Summary
CRISPR-associerat protein Cpf1 kan styras av ett speciellt konstruerat CRISPR-RNA (crRNA) för att klyva dubbelsträngat DNA vid önskade ställen, vilket genererar klibbiga ändar. Baserat på denna egenskap etablerades en DNA-monteringsstandard (C-Brick), och ett protokoll som beskriver dess användning beskrivs här.
Abstract
CRISPR-associerat protein Cpfl klyver dubbelsträngat DNA under ledning av CRISPR RNA (crRNA), vilket alstrar klibbiga ändar. På grund av denna egenskap har Cpf1 använts för inrättandet av en DNA-monteringsstandard som kallas C-Brick, vilken har fördelen av långa igenkänningsställen och korta ärr. På en vanlig C-Brick-vektor finns fyra Cpf1-igenkänningssidor - prefixet (T1 och T2-sidorna) och suffixet (T3 och T4-sidorna) - flankerande biologiska DNA-delar. Klyvningen av T2- och T3-ställen ger komplementära klibbiga ändar, vilket möjliggör montering av DNA-delar med T2- och T3-ställen. Under tiden genereras en kort "GGATCC" ärr mellan delar efter montering. Eftersom den nybildade plasmiden återigen innehåller de fyra Cpfl-klyvningsställena möjliggör förfarandet det iterativa sammansättningen av DNA-delar, vilket liknar de för BioBrick och BglBrick-standarderna. Ett förfarande som beskriver användningen av C-Brick-standarden för att montera DNA-delarBeskrivs här. C-Brick-standarden kan användas i stor utsträckning av forskare, forskare och studenter, och till och med amatörer.
Introduction
Standardiseringen av DNA-biologiska delar är viktig för utvecklingen av syntetisk biologi 1 . Utvecklingen av ett DNA-sammansättningsförfarande kan ersätta ad hoc- experimentella mönster och avlägsna många av de oväntade resultaten som uppstår vid montering av genetiska komponenter i större system. BioBrick-standarden (BBF RFC 10) var en av de tidigaste föreslagna DNA-monteringsstandarderna. Den använder prefix-sekvensen (innehållande EcoRI- och XbaI-skärningssidor) och suffixsekvensen (innehållande SpeI- och PstI-skärningsplatser) 2 , 3 . Eftersom XbaI och SpeI har komplementära sammanhängande ändar kan BioBrick DNA-delar som är skurna med XbaI och SpeI förenas och generera en ny BioBrick för ytterligare iterativ montering.
Vissa defekter har identifierats med användning av BioBrick-standarden 4 . Till exempel producerar den en 8-bitarsärrMellan DNA-delarna, vilket inte tillåter konstruktionen av in-fusionsproteiner. Dessutom måste de fyra ovan nämnda typerna av 6-bp restriktionsställen avlägsnas från DNA-delarna, vilket är mycket obekvämt. BglBrick-standarden fastställdes för att lösa det första problemet 5 . Det skapar en 6-bp "GGATCT" ärr som producerar Gly-Ser och tillåter sammansmältning av flera proteiner eller proteindomäner. IBrick utvecklades för att hantera det andra problemet 6 . Det använder homing endonukleaser (HEs) som känner igen långa DNA-sekvenser. Eftersom HE-igenkänningsställena sällan existerar i naturliga DNA-sekvenser kan iBrick-standarden användas för direkt konstruktion av iBrick-delar utan att modifiera deras DNA-sekvenser. Men iBrick-standarden lämnar en 21 bp ärr mellan DNA-delarna, vilket kan vara orsaken till dess impopularitet.
Under de senaste åren har de grupperade regelbundna mellanrummen korta palindroma upprepningar (CRISPR) systemet har utvecklats snabbt 7 , 8 . Bland de CRISPR-associerade (Cas) proteinerna används Cas9 endonukleas från Streptococcus pyogenes nu allmänt. Det introducerar för det mesta dubbelsträngade DNA-raster (DSB) med trubbiga ändar 9 .
År 2015 kände Zhang och kollegor för första gången Cpf1 (CRISPR från Prevotella och Francisella 1). Det hör till klass 2 typ V CRISPR-Cas-systemet och är ett CRISRP RNA (crRNA) -guided endonukleas 10 . Till skillnad från Cas9 introducerar Cpf1 en DSB med ett 4 eller 5 nt 5 'överhang 10 . Baserat på denna egenskap användes Cpf1 för att utveckla en DNA-monteringsstandard, C-Brick 4 . På en C-Brick-standardvektor flankerar fyra Cpfl-målställen av prefixat T1 / T2 och suffix T3 / T4 de biologiska delarna; Detta liknar BioBrick-standarden. Som klyvning av T2- och T3-sidor pLeder till komplementära klibbiga ändar, är det möjligt att utföra det iterativa sammansättningen av DNA-delar medan man genererar ett "GGATCC" ärr mellan delarna. C-Brick-standarden har framförallt två huvudfördelar: erkänner långa målsekvenser och lämnar korta ärr. Den 6 bp "GGATCC" ärr som alstras av C-Brick kodar för Gly-Ser, vilket möjliggör konstruktion av fusionsproteiner. Dessutom är C-Brick-standarden också delvis kompatibel med BglBrick- och BioBrick-standarderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av crRNA
- Framställning av crRNA-mallar
- Resuspendera individuella oligonukleotider ( Tabell 1 ) i RNas-fritt vatten till en koncentration av 10 | im.
- Tillsätt 22,5 μL toppsträngig oligonukleotid (T7-F i Tabell 1 ), 22,5 μL bottensträngs oligonukleotid ( Tabell 1 ) och 5 | il 10x glödgningsbuffert till ett 0,2 ml PCR-rör. Se till att den totala volymen är 50 μl.
OBS: Sex olika oligonukleotider med bottensträng är visade i Tabell 1 , vilka var och en skulle vara individuellt parade med toppsträngen T7-F. De små bokstäverna i Tabell 1 representerar sekvensen som ska transkriberas i styrsekvensen för crRNA. 10x Taq PCR-buffert kan användas istället för 10x glödgningsbufferten. - Placera PCR-röret i en termocykler.
- Kör härdningsprogrammet: initial denaturering vid 95 ° C för5 min och sedan en nedkylning från 95-20 ° C, med en 1 ° C minskning per minut på termocyklern.
OBS! Använd proverna omedelbart för steg 1.2.1.
- Transkription och rening av crRNA
- Tillsätt 38 μL RNas-fritt vatten, 8 | il av mallen från steg 1.1.4, 20 | il 5x T7 transkriptionsbuffert, 20 pl NTP-blandning (10 | im), 4 | il rekombinant RNasinhibitor (RRI) och 10 Μl T7 RNA-polymeras till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Se till att den totala volymen är 100 μL.
- Sätt mikrocentrifugröret i ett 37 ° C vattenbad över natten (i ca 16 h).
- Använd en RNA-rengöring och koncentrationssats för att rena det transkriberade RNA; Följ tillverkarens protokoll.
- Kvantifiera RNA: erna med UV-Vis-spektrofotometrar och späd RNA till en koncentration av 10 ^ M. Använd proverna omedelbart eller förvara dem vid -80 ° C.
OBS: CrRNA-sekvensenS anges i tabell 2 .
2. Konstruktion av C-Brick-delar ( dvs. insättning av biologiska delar i en C-Brick Standard Vector)
OBS! Det här steget har tre delsteg. För korta biologiska delar ( t.ex. promotorer och terminatorer) är det bäst att använda den direkta PCR-metoden för att infoga de biologiska delarna i en C-Brick-standardvektor 4 . Hela vektorsekvensen visas i tilläggsdata, och prefix- och suffixsekvensen visas i figur 1 (steg 2.1 nedan). För biologiska delar som lätt kan erhållas via PCR ( t.ex. med mallar av genomisk DNA, plasmider eller de novo syntetiserade DNA-sekvenser) är det bäst att använda den sömlösa monteringsmetoden för att infoga de biologiska delarna i en C-Brick standardvektor (Steg 2.2 nedan). För de delar som erhållits från BioBrick och BglBrick standarder, begränsningEnzymmedierad digestion och T4-DNA-ligasförmedlad ligering kan användas för att införa de biologiska delarna i en C-Brick-standardvektor (steg 2.3 nedan).
- Konstruktion via direkt PCR-amplifiering
- Design och beställa oligonukleotider för PCR-amplifiering.
OBS: 5'-änden av oligonukleotiden innehåller sekvensen av DNA-delen och 3'-änden av oligonukleotiden innehåller vektorsekvensen ( dvs. "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" vid 3'-änden av framåtsträngen och "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" I omvänd sträng). Antingen ingen överhängning eller ett överhäng av 20-bp kan utformas vid 5'-änden av oligonukleotiden. Specifika exempel finns i en tidigare studie 4 . - Re-suspendera individuella oligonukleotider i ultra rent vatten till en koncentration av 10 | im.
- Ställ in PCR-reaktioner på is i ett 0,2 ml PCR-rör: tillsätt 18 μl ultra rent vatten, 25 μl 2x PCR-buffert, 1 jil dNTPs (10 jjM), 2,5 jil, varje av de främre och bakre primrarna (10 jjM) från steg 2.1.2, 0,5 jil C-Brick-standardvektor (50 ng) som en mall och 0,5 jil Av högfidelitets-DNA-polymeras. Se till att den totala volymen är 50 μl.
- Placera röret direkt i en termocykler och starta termocyklerprogrammet. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Termocyklerprogram: en cykel i 3 minuter vid 98 ° C; Trettio cykler under 10 s vid 98 ° C, 20 s vid 55 ° C och 2 min vid 72 ° C; Och en cykel i 10 minuter vid 72 ° C. Håll provet vid 16 ° C.
- Tillsätt 9 μl av blandningen från steg 2.1.4 till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 μl Dpnl och inkubera i 1 h i ett 37 ° C vattenbad.
OBS! Om primrarna inte har några överlappande sekvenser, tillsätt 0,5 | il T4 polynukleotidkinas (PNK) och 0,5 | il T4 DNA ligas och inkubera iEtt 22 ° C vattenbad under 1 timme. Annars om primrarna innehåller en överlappande sekvens av 20 nt, omvandlar de Dpnl-behandlade produkterna direkt till E. coli (DH10B) -kompetenta celler (steg 2.4). Den linjäriserade PCR-produkten kommer att cirkuläriseras genom rekombinationssystemet i värden. - Använd proverna omedelbart eller förvara dem vid -20 ° C.
- Design och beställa oligonukleotider för PCR-amplifiering.
- Konstruktion via sömlös montering
- Design och beställa oligonukleotider för PCR-amplifiering.
OBS: 3'-änden av oligonukleotiden innehåller DNA-delens terminalsekvens och 5'-änden av oligonukleotiden innehåller terminalen för den linjäriserade C-Brick-standardvektor-sekvensen ( dvs. "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" för 5'- -änden av framåtsträngen och "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" för 5'-änden av den omvända strängen). Specifika exempel finns i en tidigare studie 4 . - Återuppta individenUal oligonukleotider i ultrahurt vatten till en koncentration av 10 | im.
- Ställ in PCR-reaktioner på is i ett 0,2 ml PCR-rör: tillsätt 18 μl ultrahelt vatten, 25 μl 2x PCR-buffert, 1 μl dNTPs (10 μM), 2,5 μl vardera av de främre och bakre primrarna (10 μM ) Från steg 2.2.2, 0,5 jil mall (20-500 ng) och 0,5 jil högfidelitets DNA-polymeras. Se till att den totala volymen är 50 μl.
- Placera röret direkt i termocyklern och kör termocyklerprogrammet. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
OBSERVERA: Sätt termocyklerprogrammet i: en cykel i 3 minuter vid 98 ° C; 30 cykler under 10 s vid 98 ° C, 20 s vid 55 ° C (enligt primerens glödgningstemperatur) och 1 min (enligt längden av de biologiska delarna) vid 72 ° C; Och en cykel i 10 minuter vid 72 ° C. Håll provet vid 16 ° C. - Rengör PCR-produkten med en PCR-rengöringssystemTem kit; Följ tillverkarens protokoll.
- Digestera C-Brick-standardvektorn med BamHI: tillsätt 34 μL ultrahelt vatten, 10 pl plasmid (1 μg), 5 | il 10x buffert och 1 | il BamHI till mikrocentrifugröret. Inkubera i upp till 2 timmar vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Rengör ovanstående produkt med hjälp av ett system för rengöring av gel Följ tillverkarens protokoll.
- Tillsätt 2 μL linjäriserad vektor (50 ng) från steg 2.2.7, 5 μl fragment (200 ng) från steg 2.2.4, 2 μl 5x sömlös monteringsbuffert och 1 μl sömlöst monteringsenzym från en sömlös sammansättningssats Till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Säkerställ att den totala volymen är 10 | il.
- Placera detta i ett 37 ° C vattenbad i 30 minuter. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Design och beställa oligonukleotider för PCR-amplifiering.
- Konstruktion via restriktionsenzymmedierad digestion och T4-DNA-ligasförmedlad ligering.
NOTERA: För de delar som erhållits från BioBrick (steg 2.3.4-2.3.7) och BglBrick (steg 2.3.1-2.3.3), kan restriktionsenzymmedierad digestion och T4-DNA-ligasförmedlad ligering användas för att införa Biologiska delar i en C-Brick-standardvektor.- Digestera BglBrick-standarddelarna med BamHI och BglII: tillsätt 34 μL ultrahaltigt vatten, 10 | il plasmid (2 μg), 5 | il 10x buffert 3, 0,5 | il BamHI och 0,5 | il BglII till mikrocentrifugröret. Inkubera i 2 h i ett 37 ° C vattenbad.
- Kör en 1% agarosgelelektrofores och rena fragmentet med hjälp av ett system för rengöring av gel.
- Ligera fragmentet och C-Brick-standardvektorn: tillsätt 2 μL linjäriserad vektor (50 ng) från steg 2.1.12 och 6 μl fragment (200 ng) från steg 2.3.3 till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 μl 10 x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μl T4-DNA-ligas. Inkubera i 2 timmar vid 22 ° C. Använd proverna omedelbart eller frittE och förvara dem vid -20 ° C.
- Uppdela BioBrick-standarddelarna med XbaI och SpeI: tillsätt 34 μL ultrahaltigt vatten, 10 μl plasmid (2 μg), 5 μl 10x buffert, 0,5 μl Xbal och 0,5 μl SpeI till mikrocentrifugröret. Inkubera i 2 h i ett 37 ° C vattenbad.
- Digestera C-Brick-standardvektorn med Xbal och SpeI: tillsätt 34 μL ultrahaltigt vatten, 10 | il plasmid (1 | ig), 5 | il 10x buffert, 0,5 | il Xbal och 0,5 | il SpeI till mikrocentrifugröret . Inkubera i 2 h i ett 37 ° C vattenbad.
- Kör en 1% agarosgelelektrofores och rena fragmentet från steg 2.3.4 och den linjäriserade vektorn från steg 2.3.5 med ett system för gelupprensning Följer tillverkarens protokoll.
- Ligera fragmentet och C-Brick-vektorn: sätt 2 μL linjäriserad vektor (50 ng) från steg 2.3.5 och 6 μl fragment (200 ng) från steg 2.3.4 till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. A.dD 1 xl av 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 xl T4-DNA-ligas. Inkubera i 2 timmar vid 22 ° C. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Tillsätt 10 μL av produkterna från steg 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 eller 2.3.7 för kemisk omvandling till de kompetenta cellerna i E. coli (DH10B).
- Pick up flera kloner till ett 5 ml flytande Luria-Bertani (LB) -rör och inkubera vid 37 ° C på en skakare (220 rpm) över natten.
- Extrakt plasmiden med användning av ett plasmidpreparat kit; Följ tillverkarens protokoll.
- Identifiera de korrekta klonerna genom Sanger-sekvensering 11 .
3. C-Brick Assembly ( Figur 2 )
- Digestion av C-Brick-vektorn med Cpf1
- Tillsätt 22,5 μL RNas-fritt vatten, 4 μl 10x Cpfl-buffert, 10 | il av plasmiden från steg 2.6 (1 | ig), 0,5 | il RRI och 1# 181; L av Cpfl (5 | im) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Cpf1 kan köpas kommersiellt eller renas enligt protokollet i en tidigare studie 4 . - För att införa ett främmande DNA-fragment i Tl- och T2-ställena, tillsätt 1 pl CrRNA-T2 (10 | im) och inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C under 30 minuter. A dd 1 ul crRNA-Ti (10 | im) och Cpfl (5 | im) i ytterligare 30 min.
OBS: Alternativt, för att införa ett främmande DNA-fragment i T3- och T4-ställena, tillsätt 1 | j, l crRNA-T3 (10 | im) och inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C i 30 min. Tillsätt 1 μl crRNA-T4 (10 μM) under ytterligare 30 minuter. - Tillsätt 1 μl termosensitivt alkaliskt fosfatas och inkubera röret i ett 37 ° C vattenbad under ytterligare 1 timme.
- Kör en agarosgelelektrofores och rena vektorn med hjälp av ett system för rengöring av gel. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Tillsätt 21,5 μL RNas-fritt vatten, 4 μl 10x Cpfl-buffert, 10 | il plasmid från steg 2.6 (2 | ig), 0,5 | il RRI och 2 | il Cpfl (5 | im) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- För att införa ett främmande DNA-fragment i T1- och T2-ställena, tillsätt 1 | j, l crRNA-T1 (10 | im) och 1 | j, l crRNA-T3 (10 | im) och inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C under 2 timmar.
OBS: Alternativt sätt 1 μl crRNA-T2 (10 | im) och 1 | il CrRNA-T4 (10 | im) och inkubera i ett vattenbad vid 37 ° C under 2 timmar. - Kör en agarosgelelektrofores och rena fragmentet med hjälp av ett system för rengöring av gel. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Tillsätt 22,5 μL RNas-fritt vatten, 4 μl 10x Cpfl-buffert, 10 | il av plasmiden från steg 2.6 (1 | ig), 0,5 | il RRI och 1# 181; L av Cpfl (5 | im) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- C-Brick-montering och ytterligare verifikation
- Ligera det främmande DNA-fragmentet och C-Brick-vektorn: tillsätt 2 pl av den linjäriserade vektorn (50 ng) från steg 3.1.4 och 6 | il av DNA-fragmentet (200 ng) från steg 3.2.3 till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 μl 10x T4 DNA-ligasbuffert och 1 μl T4-DNA-ligas. Inkubera i 2 timmar vid 22 ° C. Använd proverna omedelbart eller frys och förvara dem vid -20 ° C.
- Tillsätt 10 μl av ligeringsprodukterna (steg 3.3.1) för kemisk transformation i E. coli (DH10B) -kompetenta celler.
- Tillsätt flera kloner till ett 5 ml flytande LB-rör och inkubera över natten på en skakan vid 220 rpm och 37 ° C.
- Extrakt plasmiden med användning av ett plasmidpreparat kit; Följ tillverkarens protokoll.
- Identifiera korrekta kloner genom Sanger-sekvensering 11 .
- Utför en ny omgång C-Brick-montering. Korrekta kloner från steg 3.3.4 kan användas som en ny C-Brick-vektor eller DNA-del för ytterligare iterativ C-Brick-montering, enligt samma protokoll från steg 3.1-3.3.
OBS: T2 'och T3' sItes är utformade som säkerhetskopiering av T2 och T3 platser ( Figur 1a ). För plasmider erhållna från steg 2.3.7 kan endast T2 'och T3 användas för C-Brick-standardmonteringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll demonstrerade montering av tre kromoproteinkassetter (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) och amilGFP (BBa_K592010)). För det första klonades de kodande sekvenserna för de tre ovannämnda generna och terminatorerna individuellt i en C-Brick-standardvektor. Korta DNA-delar, promotor och terminator infördes i C-Brick-vektorn genom PCR-amplifiering med användning av primrar innehållande de korta DNA-delarna på 5'-terminalen. Detta följdes av själv-ligeringsmetoden. Tre kromoproteinkodande sekvenser syntetiserades först de novo och klonades därefter i C-Brick-standardvektorn genom sömlös montering. Primerna beskrivs i en tidigare studie 4 .
Därefter ligerades cjBlue, eforRed och amilGFP-sekvenser med terminator- och promotorsekvenser i samma procedur som visas i"Xfig"> Figur 2. Korrekta konstruktioner transformerades till E. coli , vilket demonstrerade vackra färger ( Figur 3a ). Därefter monterades två färguttryckskassetter vidare med C-Brick-standarden för att skapa fler färger ( dvs den röda färgen från amilGFP plus eforRed, den gröna färgen från amilGFP plus cjBlue och den ljuslila färgen från eforRed plus cjBlue; Figur 3b ).
Figur 1: C-Brick Standard Interface DNA-sekvens och C-Brick Standard Vector. ( A ) Sekvensen för C-tegelstandardgränssnittet Tl, T2, T3, T4, T2 ', T3' kan igenkännas av dess motsvarande crRNA och införes sedan i ett 5'-överhang med användning av Cpfl. Klyvningen av T2 och T3 (eller T2 'och T3') ställen ger komplementär överhänger. Med de åtta begränsningsplatserna utformade är C-Brick-standarden delvis kompatibel med BioBrick och BglBrick. ( B ) Plasmidkarta för C-Brick-standardvektorn med restriktionsmältningsställen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Arbetsflödet för DNA-montering i C-Brick-standarden. Cpfl-digererade T2- och T3-målställen producerar komplementära sammanhängande ändar av "GGATC" respektive "GATCC", som kan ligeras för att generera en kort "GGATCC" ärr. Detaljerade förfaranden finns i steg 3 i texten ("C-Brick assembly"). Vänligen klicka här till Se en större version av denna figur.
Figur 3: Färgrika bakteriepigment framställda av E. coli Harbour Constructs monterade i C-Brick Standard. ( A ) Tre kromoproteiner uttrycktes i E. coli odlade på en platta. Bakterier utan kromoproteiner (negativ kontroll) visas på den 4 : e plåten. ( B ) Tre kromoproteiner och tre sammansatta dubbla kromoproteiner uttrycktes i E. coli odlade i flytande LB-medium. Från 1 till 6 uttryckte konstrukten eforRed (1), amilGFP (2), cjBlue (3), amilGFP plus eforRed (4), amilGFP plus cjBlue (5) och eforRed plus cjBlue (6). De färgglada bakterierna på en enda platta eller i ett enda mikrocentrifugrör odlades från en enda sekvens verifierad klon. Les / ftp_upload / 55775 / 55775fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| namn | sekvens | ||
| T7-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGG | ||
| T7-T1-R | gaattcagtagaaagttgcgataaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2'-R | ctagagtaaagcttgaattcagtaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T2-R | ggatcctttctcctctttctagagATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3-R | ggatccactagtctctagctcgaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T3'-R | ctctagctcgagaaattcaaggaATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
| T7-T4-R | ttcaagggaaactgcagctagctATCTACAACAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC | ||
Tabell 1: Oligos för framställning av crRNA-transkriptionsmallar som användes i denna studie. T7-F var den övre strängoligonukleotiden, och de andra var bottensträngs oligonukleotiderna. De små bokstäverna i sekvensen transkriberas till styrsekvensen i crRNA.
| namn | RNA-sekvenser (5'-3 ') | ||
| crRNA-T1 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUUC | ||
| crRNA-T2 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUCUAGAAAGAGGAGAAAGGAUCC | ||
| crRNA-T3 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCGAGCUAGAGACUAGUGGAUCC | ||
| crRNA-T4 | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCUAGCUGCAGUUUCUCCUUGAA | ||
| crRNA-T2' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUACUGAAUUCAAGCUUUACUCUAG | ||
| crRNA-T3' | GGGAAUUUCUACUGUUGUAGAUUCCUUGAAUUUCUCGAGCUAGAG | ||
Tabell 2: De crRNA-sekvenser som användes i denna studie. CrRNA: erna framställdes genom in vitro- transkriptionen i steg 1 i texten ("Framställning av crRNA").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en procedur för DNA-monteringsstandarden C-Brick. Det viktigaste steget i detta protokoll är lineariseringen av C-Brick-standardvektorn; Ofullständig klyvning av vektorn kan på allvar påverka framgångsnivån. Dessutom, även om Cpfl huvudsakligen klibbar mål-DNA-sekvenser i "18-23" -klyvningsmönstret, detekterades också felaktig klyvning nära de två baserna 4 , vilket kan orsaka ett litet antal mutationer efter DNA-montering. Därför behövs Sanger-sekvensering för att verifiera den monterade konstruktionen.
Effektiviteten hos C-Brick-enheten är lägre än traditionella restriktionsenzym- och ligeringsmetoder som har beskrivits i en tidigare studie 4 . Den huvudsakliga orsaken som påverkar monteringseffektiviteten kan vara de felaktiga klyvningsegenskaperna hos Cpf1. I framtiden kan förbättringar av klyvningsnoggrannheten vara extremt användbara för standarden aNd utredas för närvarande.
C-Brick är också delvis kompatibel med BglBrick och BioBrick standarder. BglBrick-delar kan till exempel skäras med Bglll och BamHI och sätts sedan in i BamHI-stället i en C-Brick-standardvektor, som alstrar en C-Brick-del. Införingsriktningen för BglBrick-delen bör dock verifieras, och det skulle finnas ett "GGATCT" ärr efter montering. När en C-Brick-DNA-del erhålls från en BioBrick-del ( dvs med XbaI- och SpeI-digestion), kommer både T2- och T3-platser att förstöras och två backup-Cpf1-målsekvenser (T2 'och T3') kan användas.
Eftersom Cpfl-klyvningen kräver sgRNA, vilket är extremt känsligt för RNas, bör alla material vara RNasfria. För närvarande kan alla C-Brick-standardvektorer, RNas-fria Cpfl-nukleaser och crRNAs beställas kommersiellt 12 . Därför är förfarandena för C-Brick egentligen lika enkla som för BioTegelstandard.
Under de senaste åren har flera användbara DNA-monteringsmetoder utvecklats och används allmänt, inklusive Golden Gate Assembly 13 , Gibson Assembly 14 och andra 15 . Eftersom DNA-monteringsstandarder har potential att tillhandahålla kostnadseffektiv, pålitlig, hög genomströmning och automatiska sammansättningsreaktioner 5 kan standarder emellertid underlätta konstruktionen och testningen av nyutvecklade eller omkonstruerade gener, genetiska kretsar och banor 15 , 16 , 17 , speciellt inom området syntetisk biologi. Bland de nu publicerade DNA-monteringsstandarderna har C-Brick-standarden både uppenbara fördelar och nackdelar 4 ( dvs. ligeringseffektiviteten). Om ligeringseffektiviteten förbättras kan standarden vidtas i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Shanghai Tolo Biotech för deras tekniska hjälp under utvecklingen av C-Brick-standarden. Detta arbete stöddes av bidrag från det kinesiska vetenskapsakademiens strategiska prioriterade forskningsprogram (bidrag nr XDB19040200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
