Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Protocollen voor C-Brick DNA Standard Assembly met behulp van Cpf1

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55775
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

CRISPR-geassocieerd eiwit Cpf1 kan geleid worden door een speciaal ontworpen CRISPR RNA (crRNA) om dubbelstrengs DNA op gewenste plaatsen te kloppen, waardoor kleverige einden worden geproduceerd. Op basis van dit kenmerk werd een DNA-assemblage standaard (C-Brick) opgericht, en hier wordt een protocol beschreven waarin het gebruik ervan wordt beschreven.

Abstract

CRISPR-geassocieerd eiwit Cpf1 splitst dubbelstrengs DNA onder leiding van CRISPR RNA (crRNA), waardoor kleverige einden worden geproduceerd. Vanwege deze eigenschap is Cpf1 gebruikt voor de oprichting van een DNA-assemblage standaard genaamd C-Brick, die het voordeel heeft van lange herkenningsplaatsen en korte littekens. Op een standaard C-Brick vector zijn er vier Cpf1 herkenningssites - de prefix (T1 en T2 sites) en het achtervoegsel (T3 en T4 sites) - flankerende biologische DNA-onderdelen. De splitsing van T2- en T3-plaatsen produceert complementaire kleverige uiteinden, die het mogelijk maken om de DNA-delen samen te stellen met T2- en T3-plaatsen. Ondertussen wordt een kort "GGATCC" litteken gevormd tussen onderdelen na montage. Aangezien het nieuw gevormde plasmide opnieuw de vier Cpfl-splitsingsplaatsen bevat, maakt de werkwijze het iteratieve samenstellen van DNA-delen mogelijk, die vergelijkbaar is met die van BioBrick en BglBrick-normen. Een procedure waarin het gebruik van de C-Brick-standaard wordt beschreven om DNA-onderdelen te assemblerenWordt hier beschreven. De C-Brick-standaard kan veel gebruikt worden door wetenschappers, afgestudeerden en studenten en zelfs amateurs.

Introduction

De standaardisatie van biologische delen van DNA is belangrijk voor de ontwikkeling van synthetische biologie 1 . De ontwikkeling van een DNA-assemblageprocedure kan ad hoc experimentele ontwerpen vervangen en veel van de onverwachte uitkomsten die zich voordoen tijdens de assemblage van genetische componenten in grotere systemen verwijderen. De BioBrick-standaard (BBF RFC 10) was een van de vroegste voorgestelde DNA-montagestandaarden. Het maakt gebruik van de prefix-sequentie (die EcoRI- en XbaI-snijsites bevat) en de achtervoegingsreeks (die SpeI- en PstI-snijsites) 2 , 3 bevatten . Omdat XbaI en SpeI complementaire samenhangende uiteinden hebben, kunnen BioBrick DNA-delen die met XbaI en SpeI worden gesneden, worden samengevoegd en een nieuwe BioBrick genereren voor verdere iteratieve montage.

Enkele gebreken zijn geïdentificeerd met behulp van de BioBrick standaard 4 . Bijvoorbeeld, het produceert een 8-bp littekenTussen de DNA-delen, die niet toelaat voor de constructie van in-fusie-eiwitten. Daarnaast moeten de vier bovengenoemde typen van 6-bp restrictieplaatsen verwijderd worden van de DNA-delen, wat erg ongemakkelijk is. De BglBrick standaard werd opgericht om het eerste probleem 5 op te lossen. Het creëert een 6-bp "GGATCT" litteken dat Gly-Ser produceert en de fusie van meerdere eiwitten of eiwitdomeinen mogelijk maakt. IBrick is ontwikkeld om te gaan met het tweede probleem 6 . Het gebruikt homing endonucleases (HEs) die lange DNA sequenties herkennen. Aangezien de HH-herkenningssites zelden bestaan ​​in natuurlijke DNA-sequenties, kan de iBrick-standaard gebruikt worden voor de directe constructie van iBrick-delen zonder hun DNA-sequenties te wijzigen. De iBrick-standaard laat echter een 21 bp litteken tussen de DNA-delen achter, wat de reden kan zijn voor zijn ongewildheid.

In de afgelopen jaren hebben de clusters regelmatig korte palindromische herhalingen (CRISPR) systeem is snel ontwikkeld 7 , 8 . Onder de CRISPR-geassocieerde (Cas) eiwitten wordt Cas9 endonuclease van Streptococcus pyogenes nu veel gebruikt. Het introduceert meestal dubbelstrengige DNA-pauzes (DSB's) met stompe einden 9 .

In 2015 gekenmerkt Zhang en collega's voor het eerst Cpf1 ( CRISPR van Prevotella en Francisella 1). Het behoort tot het klasse 2 type V CRISPR-Cas systeem en is een CRISRP RNA (crRNA) -geleide endonuclease 10 . In tegenstelling tot Cas9 introduceert Cpf1 een DSB met een 4 of 5 nt 5 'overhang 10 . Op basis van dit kenmerk werd Cpf1 gebruikt om een ​​DNA-assemblage standaard, C-Brick 4 , te ontwikkelen. Op een C-Brick-standaardvector flanken vier Cpf1-doelplaatsen van voorgeprogrammeerde T1 / T2 en achtervoegsels T3 / T4 de biologische delen; Dit is vergelijkbaar met de BioBrick standaard. Als de splitsing van T2 en T3 sites pRoduces complementary sticky ends, het is mogelijk om het iteratieve assemblage van DNA-onderdelen uit te voeren, terwijl er een "GGATCC" litteken tussen de delen wordt opgewekt. Met name heeft de C-Brick-standaard twee voornaamste voordelen: herkennen van lange doelsequenties en het verlaten van korte littekens. De 6 bp "GGATCC" litteken die door C-Brick wordt gegenereerd, codeert Gly-Ser, waarmee de fusieproteïnen worden gebouwd. Bovendien is de C-Brick standaard ook gedeeltelijk compatibel met de BglBrick en BioBrick standaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van crRNA

  1. Bereiding van crRNA templates
    1. Resuspende individuele oligonucleotiden ( Tabel 1 ) in RNase-vrij water tot een concentratie van 10 uM.
    2. Voeg 22,5 μL topstreng oligonucleotide (T7-F in Tabel 1 ), 22,5 μL onderste strand oligonucleotide ( Tabel 1 ) en 5 μl 10x annealing buffer aan een 0,2 ml PCR buis. Zorg ervoor dat het totale volume 50 μL is.
      OPMERKING: Zes verschillende oligonucleotiden in de onderste strand zijn weergegeven in Tabel 1 , die elk afzonderlijk met de bovenste streng T7-F moeten worden gekoppeld. De kleine letters in tabel 1 vertegenwoordigen de sequentie die moet worden getranscribeerd in de geleidingssequentie van crRNA. 10x Taq PCR buffer kan worden gebruikt in plaats van de 10x annealing buffer.
    3. Plaats de PCR-buis in een thermocycler.
    4. Doe het annealing programma: initiële denaturatie bij 95 ° C voor5 minuten en dan een afkoeling van 95-20 ° C, met een 1 ° C daling per minuut op de thermocycler.
      OPMERKING: Gebruik de monsters onmiddellijk voor stap 1.2.1.
  2. Transcriptie en zuivering van crRNA
    1. Voeg 38 μL RNase-vrij water, 8 μl van de sjabloon van stap 1.1.4, 20 μl 5x T7 transcriptiebuffer, 20 μl NTP-mengsel (10 μM), 4 μl recombinante RNase-inhibitor (RRI) en 10 Μl T7 RNA-polymerase aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat het totale volume 100 μL is.
    2. Zet de microcentrifugebuis in een waterbad van 37 ° C 's nachts (gedurende ongeveer 16 uur).
    3. Gebruik een RNA opruimings- en concentratiekit om het getranscribeerde RNA te zuiveren; Volg het protocol van de fabrikant.
    4. Kwantificeer de RNA's met UV-Vis-spectrofotometers en verdun het RNA tot een concentratie van 10 μM. Gebruik de monsters direct of opslaan bij -80 ° C.
      OPMERKING: De crRNA sequentieS zijn vermeld in tabel 2 .

2. Constructie van C-Brick Parts ( dat wil zeggen de inbrengen van biologische onderdelen in een C-Brick Standard Vector)

OPMERKING: deze stap heeft drie substappen. Voor korte biologische delen ( bijv. Promotors en terminators) is het best de directe PCR methode te gebruiken om de biologische delen in een C-Brick standaard vector 4 in te voegen. De gehele vectorsequentie wordt getoond in de aanvullende gegevens, en de voorvoegsel- en achtervoegingsrequentie is weergegeven in figuur 1 (stap 2.1, hieronder). Voor biologische delen die gemakkelijk kunnen worden verkregen via PCR ( bijv. Met templates van genomisch DNA, plasmiden of de novo gesynthetiseerde DNA sequenties), is het het beste om de naadloze assemblage methode te gebruiken om de biologische delen in een C-Brick standaard vector in te voegen (Stap 2.2 hieronder). Voor die delen verkregen uit BioBrick en BglBrick normen, beperkingEnzym gemedieerde vertering en T4 DNA ligase gemedieerde ligatie kan gebruikt worden om de biologische delen in een C-Brick standaard vector in te voegen (stap 2.3 hieronder).

  1. Constructie via directe PCR amplificatie
    1. Ontwerp en orden oligonucleotiden voor PCR amplificatie.
      OPMERKING: Het 5'-uiteinde van het oligonucleotide bevat de sequentie van het DNA-deel en het 3'-uiteinde van het oligonucleotide bevat de vectorsequentie ( dwz "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" bij het 3'-uiteinde van de voorwaartse streng en "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" In de omgekeerde streng). Ofwel geen overhang of een 20-bp overhang kan worden ontworpen bij het 5'-uiteinde van het oligonucleotide. Specifieke voorbeelden zijn te vinden in een eerdere studie 4 .
    2. Individuele oligonucleotiden opnieuw opschorten in ultrazuiver water tot een concentratie van 10 μM.
    3. PCR-reacties op ijs zetten in een 0,2 ml PCR-buis: voeg 18 μL ultrazuiver water toe, 25 μl 2x PCR buffer, 1 μL dNTPs (10 μM), 2,5 μl elk van de voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM) van stap 2.1.2, 0,5 μl C-Brick standaardvector (50 ng) als een sjabloon en 0,5 μl Van high-fidelity DNA polymerase. Zorg ervoor dat het totale volume 50 μL is.
    4. Plaats de buis rechtstreeks in een thermocycler en start het thermocycler programma. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
    5. Thermocycler programma: 1 cyclus gedurende 3 minuten bij 98 ° C; Dertig cycli gedurende 10 s bij 98 ° C, 20 s bij 55 ° C en 2 min bij 72 ° C; En een cyclus gedurende 10 minuten bij 72 ° C. Houd het monster bij 16 ° C.
    6. Voeg 9 μl van het mengsel van stap 2.1.4 toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    7. Voeg 1 μL DpnI toe en incubeer gedurende 1 uur in een waterbad van 37 ° C.
      OPMERKING: als de primers geen overlappende sequenties hebben, voeg 0,5 μl T4 polynucleotide kinase (PNK) en 0,5 μl T4 DNA ligase toe en incubeer inEen waterbad van 22 ° C gedurende 1 uur. Anders, als de primers een overlappende sequentie van ~ 20 nt bevatten, transformeren de DpnI-behandelde producten direct in E. coli (DH10B) -competente cellen (stap 2.4). Het gelineariseerde PCR product wordt door het recombinatiesysteem in de gastheer gecirculariseerd.
    8. Gebruik de monsters direct of opslaan bij -20 ° C.
  2. Constructie via naadloze montage
    1. Ontwerp en orden oligonucleotiden voor PCR amplificatie.
      OPMERKING: Het 3'-uiteinde van het oligonucleotide bevat de terminale sequentie van het DNA-deel en het 5'-uiteinde van het oligonucleotide bevat de terminale van de gelineariseerde C-Brick standaardvectorsequentie ( dwz "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" voor de 5 ' -end van de voorwaartse streng en 'CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC' voor het 5'-uiteinde van de omgekeerde streng). Specifieke voorbeelden zijn te vinden in een eerdere studie 4 .
    2. Schakel het individu opnieuw opUal oligonucleotiden in ultrazuiver water tot een concentratie van 10 uM.
    3. PCR-reacties op ijs opstellen in een 0,2 ml PCR-buis: voeg 18 μL ultrazuiver water toe, 25 μl 2x PCR buffer, 1 μL dNTPs (10 μM), 2,5 μl elk van de voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM ) Uit stap 2.2.2, 0,5 μl sjabloon (20-500 ng) en 0,5 μl hoogwaardig DNA-polymerase. Zorg ervoor dat het totale volume 50 μL is.
    4. Plaats de buis direct in de thermocycler en voer het thermocyclerprogramma uit. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
      OPMERKING: Stel het thermocyclerprogramma in op: een cyclus gedurende 3 minuten bij 98 ° C; 30 cycli gedurende 10 s bij 98 ° C, 20 s bij 55 ° C (volgens de gloeitemperatuur van de primer) en 1 min (volgens de lengte van de biologische delen) bij 72 ° C; En een cyclus gedurende 10 minuten bij 72 ° C. Houd het monster bij 16 ° C.
    5. Reinig het PCR-product met een PCR-opruimingssysteemTem kit; Volg het protocol van de fabrikant.
    6. Verdeel de standaardvector C-Brick met BamHI: voeg 34 μL ultrazuiver water toe, 10 μl plasmide (1 μg), 5 μl 10x buffer en 1 μl BamHI aan de microcentrifugebuis. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een waterbad.
    7. Reinig het bovenstaande product met een gel reinigingssysteem kit; Volg het protocol van de fabrikant.
    8. Voeg 2 μL gelineariseerde vector (50 ng) van stap 2.2.7, 5 μl fragment (200 ng) van stap 2.2.4, 2 μL 5x naadloze assemblagebuffer en 1 μl naadloos assemblage enzym toe van een naadloze assemblage kit Naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat het totale volume 10 μL is.
    9. Plaats dit gedurende 30 minuten in een 37 ° C waterbad. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
  3. Constructie via restrictie-enzym gemedieerde spijsvertering en T4 DNA ligase gemedieerde ligatie.
    NOTITIE: Voor de delen verkregen uit de BioBrick (stap 2.3.4-2.3.7) en BglBrick (stap 2.3.1-2.3.3) normen kan restrictie-enzym gemedieerde vertering en T4 DNA ligase gemedieerde ligatie worden gebruikt om de Biologische delen in een C-Brick standaard vector.
    1. Verdeel de BglBrick standaarddelen met BamHI en BglII: voeg 34 μL ultrazuiver water toe, 10 μl plasmide (2 μg), 5 μl 10x buffer 3, 0,5 μl BamHI en 0,5 μl BglII aan de microcentrifugebuis. Incubeer gedurende 2 uur in een 37 ° C waterbad.
    2. Doe een 1% agarosegel-elektroforese en reinig het fragment met behulp van een gel opruimingssysteem kit.
    3. Ligeer het fragment en de C-Brick standaard vector: voeg 2 μL gelineariseerde vector (50 ng) van stap 2.1.12 en 6 μl fragment (200 ng) van stap 2.3.3 toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 μl 10 x T4 DNA ligase buffer en 1 μl T4 DNA ligase toe. Incubeer 2 uur bij 22 ° C. Gebruik de monsters onmiddellijk of freezE en opslaan bij -20 ° C.
    4. Verdeel de BioBrick standaarddelen met XbaI en SpeI: voeg 34 μL ultrazuiver water toe, 10 μl plasmide (2 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl XbaI en 0,5 μL SpeI aan de microcentrifugebuis. Incubeer gedurende 2 uur in een 37 ° C waterbad.
    5. Verdeel de standaardvector C-Brick met XbaI en SpeI: voeg 34 μL ultrazuiver water toe, 10 μl plasmide (1 μg), 5 μl 10x buffer, 0,5 μl XbaI en 0,5 μl SpeI aan de microcentrifugebuis . Incubeer gedurende 2 uur in een 37 ° C waterbad.
    6. Voer een 1% agarosegelelektroforese uit en zuiver het fragment van stap 2.3.4 en de gelineariseerde vector uit stap 2.3.5 met een gel opruimingssysteem kit; Het protocol van de fabrikant volgen.
    7. Ligeer het fragment en de C-Brick-vector: voeg 2 μL gelineariseerde vector (50 ng) van stap 2.3.5 en 6 μl fragment (200 ng) van stap 2.3.4 toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis. AdvertentieD 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer en 1 μl T4 DNA ligase. Incubeer 2 uur bij 22 ° C. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
  4. Voeg 10 μL van de producten van stap 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 of 2.3.7 toe voor chemische transformatie in de bevoegde cellen van E. coli (DH10B).
  5. Haal verscheidene klonen op in een 5 ml vloeibare Luria-Bertani (LB) buis en incubeer gedurende een nacht bij 37 ° C op een shaker (220 rpm).
  6. Extracteer het plasmide met behulp van een plasmide bereidingskit; Volg het protocol van de fabrikant.
  7. Identificeer de juiste klonen door Sanger sequencing 11 .

3. C-Brick Assembly ( Figuur 2 )

  1. Spijsvertering van de C-Brick vector met Cpf1
    1. Voeg 22,5 μL RNase-vrij water, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl van het plasmide van stap 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI en 1 '# 181; L van Cpf1 (5 μM) aan een 1,5 ml microcentrifugebuis.
      OPMERKING: Cpf1 kan commercieel gekocht of gezuiverd worden volgens het protocol in een eerdere studie 4 .
    2. Om een ​​vreemd DNA fragment in de T1- en T2-plaatsen in te voegen, voeg 1 μL crRNA-T2 (10 μM) toe en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 37 ° C. A dd 1 μl crRNA-T1 (10 μM) en Cpf1 (5 μM) gedurende nog 30 min.
      OPMERKING: Als u een vreemd DNA-fragment in de T3- en T4-plaatsen wilt invoegen, voeg dan 1 μl crRNA-T3 (10 μM) toe en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 37 ° C. Voeg 1 μl crRNA-T4 (10 μM) nog eens 30 minuten toe.
    3. Voeg 1 μL thermosensitief alkalisch fosfatase toe en incubeer de buis in een 37 ° C waterbad gedurende nog eens 1 uur.
    4. Doe een agarosegel-elektroforese en reinig de vector met behulp van een gel opruimingssysteem. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
    Digestie van het DNA fragment met Cpf1
    1. Voeg 21,5 μL RNase-vrij water, 4 μl 10x Cpf1 buffer, 10 μl plasmide uit stap 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI en 2 μl Cpf1 (5 μM) toe aan een 1,5 ml microcentrifuge buis.
    2. Om een ​​vreemd DNA fragment in de T1- en T2-plaatsen in te voegen, voeg 1 μL crRNA-T1 (10 μM) en 1 μl crRNA-T3 (10 μM) toe en incubeer gedurende 2 uur in een waterbad bij 37 ° C.
      OPMERKING: Voeg als alternatief 1 μL crRNA-T2 (10 μM) en 1 μl crRNA-T4 (10 μM) toe en incubeer gedurende 2 uur in een waterbad bij 37 ° C.
    3. Doe een agarosegel-elektroforese en reinig het fragment met behulp van een gel opruimingssysteem kit. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
  2. C-Brick assemblage en verdere verificatie
    1. Ligeer het vreemde DNA fragment en C-Brick vector: voeg 2 μL van de gelineariseerde vector toe (50 ng) van stap 3.1.4 en 6 μl van het DNA-fragment (200 ng) van stap 3.2.3 naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 μl 10x T4 DNA ligase buffer en 1 μl T4 DNA ligase toe. Incubeer 2 uur bij 22 ° C. Gebruik de monsters onmiddellijk of bevriezen en opslaan bij -20 ° C.
    2. Voeg 10 μL van de ligatieproducten (stap 3.3.1) toe voor chemische transformatie in E. coli (DH10B) -competente cellen.
    3. Voeg verscheidene klonen toe aan een 5 ml vloeibare LB buis en incubeer gedurende een nacht op een shaker bij 220 rpm en 37 ° C.
    4. Extracteer het plasmide met behulp van een plasmide bereidingskit; Volg het protocol van de fabrikant.
    5. Identificeer de juiste klonen door Sanger sequencing 11 .
  3. Voer een nieuwe ronde C-Brick samen. Correcte klonen uit stap 3.3.4 kunnen gebruikt worden als een nieuwe C-Brick vector of DNA-deel voor verdere iteratieve C-Brick assemblage, volgens hetzelfde protocol uit stappen 3.1-3.3.
    OPMERKING: T2 'en T3' sDeze zijn ontworpen als de back-up van T2 en T3 sites ( Figuur 1a ). Voor plasmiden verkregen uit stap 2.3.7, kan alleen T2 'en T3' worden gebruikt voor de C-Brick standaard assemblage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol demonstreerde de assemblage van drie chromoproteïnecassettes (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) en amilGFP (BBa_K592010)). Ten eerste werden de coderende sequenties van de drie bovengenoemde genen en terminatoren afzonderlijk gekloneerd in een C-Brick standaard vector. Korte DNA-delen, promotor en terminator werden geïntroduceerd in de C-Brick-vector door middel van PCR-amplificatie onder gebruikmaking van primers die de korte DNA-delen op de 5'-terminal bevatten. Dit werd gevolgd door de zelf-ligatie methode. Drie chromoproteïne-coderende sequenties werden eerst de novo gesynthetiseerd en vervolgens gekloneerd in de C-Brick standaardvector door middel van naadloze montage. De primers werden beschreven in een eerdere studie 4 .

Vervolgens werden cjBlue-, eforRed- en amilGFP-sequenties geligeerd met terminator- en promotorsekvensen in dezelfde procedure getoond in"Xfig"> Afbeelding 2. Correcte constructen werden getransformeerd in E. coli , waarbij mooie kleuren werden aangetoond ( Figuur 3a ). Vervolgens werden twee kleurenuitdrukkingscassettes verder gemonteerd met de C-Brick-standaard om meer kleuren te creëren ( dwz de rode kleur van amilGFP plus eforRed, de groene kleur van amilGFP plus cjBlue en de lichtpaars kleur van eforRed plus cjBlue; Figuur 3b ).

Figuur 1
Figuur 1: C-Brick Standaard Interface DNA Sequence en C-Brick Standaard Vector. (A) De sequentie van de C-steen standaardinterface-T1, T2, T3, T4, T2 ', T3'- kan worden herkend door zijn bijbehorende crRNA en vervolgens geïntroduceerd in een 5'-overhang met behulp van Cpf1. De splitsing van T2 en T3 (of T2 'en T3') sites produceert complementair overhangt. Met de acht ontworpen restrictieplaatsen is de C-Brick standaard gedeeltelijk compatibel met BioBrick en BglBrick. ( B ) Plasmidekaart voor de standaard C-Brick-vector met restrictie-verteringsplaatsen. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: De Workflow voor DNA-montage in de C-Brick Standard. Cpf1-verteerde T2- en T3-targetplaatsen produceren complementaire cohesieve einden van respectievelijk "GGATC" en "GATCC", die kunnen worden geligerd om een ​​kort "GGATCC" litteken te genereren. Gedetailleerde procedures zijn te vinden in stap 3 in de tekst ("C-Brick assembly"). Klik hier om naar Bekijk een grotere versie van deze figuur.

Figuur 3
Figuur 3: Kleurrijke bacteriepigmenten Geproduceerd door E. coli Haring Constructs In de C-Brick Standard samengesteld. (A) Drie chromoproteïnen werden uitgedrukt in E. coli op een plaat gegroeid. Bacteriën zonder chromoproteïnen (negatieve controle) worden getoond op de 4e plaat. ( B ) Drie chromoproteïnen en drie gemonteerde dubbele chromoproteïnen werden uitgedrukt in E. coli gegroeid in vloeibaar LB medium. Van 1 tot 6 expresseerden de constructen eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) en eforRed plus cjBlue (6). De kleurrijke bacteriën op een enkele plaat of in een enkele microcentrifugebuis werden gekweekt uit een enkele sequentie-geverifieerde kloon. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

naam volgorde
T7-F GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
T7-T1-R gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2'-R ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T2-R ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3-R ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T3'-R ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
T7-T4-R ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

Tabel 1: Oligo's voor de bereiding van de crRNA-transcriptiesjablonen die in deze studie werden gebruikt. T7-F was het bovenste strand oligonucleotide, en de andere waren de bottom-strand oligonucleotiden. De kleine letters in de sequentie worden getranscribeerd in de geleidingssequentie in crRNA.

namen RNA sequenties (5'-3 ')
crRNA-T1 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC
crRNA-T2 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC
crRNA-T3 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC
crRNA-T4 GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA
crRNA-T2' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG
crRNA-T3' GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG

Tabel 2: De crRNA Sequenties gebruikt in deze studie. De crRNA's werden geproduceerd door de in vitro transcriptie in stap 1 in de tekst ("Bereiding van crRNA").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een procedure voor de DNA-montage standaard C-Brick. De belangrijkste stap in dit protocol is de linearisering van de C-Brick standaard vector; Onvolledige splitsing van de vector kan de succesfrequentie ernstig beïnvloeden. Bovendien, hoewel Cpf1 hoofdzakelijk DNA-sequenties in het 18-23-splitsingspatroon splitst, werd onnauwkeurige splitsing nabij de twee basen ook gedetecteerd 4 , die een klein aantal mutaties kan veroorzaken na DNA-assemblage. Daarom is Sanger-sequencing nodig om het samengestelde construct te verifiëren.

De efficiëntie van de C-Brick-assemblage is lager dan traditionele restrictie-enzym- en ligatiemethoden die zijn beschreven in een eerdere studie 4 . De belangrijkste reden die de montage-efficiëntie beïnvloedt kan de onnauwkeurige splitsingseigenschappen van Cpf1 zijn. In de toekomst kunnen verbeteringen van de spleetnauwkeurigheid zeer nuttig zijn voor de standaard aNd worden momenteel onderzocht.

C-Brick is ook gedeeltelijk compatibel met de BglBrick en BioBrick standaarden. BglBrick delen kunnen bijvoorbeeld worden gesneden met BglII en BamHI en vervolgens ingebracht in de BamHI plaats van een C-Brick standaard vector, waardoor een C-Brick deel wordt opgewekt. De insteekrichting van het BglBrick-onderdeel moet echter worden geverifieerd, en er zou een "GGATCT" litteken zijn na de montage. Wanneer een C-Brick DNA-deel wordt verkregen uit een BioBrick-deel ( dwz met XbaI en SpeI-spijsvertering), worden beide T2- en T3-sites vernietigd en kunnen twee back-up Cpf1-doelgroepen (T2 'en T3') worden gebruikt.

Aangezien de Cpf1-splitsing sgRNA vereist, die extreem gevoelig is voor RNase, moeten alle materialen RNase-vrij zijn. Momenteel kunnen alle C-Brick standaardvectoren, RNase-vrije Cpf1-nucleasen en crRNA's in de handel worden gebracht 12 . Daarom zijn de procedures voor C-Brick eigenlijk even eenvoudig als die van de BioBaksteenstandaard.

In de afgelopen jaren zijn diverse nuttige DNA-assemblagemethoden ontwikkeld en worden veel gebruikt, waaronder de Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 en anderen 15 . Aangezien de DNA-montagetoestellen het potentieel hebben om kosteneffectieve, betrouwbare, hoge doorvoer te leveren en automatische assemblage-reacties 5 , kunnen normen de constructie en het testen van nieuw ontworpen of herontworpen genen, genetische schakelingen en trajecten 15 , 16 , 17 , vooral op het gebied van synthetische biologie. Onder de momenteel gepubliceerde DNA-montage standaarden heeft de C-Brick standaard zowel voor de hand liggende voordelen als nadelen 4 ( dwz de ligatie-efficiëntie). Als de ligatie-efficiëntie is verbeterd, kan de standaard in de toekomst veel worden aangenomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij bedanken Shanghai Tolo Biotech voor hun technische bijstand tijdens de ontwikkeling van de C-Brick standaard. Dit werk werd ondersteund door subsidies uit het Strategisch Prioritaire Onderzoeksprogramma van de Chinese Academie van Wetenschappen (Grant No. XDB19040200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comercial Oligonucleotide Sangon Biotech
10x Taq PCR Buffer Transgen #J40928
Ultra Pure Distilled Water Invitrogen 10977-015
5x RNA Transcription Buffer Thermo Scientific K0441
T7 RNA polymerase Thermo Scientific #EP0111
NTP mixture Sangon #ND0056
RRI (Recombinant RNase Inhibitor) Takara 2313A
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015
UV-Vis Spectrometer Thermo Scientific Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer Vazyme PB505 PCR buffer
dNTPs Transgen AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Vazyme P505-d1
Ezmax for One-step Cloning Tolobio 24303-1 seamless assembly kit
5x Buffer for Ezmax One-step Cloning Tolobio 32006
BamHI NEB #R0136L
BamHI-HF NEB #R3136L
BglII  NEB #R0144L
XbaI NEB #R0145L
SpeI NEB #R3133L
10x Buffer 3 NEB #B7003S
10x CutSmart Buffer NEB B7204S
10x T4 DNA ligase Buffer Tolobio 32002
T4 PNK Tolobio 32206
T4 DNA ligase Tolobio 32210
DpnI NEB #R01762
SV Gel and PCR clean-up system Promega A9282
Plasmid Mini Kit I Omega D6943-02 plasmid preparation kit
thermosensitive alkaline phosphatase  Thermo Scientific #EF0651 FastAP
10x Cpf1 buffer Tolobio 32008
Cpf1 Tolobio 32105 FnCpf1
thermocycler Applied Biosystems veriti 96 well
C-Brick standard vector Tolobio 98101
E. coli [DH10B] Invitrogen 18297010
Luria-Bertani media (tryptone) Oxoid LP0042
Luria-Bertani media (yeast extract) Oxoid LP0021
Luria-Bertani media (NaCl) Sangon Biotech B126BA0007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Tags

Genetica synthetische biologie CRISPR Cpf1 C-Brick sticky ends DNA assemblage, Montage standaard
Protocollen voor C-Brick DNA Standard Assembly met behulp van Cpf1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J.… More

Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1. J. Vis. Exp. (124), e55775, doi:10.3791/55775 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter