che possono essere legate per generare una breve cicatrice "GGATCC". Le procedure dettagliate si possono trovare nel punto 3 del testo ("C-Brick assembly"). Fare clic qui per Visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Pigmenti batterici colorati prodotti da E. coli Portoni Costruiti assemblati nel C-Brick Standard. ( A ) Tre cromoproteine ​​sono state espresse in E. coli coltivate su una piastra. I batteri senza cromoproteine ​​(controllo negativo) sono mostrati sulla 4a piastra. ( B ) Tre cromoproteine ​​e tre cromoproteine ​​doppie assemblate sono state espresse in E. coli coltivate in mezzo liquido LB. Da 1 a 6, i costrutti espressi con eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) e eforRed plus cjBlue (6). I batteri colorati su una singola piastra o in un unico tubo di microcentrifuga sono stati coltivati ​​da un unico clone di sequenza verificato. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

nome sequenza
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Tabella 1: Oligos per la preparazione dei modelli di trascrizione crRNA utilizzati in questo studio. T7-F era l'oligonucleotide di primo strato, mentre gli altri erano gli oligonucleotidi di fondo. Le basi minuscole della sequenza verranno trascritte nella sequenza di guida in crRNA.

nomi Sequenze RNA (5'-3 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-T2' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Tabella 2: Le sequenze crRNA utilizzate in questo studio. I crRNAs sono stati prodotti attraverso la trascrizione in vitro nella fase 1 del testo ("Preparazione di crRNA").

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Discussion

Questo protocollo descrive una procedura per lo standard di assemblaggio del DNA C-Brick. Il passo più importante in questo protocollo è la linearizzazione del vettore standard C-Brick; La scissione incompleta del vettore potrebbe influenzare seriamente il tasso di successo. Inoltre, sebbene Cpf1 praticamente abbia sequenze di DNA bersaglio nel pattern di scissione "18-23", è stata rilevata anche una scissione inesatta vicino alle due basi 4 , che possono causare un piccolo numero di mutazioni dopo l'assemblaggio del DNA. Pertanto, è necessario eseguire sequenziamenti di Sanger per verificare il costrutto assemblato.

L'efficienza del gruppo C-Brick è inferiore rispetto agli enzimi di restrizione tradizionali e ai metodi di legatura descritti in uno studio precedente4. Il principale motivo che incide sull'efficienza di assemblaggio può essere le caratteristiche di scorrimento imprecise di Cpf1. In futuro, i miglioramenti all'accuratezza di scissione possono essere estremamente utili per lo standard aSono state esplorate.

C-Brick è anche parzialmente compatibile con gli standard BglBrick e BioBrick. Ad esempio, le parti di BglBrick possono essere tagliate con BglII e BamHI e poi inserite nel sito BamHI di un vettore standard C-Brick, generando una parte di C-Brick. Tuttavia, la direzione di inserzione della parte BglBrick dovrebbe essere verificata e ci sarà una cicatrice "GGATCT" dopo l'assemblaggio. Quando una parte del DNA di C-Brick viene ottenuta da una parte di BioBrick ( cioè con XbaI e SpeI digestione), entrambi i siti T2 e T3 saranno distrutti e due sequenze di destinazione Cpf1 di backup (T2 'e T3') possono essere utilizzate.

Poiché la scissione Cpf1 richiede sgRNA, che è estremamente sensibile a RNase, tutti i materiali devono essere privi di RNasi. Attualmente, tutti i vettori standard C-Brick, nucleasi Cpf1 senza RNase e crRNAs possono essere ordinati in commercio 12 . Pertanto, le procedure per C-Brick sono in realtà semplici come quelle del BioStandard di mattoni.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati e sono ampiamente utilizzati diversi metodi di assemblaggio del DNA, tra cui l'Assemblea Golden Gate 13 , l'Assemblea Gibson 14 e altri 15 . Tuttavia, poiché le norme relative all'assemblaggio del DNA hanno il potenziale per fornire reazioni di assemblaggio a costi contenuti, affidabili, ad alto rendimento e automatico 5 , gli standard possono facilitare la costruzione e la sperimentazione di geni di nuova progettazione o ricreazione, circuiti genetici e percorsi 15 , 16 , 17 , specialmente nel campo della biologia sintetica. Tra gli standard di assemblaggio del DNA attualmente pubblicati, lo standard C-Brick presenta evidenti vantaggi e svantaggi 4 ( cioè l'efficienza di legatura). Se l'efficienza della legatura è migliorata, lo standard può essere ampiamente adottato in futuro.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Shanghai Tolo Biotech per la loro assistenza tecnica durante lo sviluppo del C-Brick standard. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca di Priorità Strategica dell'Accademia Cinese delle Scienze (Grant No. XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

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References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

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Genetica edizione 124 biologia sintetica CRISPR Cpf1 C-Mattone estremità appiccicose assemblaggio del DNA, Standard di montaggio
Protocolli per l'assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1
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Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

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